پارکنسنز کی بیماری کے ایک ان وٹرو ماڈل میں بہتر درستگی اور کارکردگی کے ساتھ نیورائٹ ڈیجنریشن کی مقدار کا تعین حصہ 2

نتائج

PD سے وابستہ نیورائٹ انحطاط کے سیل کلچر ماڈل کا قیام

PD کے سیل کلچر ماڈل میں نیورائٹ انحطاط کی تحقیقات کے لیے ایک طریقہ تیار کرنے کے لیے، ہم نے مہذب LUHMES خلیات کا استعمال کیا، جو مشروط طور پر لافانی، انسانی میسینسفالک خلیوں کی آبادی ہے۔ تفریق پر، LUHMES خلیات پوسٹ مائٹوٹک بن جاتے ہیں، بالغ ڈوپامینرجک نیوران کی جین ایکسپریشن پروفائل خصوصیت کو اپناتے ہیں، اور نیورائٹس کے ساتھ ایک نیورونل مورفولوجی تیار کرتے ہیں جس کی لمبائی 500 ملی میٹر تک ہوتی ہے (تصویر 1A؛ Lotharius et al.، 2005؛ Scholz et al. ، 2011؛ ​​کریمر وغیرہ، 2021)۔

نیوروڈیجنریشن، ایک ایسی حالت جس میں عصبی خلیے بدل جاتے ہیں یا مر جاتے ہیں، یادداشت سے گہرا تعلق ہے۔ سیل کلچر ماڈلز میں، ہم نیوروڈیجنریشن کے اظہار کو کم کرنے کے لیے ثقافت کے حالات کو کنٹرول کر سکتے ہیں اور اس طرح میموری کی کارکردگی کو بہتر بنا سکتے ہیں۔

مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ اعصابی خلیوں کا ہومیوسٹاسس سیل کی بقا اور نظام کے کام میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔ ہم کلچر میڈیم میں غذائی اجزاء اور نمو کے عوامل جیسے عوامل کو کنٹرول کرکے خلیوں کے استحکام کو بہتر بنا سکتے ہیں۔ ایک ہی وقت میں، ماحول کی طرف سے خلیات کو پریشان اور نقصان پہنچانے سے روکنے کے لئے ثقافتی ماحول کی صفائی اور درجہ حرارت کے کنٹرول کو برقرار رکھنے پر توجہ دینا.

اس کے علاوہ، سیل کلچر ماڈل میں، ہم نیوروموڈولیشن کے اظہار کو کم کرنے کے لیے خلیوں میں کچھ مرکبات یا دوائیں بھی لگا سکتے ہیں، اس طرح خلیوں کی بقا کی شرح اور یادداشت کی کارکردگی کو بہتر بنایا جا سکتا ہے۔ یہ تکنیک نیوروڈیجینریٹیو بیماریوں کے مطالعہ میں بھی بڑے پیمانے پر استعمال ہوتی ہے۔

مختصراً، نیوروڈیجنریشن کا سیل کے استحکام اور نظام کے کام پر ایک اہم اثر پڑتا ہے، اور سیل کلچر ٹیکنالوجی ایک اچھا ماڈل ریسرچ طریقہ ہے، جو نیوروڈیجنریشن اور میموری کے درمیان تعلق پر گہرائی سے تحقیق اور تحقیق کر سکتا ہے۔ ہم خلیے کی بقا اور یادداشت کی کارکردگی کو بہتر بنانے اور نیوروڈیجینریٹیو بیماریوں کے مطالعہ کے لیے ایک زیادہ جامع بنیاد فراہم کرنے کے لیے ماحولیاتی کنٹرول کو فروغ دینے، خلیات میں ادویات وغیرہ کے انجیکشن کے ذریعے نیوروموڈولیشن کی کارکردگی کو کم کر سکتے ہیں۔ یہ دیکھا جا سکتا ہے کہ ہمیں اپنی یادداشت کو بہتر بنانے کی ضرورت ہے۔ Cistanche ہماری یادداشت کو نمایاں طور پر بہتر بنا سکتا ہے، کیونکہ Cistanche نیورو ٹرانسمیٹر کے توازن کو بھی کنٹرول کر سکتا ہے، جیسے کہ acetylcholine کی سطح میں اضافہ اور ترقی کے عوامل، جو یادداشت اور سیکھنے کے لیے بہت اہم ہیں۔ اس کے علاوہ، گوشت خون کے بہاؤ کو بھی بہتر بنا سکتا ہے اور آکسیجن کی ترسیل کو فروغ دے سکتا ہے، جو اس بات کو یقینی بنا سکتا ہے کہ دماغ کو مناسب غذائیت اور توانائی ملے، اس طرح دماغ کی طاقت اور برداشت کو بہتر بنایا جا سکتا ہے۔

یادداشت کو بہتر بنانے کے لیے سپلیمنٹس جانیں پر کلک کریں۔

پلاسٹک کے مقابلے شیشے کی اعلیٰ نظری خصوصیات کی وجہ سے، ثقافتیں آٹھ میڈیا چیمبروں پر مشتمل شیشے کی سلائیڈوں پر قائم کی گئیں۔ پچھلی رپورٹس کی بنیاد پر (لوتھریئس ایٹ ال۔، 2005؛ سکولز ایٹ ال۔، 2011؛ ​​کرووسکا ایٹ ال۔، 2014)، ہم نے ابتدائی طور پر پی ایل او اور فائبرونیکٹین کے ساتھ لیپت چیمبر سلائیڈز پر ثقافتیں قائم کرنے کی کوشش کی۔ تاہم، ایسی ثقافتوں میں آسنجن خسارے اور کم عملداری کی نمائش ہوتی ہے۔ نتیجے کے طور پر، ہم نے جانچ کیا کہ آیا اضافی سبسٹریٹس کے ساتھ کوٹنگ شیشے کی سطحوں پر قائم LUHMES سیل ثقافتوں کی عملداری کو بہتر بنائے گی۔

LUHMES سیل کلچرز ان سلائیڈوں پر قائم کی گئی تھیں جو یا تو غیر کوٹیڈ تھیں یا PLO اور fibronectin، PDL اور laminin، یا چاروں سبسٹریٹس کے امتزاج کے ساتھ لیپت تھیں۔ فلوروسینس مائیکروسکوپی کے ذریعے قابل عمل نیوکلی کے تجزیے سے یہ بات سامنے آئی کہ سلائیڈ کوٹنگ نے ثقافتوں کی عملداری کو نمایاں طور پر متاثر کیا [Friedman x2 (3)=18, p, 0.0001]، پوسٹ ہاک ایک سے زیادہ موازنہ کے تجزیوں کے ساتھ اس سلائیڈ کو ظاہر کرتا ہے۔ مذکورہ بالا چاروں ذیلی ذخیروں کے امتزاج کے ساتھ لیپت سے قابل عمل خلیوں کی نمایاں طور پر زیادہ شرح حاصل ہوتی ہے جب صرف PLO اور fibronectin کے ساتھ لیپت والی سلائیڈوں کے ساتھ موازنہ کیا جاتا ہے (p= 0.0437؛ تصویر 1B، C)۔

شیشے کی سلائیڈوں پر LUHMES خلیوں کی ثقافت کے لیے بہترین کوٹنگ سبسٹریٹس کی نشاندہی کرنے کے بعد، ہم نے نیورائٹ انحطاط کی پیمائش کے لیے ثقافتوں کی مناسبیت پر سیل کثافت کے اثرات کا جائزہ لیا۔ LUHMES خلیات کو ایک تفریق میڈیم میں کلچر کیا گیا تھا جس میں 57,500 سیل فی کنواں، 115،000 سیل فی کنواں، یا 230،000 سیل فی کنواں، اور ان کے فرق کے پانچویں دن، خلیات 4٪ پی ایف اے کے ساتھ طے کیا گیا تھا اور فیز کنٹراسٹ مائکروسکوپی کے ذریعہ امیج کیا گیا تھا۔

فی کنواں 57,500 خلیات کی کثافت کے نتیجے میں ناقص نیٹ ورک والے نیورائٹس اور بے قاعدہ نیورائٹ مورفولوجی والی ثقافتیں ہوئیں، جبکہ 230،000 سیلز کی پلیٹنگ کثافت کے ساتھ قائم ہونے والی ثقافتیں، اگرچہ قابل عمل ہیں، نیورائٹ کی کثافت درست نیورائٹ پیمائش کے لیے بہت زیادہ ہے۔ درمیانی خلیے کی کثافت 115،000 خلیات فی اچھی طرح سے فراہم کردہ اعلی قابل عمل اور اچھی طرح سے الگ کیے گئے ایکسون ٹریکٹس نیورائٹ انحطاط کی درست پیمائش کے لیے موزوں ہیں (تصویر 1D)۔

وٹرو میں PD سے وابستہ نیورائٹ انحطاط کو ماڈل کرنے کے لیے، ہم نے مختلف LUHMES خلیات کو 6-OHDA سے بے نقاب کیا، ایک وسیع پیمانے پر استعمال ہونے والا نیوروٹوکسین جو آکسیڈیٹیو تناؤ اور کیٹیکولامینرجک نیوران کے انحطاط کو فروغ دیتا ہے (Bové and Perier, 2012)۔ مختلف LUHMES خلیوں کی 6-OHDA میں نمائش نے نیورائٹ انحطاط میں خوراک پر منحصر اضافے کو فروغ دیا، جس میں 5.0 mM 6-OHDA اور 7.5 mM 6-OHDA بالترتیب اعتدال پسند اور شدید نیورائٹ انحطاط پیدا کرتا ہے (تصویر 1) 2F)۔ 6-OHDA کے سامنے آنے والے LUHMES خلیات کی ثقافتوں میں نیورائٹ انحطاط کی مقدار معلوم کرنے کے لیے، ہم نے ایک وسیع پیمانے پر حوالہ دیا گیا طریقہ استعمال کیا جس میں ثقافتوں کی فیز کنٹراسٹ امیجز کو بائنرائز کیا جاتا ہے، امیجز میں موجود سیل باڈیز کو ڈیجیٹل طور پر ہٹا دیا جاتا ہے، اور پارٹیکل اینالائزر الگورتھم امیج جے کا اطلاق نیورائٹ کے ٹکڑوں کے رقبے کی پیمائش کے لیے کیا جاتا ہے۔ DI (تصویر 2A–E؛ Sasaki et al.، 2009؛ Kraemer et al.، 2014؛ Di Stefano et al.، 2015؛ Hill et al. .، 2018؛ Geisler et al.، 2019)۔

جیسا کہ توقع کی گئی ہے، 6- OHDA میں مختلف LUHMES خلیوں کی نمائش DI (F(3,24)= 119.8, p=0.0001, R{ میں خوراک پر منحصر اضافے کا سبب بنی۔ {8}}.9374؛ تصویر 2G)۔ تاہم، 6-OHDA کے سامنے آنے والے خلیوں کے تجزیوں کے دوران، ہم نے کئی ایسے مسائل کا مشاہدہ کیا جو DI پیمائش کی درستگی اور کارکردگی پر منفی اثر ڈالتے ہیں۔ اس طرح، ہم نے DI پیمائشوں کو انجام دینے کے لیے اس عام طریقہ کو بہتر بنانے کی کوشش کی، جسے ہم اب سے روایتی DI طریقہ کے طور پر حوالہ دیتے ہیں، تاکہ نیورائٹ فریگمنٹیشن کی زیادہ موثر پیمائش کی سہولت فراہم کرنے والا پروٹوکول تیار کیا جا سکے۔

مائکروگراف بائنرائزیشن سے وابستہ مصنوعی ٹکڑے کو کم کرنا

روایتی DI طریقہ استعمال کرتے ہوئے، ہم نے اکثر ایک ایسے مسئلے کا مشاہدہ کیا جس میں فیز کنٹراسٹ امیجز میں برقرار نیورائٹس اپنی متعلقہ بائنرائزڈ امیج (تصویر 3A) میں بکھرے ہوئے دکھائی دیتے ہیں۔ اس مصنوعی ٹکڑے نے بنیادی طور پر کم اہمیت کے ساتھ نیورائٹس کو متاثر کیا۔ اس طرح، ہم نے چھان بین کی کہ آیا اس مسئلے کو ایسے طریقہ کار سے کم کیا جا سکتا ہے جو تصویر کے تضاد کو بڑھاتے ہیں۔ تصویر کے برعکس کو بہتر بنانے کے لیے، ہم نے سب سے پہلے مختلف قسم کی روشنی کی شدت کا استعمال کرتے ہوئے نیورائٹس کی تصاویر حاصل کیں تاکہ تصویر کی چمک کی سطح کا تعین کیا جا سکے جو زیادہ سے زیادہ کنٹراسٹ پیدا کرے گی۔

زیادہ سے زیادہ روشنی کی شدت کے ساتھ کیپچر کی گئی تصاویر کو پھر بالترتیب 90 اور 205 کی کم سے کم اور زیادہ سے زیادہ شدت والی اقدار کے ساتھ LUT لگانے کے لیے ImageJ کا استعمال کرتے ہوئے مزید کنٹراسٹ بڑھانے کا نشانہ بنایا گیا۔ ان کنٹراسٹ اضافہ کو شامل کرنے سے فیز کنٹراسٹ امیجز (تصویر 3B) سے پیدا ہونے والی بائنرائزڈ امیجز میں نیورائٹس کی معتدل حد تک درست نمائندگی ہوتی ہے۔ بہر حال، صحت مند نیورائٹس کی بائنرائزڈ امیجز کے مقداری تجزیے سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ اس کے برعکس اضافہ مصنوعی ٹکڑوں میں نمایاں کمی نہیں کرتا ہے (p=0.9999؛ تصویر 3D)۔ اس طرح، ہم نے اگلی تفتیش کی کہ آیا امیونو فلوروسینس امیجنگ کا استعمال اعلیٰ کنٹراسٹ کے ساتھ امیجز تیار کرے گا اور اس طرح کم مصنوعی ٹکڑوں کے ساتھ زیادہ درست بائنرائزڈ نیورائٹ امیجز کی تیاری میں سہولت فراہم کرے گا۔

تصویر 2 میں بیان کردہ سلائیڈز، جس میں 6- OHDA کے مختلف ارتکاز کے سامنے آنے والے فکسڈ LUHMES خلیات شامل ہیں، سائٹوسکیلیٹل پروٹین b III-tubulin کے لیے امیونوسٹین کیے گئے تھے، فلوروسینس مائیکروسکوپی کا استعمال کرتے ہوئے تصویر کشی کی گئی تھی، اور ایک نابینا تفتیش کار کے ذریعے تجزیہ کیا گیا تھا۔ 3C)۔ فلوروسینس مائیکرو گرافس اور متعلقہ فیز کنٹراسٹ مائیکروگرافس سے حاصل کی گئی بائنرائزڈ امیجز کے مقداری تجزیے سے یہ بات سامنے آئی کہ مائکروسکوپی کی قسم مصنوعی ٹکڑوں کی سطح کو متاثر کرتی ہے [Friedman x2 (3)=15.44, p, 0.0001] . خاص طور پر، فلوروسینس مائیکرو گرافس نے فیز کنٹراسٹ مائیکروگرافس (p=0.0016؛ تصویر 3D) کے مقابلے میں نمایاں طور پر کم مصنوعی ٹکڑے کے ساتھ بائنرائزڈ تصاویر تیار کیں۔

نتیجے کے طور پر، صحت مند ثقافتوں کی تصاویر نے نمایاں طور پر کم DI اسکور حاصل کیے جب فیز کنٹراسٹ مائیکروگرافس (F(1,8)= 131.4، p=0 کے بجائے فلوروسینس مائیکرو گراف استعمال کیے گئے۔{12} }001، R2=0.1442؛ تصویر 3E)۔ مزید برآں، ایک قابل ذکر مجموعی رجحان یہ ہے کہ صحت مند (گاڑیوں سے علاج شدہ) ثقافتوں اور نیورائٹ انحطاط (5.0 یا 7.5 mM 6-OHDA-علاج شدہ) کی نمائش کرنے والی ثقافتوں سے وابستہ DI اقدار کے درمیان تہہ کی تبدیلی زیادہ تھی جب فلوروسینس مائیکروگرافس کا استعمال کرتے ہوئے پیمائش کی گئی۔ فیز کنٹراسٹ مائیکروگرافس (تصویر 3E) سے حاصل ہونے کے مقابلے میں۔ یہ اعتدال پسند نیورائٹ انحطاط (5 mM 6-OHDA کی نمائش سے متاثر) والی ثقافتوں کے فلوروسینس مائیکرو گرافس کے باوجود ہوا ہے جس میں مصنوعی ٹکڑوں میں کمی کی وجہ سے متعلقہ مرحلے کی تصاویر کے مقابلے میں نمایاں طور پر کم DI اسکور ہیں (p=0.0001 ، d=0.6312)۔

بکھرے ہوئے نیورائٹ اور کل نیورائٹ کا پتہ لگانے کے لیے پیرامیٹرز کو بہتر بنانا
DI پیمائش کرنے کے روایتی طریقہ میں نیورائٹ کے ٹکڑوں کا پتہ لگانے کے لیے 20 10،000 پکسلز کے سائز کے پیرامیٹرز کے ساتھ ImageJ کے لیے تجزیہ پارٹیکلز پلگ ان کا استعمال شامل ہے۔ تاہم، ہم نے مشاہدہ کیا کہ نیورائٹ کے ٹکڑوں کا ایک بڑا حصہ ذرہ تجزیہ کار کے ذریعہ ان وسیع پیمانے پر حوالہ کردہ پیرامیٹرز (شن ایٹ ال۔، 2012؛ ڈی اسٹیفانو ایٹ ال۔، 2015؛ ساساکی ایٹ ال۔، 2016؛ لوریٹو ایٹ ال۔ ، 2020؛ شن اور چو، 2020) LUHMES خلیات کے فیز کنٹراسٹ مائیکرو گرافس میں نیورائٹ انحطاط کی پیمائش کرنے کے لیے جو کہ 6-OHDA کے سامنے ہے، جیسا کہ شکل 2 میں بیان کیا گیا ہے۔

اس طرح، ہم نے نیورائٹ کے ٹکڑوں کی شناخت کے لیے زیادہ سے زیادہ پیرامیٹرز کا تعین کرنے کے لیے ذرہ کی کھوج کے لیے مختلف کم از کم سائز کی حدود کا استعمال کرتے ہوئے اس ڈیٹاسیٹ سے تصاویر کا دوبارہ تجزیہ کیا۔ فیز کنٹراسٹ مائیکروگرافس سے پیدا ہونے والی بائنرائزڈ امیجز کے گتاتمک جائزے سے، 5–10 کے سائز کے پیرامیٹرز،000 پکسلز نے نیورائٹ کے ٹکڑوں کی کھوج میں اضافہ کیا، لیکن یہ پس منظر کے شور، تصویری نمونے، یا دیگر چھوٹی چھوٹی چیزوں کی غلط شناخت سے بھی وابستہ تھے۔ نیورائٹ کے ٹکڑوں کے طور پر غیر نیورائٹ مواد۔ 20–10 کے بڑے پیمانے پر استعمال ہونے والے پیرامیٹرز کے مقابلے،000 پکسلز، تاہم، 10–10،000 پکسلز کے پیرامیٹرز نے جھوٹے مثبتات میں نمایاں طور پر بڑے اضافے کے بغیر نیورائٹ کے ٹکڑوں کی کھوج کو بڑھایا (تصویر 4A ، بائیں).

اسی طرح کے تجزیے LUHMES خلیوں کے فلوروسینس مائیکروگرافس سے حاصل کردہ بائنرائزڈ امیجز کے ساتھ بھی کیے گئے جو b III-tubulin کے لیے امیونو لیبل لگائے گئے تھے۔ 5–10،000 پکسلز کے پارٹیکل اینالائزر سائز کے پیرامیٹرز نے نیورائٹ کے ٹکڑوں کی سب سے زیادہ حساس شناخت کی سہولت فراہم کی اور چونکہ فلوروسینس مائیکرو گرافس میں کم چھوٹے ملبے کو نمایاں کیا گیا تھا، اس طرح کے پیرامیٹرز نے نیورائٹ کے ٹکڑوں کے طور پر غیر نیورائٹ مواد کی غلط شناخت میں نمایاں اضافہ نہیں کیا۔ (تصویر 4A، دائیں طرف)۔

DI پیمائش کرنے کا روایتی طریقہ، 20–10،000 پکسلز کے پارٹیکل اینالائزر سائز کے پیرامیٹرز کا استعمال کرتے ہوئے، نیورائٹ کے ٹکڑوں کی پیمائش سے 20 پکسلز سے چھوٹی اشیاء کو خارج کرتا ہے۔

تاہم، اس طرح کی چھوٹی اشیاء کو عام طور پر کل نیورائٹ ایریا کی پیمائش میں غلطی سے شامل کیا جاتا ہے، کیونکہ روایتی DI پیمائش کے طریقہ کار میں بائنرائزڈ امیجز میں تمام بلیک پکسلز کو جمع کرکے کل نیورائٹ ایریا کا حساب لگانا شامل ہوتا ہے۔ اس مسئلے پر قابو پانے کے لیے، ہم نے امیج جے کے لیے پارٹیکل ریموور پلگ ان کا استعمال کیا، جسے امیج جے ڈویلپر وین راسبینڈ نے لکھا ہے، بائنرائزڈ امیجز سے چھوٹی، غیر نیورائٹ اشیاء کو ہٹانے کے لیے۔ اس پلگ ان کا اطلاق LUHMES خلیوں کے فیز کنٹراسٹ مائیکروگرافس کا استعمال کرتے ہوئے DI پیمائش کرتے ہوئے 6-OHDA کے سامنے آیا، جیسا کہ شکل 2 میں بیان کیا گیا ہے، جس کے نتیجے میں نیوروٹوکسن کی نمائش کے تمام ارتکاز میں DI پیمائش میں نمایاں اضافہ ہوا (F(1) ,8)=83.43، p=0.0001، R2=0.0416)۔
مزید برآں، ایک اہم تعامل نے اشارہ کیا کہ ذرہ ہٹانے والے کے استعمال کی وجہ سے DI میں اضافہ زیادہ ارتکاز (F(1.881,15.05)=59.97, p=0.0001, R{ {8}}.0094؛ تصویر 4B، سی)۔ ہم نے فلوروسینس مائیکروسکوپی کے ذریعہ خلیوں کی انہی سلائیڈوں کی بھی تصویر کشی کی اور فلوروسینس مائیکرو گرافس سے حاصل کردہ DI پیمائش پر چھوٹے ذرات کو ہٹانے کے اثرات کا اندازہ کیا۔ اگرچہ چھوٹے ذرات کو ہٹانا DI اقدار فراہم کرتا ہے جو نظریاتی طور پر زیادہ درست ہیں، اوسطا اس طرح کی قدریں پارٹیکل ریموور پلگ ان کے استعمال کے بغیر حاصل کی گئی اقدار سے نمایاں طور پر مختلف نہیں تھیں جب فلوروسینس مائیکروگرافس (F(1,8)=2 کا استعمال کرتے ہوئے پیمائش کی جاتی ہے۔ 613، p=0.1446، R2=0.0013؛ تصویر 4D)۔

فلوروسینس مائیکروگرافس سے DI پیمائش کا آٹومیشن

روایتی طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے DI پیمائشوں کی کارکردگی کے لیے تکلیف دہ اور وقت طلب امیج پروسیسنگ، انفرادی سیل باڈیز کو ڈیجیٹل طور پر ہٹانے کے لیے فری ہینڈ ٹول کا استعمال اور ہر تصویر سے ٹوٹے ہوئے نیورائٹ اور کل نیورائٹ ایریاز کی پیمائش کی ضرورت ہوتی ہے۔ اس طرح، ہم نے ایک میکرو لکھ کر طریقہ کار کی کارکردگی کو بڑھانے کی کوشش کی جو DI تجزیہ کو مکمل طور پر خودکار کرتا ہے۔ خود کار طریقے سے سوما ہٹانے کے لیے، ANDI کے عنوان سے میکرو، سیل نیوکلی کی تصاویر کی بائنرائزیشن کو انجام دیتا ہے، جس پر نیوکلیئر سٹین DAPI کے ذریعے لیبل لگایا جاتا ہے، اس کے بعد بائنرائزڈ امیج میں ترمیم کی جاتی ہے تاکہ سوما کے پورے خطے کو گھیرنے کے لیے تھریشولڈ جوہری علاقوں کو بڑھایا جائے۔ بائنرائزڈ اور بڑھے ہوئے نیوکلی کے ساتھ اس طرح کی تصاویر کو پھر b III-tubulin کے لیے امیونو لیبل والے نیوران کے متعلقہ فلوروسینس مائیکرو گراف سے منہا کر دیا جاتا ہے، جس سے خصوصی طور پر نیورائٹس (تصویر 5A، B) کی خصوصیت والی تصویر تیار ہوتی ہے۔

نیوکلیائی سکڑاؤ یا نیوروڈیجنریشن سے وابستہ ٹکڑے ہونے کی وجہ سے متغیر جوہری سائز کو ایڈجسٹ کرنے کے لیے، نیوکلیائی کی بائنرائزڈ امیجز کو پھیلاؤ اور کٹاؤ کے امتزاج کے ذریعے بڑھایا جاتا ہے جو جوہری ٹکڑوں کو جوڑتا ہے اور بائنرائزڈ خطوں کو پھیلاتا ہے تاکہ مختلف خلیات کے سوماس سے بڑے علاقے پر قبضہ کر سکے۔ . خصوصی طور پر نیورائٹس پر مشتمل تصاویر کو پھر بائنرائز کیا جاتا ہے اور خودکار افعال کی ایک سیریز کے ذریعے DI تجزیہ کا نشانہ بنایا جاتا ہے (تصویر 5C، D)۔ تصاویر سے سوما ہٹانے کے ساتھ منسلک میکرو آپریشنز کی درستگی کا جائزہ لینے کے لیے، ہم نے امیج جے کے فری ہینڈ ٹول (جیسا کہ پہلے تصویر 4D میں دکھایا گیا ہے) کا استعمال کرتے ہوئے فلوروسینس مائیکرو گرافس سے سیل باڈیز کو دستی طور پر ہٹانے کے بعد حاصل ہونے والے DI اسکورز کا موازنہ DI سکور سے کیا۔ ANDI میکرو میں نمایاں کردہ سوما ہٹانے کے آپریشنز کا استعمال کرتے ہوئے سیل باڈی کو خود کار طریقے سے ہٹانے کے بعد ایک جیسی تصاویر کے تجزیوں سے تیار کیا گیا ہے۔ ہمارے تجزیوں سے یہ بات سامنے آئی ہے کہ خودکار سیل باڈی ریموول کا استعمال کرتے ہوئے شمار کیے گئے DI اسکورز دستی سوما ہٹانے (r(34)=0.980، p، 0.0001؛ تصویر 2 سے مشروط تصاویر سے حاصل کردہ DI پیمائشوں کے ساتھ تقریباً ایک جیسے ہیں۔ 5E)۔

تجزیوں کی درستگی کو بڑھانے کے لیے، ہم نے پہلے بیان کردہ کئی ایڈجسٹمنٹس کو شامل کیا جو DI پیمائش کو ANDI میں بڑھاتے ہیں۔ میکرو میں کنٹراسٹ اینہانسمنٹ آپریشنز، نیورائٹ امیجز سے نان نیورائٹ مادے اور نیوکلیائی امیجز سے نان نیوکلیئر مادے کو ہٹانے کے لیے پارٹیکل ریموور پلگ ان کا استعمال، اور 5–10 کے سائز کے پیرامیٹرز کا استعمال کرتے ہوئے نیورائٹ کے ٹکڑوں کا پتہ لگانا،000 تجزیہ پارٹیکلز پلگ ان کے لیے۔

ہم نے یہ قیاس کیا کہ، اجتماعی طور پر، فلوروسینس مائیکروسکوپی کا استعمال، کنٹراسٹ بڑھانے کے آپریشنز، پارٹیکل ریموور کے ساتھ چھوٹی اشیاء کو ہٹانا، اور پارٹیکلز کا پتہ لگانے کے لیے موزوں پیرامیٹرز نیورائٹ انحطاط کی زیادہ درست پیمائش میں معاون ثابت ہوں گے۔ اس مفروضے کو جانچنے کے لیے، 6-OHDA کے مختلف ارتکاز کے سامنے آنے والی LUHMES خلیات کی فیز کنٹراسٹ امیجز، جیسا کہ شکل 2 میں بیان کیا گیا ہے، کا تجزیہ نابینا اور موضوعی اسکورنگ کے ذریعے 0 کے درمیان قدر کی حد کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ 0 اور 1۔{6}}، قدروں کے ساتھ جو بکھرے ہوئے نیورائٹ ایریا کے ظاہری تناسب کی نمائندگی کرتی ہیں۔ اس کے بعد ہم نے روایتی طریقہ کار کے ذریعے حاصل کردہ سبجیکٹو اسکورز اور DI پیمائش کے درمیان ارتباط کا جائزہ لیا، ساتھ ہی ساتھ ANDI میکرو کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کردہ سبجیکٹو اسکورز اور DI پیمائش کے درمیان ارتباط کا بھی جائزہ لیا۔

جبکہ روایتی طریقہ کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کردہ DI پیمائشیں موضوعی اسکورز (r {{0}}.7850، p،0.0001؛ تصویر 5F) کے ساتھ منسلک ہوتی ہیں، ANDI میکرو کا نتیجہ نکلا۔ وہ پیمائشیں جو موضوعی درجہ بندیوں کے ساتھ بہت زیادہ مضبوطی سے منسلک ہیں (r 2=0.978، p، 0.0001؛ تصویر 5G)۔ براہ راست شماریاتی موازنہ سے پتہ چلتا ہے کہ ANDI میکرو کے ذریعے حاصل کیے گئے اسکور روایتی طریقہ (z=6.626، p، 0.0001؛ تصویر 5F، G) کے ذریعے حاصل کیے گئے اسکورز کے مقابلے میں سبجیکٹیو ریٹنگز کے ساتھ نمایاں طور پر مضبوط ہیں۔ مزید تجزیوں سے یہ بات سامنے آئی کہ میکرو وقت کی کارکردگی میں مضبوط اور نمایاں بہتری کے ساتھ DI پیمائش کی کارکردگی کو آسان بناتا ہے۔ ANDI میکرو کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے DI تجزیوں کے لیے اوسطاً 12.75 سیکنڈ فی تصویر کے تجزیہ کا وقت درکار ہوتا ہے، اس کے مقابلے میں روایتی طریقہ [Friedman x2 (1)=9، p {{22} }.0027]۔ مجموعی طور پر، یہ نتائج بتاتے ہیں کہ ANDI DI پیمائشوں کی تیز رفتار نسل پیدا کرتا ہے، جو روایتی طریقہ کار کے ذریعے حاصل کیے گئے اسکور کے مقابلے میں، اس انحطاط کا زیادہ قریب سے اندازہ لگاتا ہے جو تفتیش کاروں کو نیورائٹ امیجز کے کوالٹیٹو تجزیہ سے معلوم ہوتا ہے۔

{{0}OHDA کے سامنے آنے والے امتیازی LUHMES خلیوں میں نیورائٹ انحطاط کی پیمائش کے لیے ANDI میکرو کی درستگی اور کارکردگی کا تعین کرنے کے بعد، ہم نے دوسرے سیل کلچر ماڈلز پر مشتمل تجربات کے لیے میکرو کی مناسبیت کا جائزہ لیا۔ b III-tubulin اور DAPI کے لیے امیونو لیبل والے بنیادی ہمدرد ثقافتوں کے مائیکرو گرافس کا استعمال کرتے ہوئے DI پیمائش کرنے میں ANDI کی درستگی کا اندازہ لگانے کے لیے سب سے پہلے ایک پائلٹ مطالعہ کیا گیا۔ تاہم، دلچسپ بات یہ ہے کہ ہمدرد نیورونز کے خلیے مختلف LUHMES خلیات سے بڑے ہوتے ہیں، اور اس طرح ANDI میں خودکار سوما ہٹانے سے متعلق آپریشنز نے پورے سوما کو نہیں ہٹایا (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا)۔

اس مسئلے پر قابو پانے کے لیے، ہم نے ANDI کو ایک ڈائیلاگ باکس پیش کرنے کے لیے نظر ثانی کی ہے جو صارفین کو اس قابل بناتا ہے کہ وہ نیوکلی کے بائنرائزڈ مائیکروگرافس کے پھیلنے کی تعداد کو کنٹرول کرتے ہوئے سوما ہٹانے کے سائز کا انتخاب کر سکے۔ ANDI کا یہ ورژن، ورژن 1.1، پھر مائیکرو گرافس سے DI پیمائش کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا جس میں صحت مند، گاڑیوں سے علاج کیے جانے والے ہمدرد نیورونز یا ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ کے سامنے آنے والے ہمدرد نیورونز کو دکھایا گیا تھا۔ ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ کے سامنے آنے والے نیوران کی تصاویر نے گاڑی سے علاج کیے جانے والے نیوران (F(1,3)=71.2، p=0.0035، R2=0 کی تصاویر کے مقابلے میں نمایاں طور پر زیادہ DI اسکور حاصل کیے .9301؛ تصویر 6A، C)۔ مزید یہ کہ، ہم نے ان DI اسکورز کا موازنہ کیا جو ANDI سے DI پیمائش کے ذریعے حاصل کیے گئے تھے جو امیج جے کے فری ہینڈ ٹول کا استعمال کرتے ہوئے فلوروسینس مائیکرو گرافس سے سیل باڈیز کو دستی طور پر ہٹانے کے بعد اسی تصویر کے سیٹ سے حاصل کیے گئے تھے۔ ANDI (F(1,3)=0.1082, p=0.7639, R2=0 کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کردہ اسکورز کے مقابلے دستی سوما ہٹانے کے بعد شمار کیے گئے DI اسکورز میں کوئی خاص فرق نہیں تھا۔ 0000؛ تصویر 6A–C)۔ پوسٹ ہاک ٹیسٹوں نے بھی اس بات کی تصدیق کی کہ ANDI کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کردہ DI اسکورز غیر علاج شدہ نیوران (p=0.0972) اور ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ (p=0) کے سامنے آنے والے نیوران کی صورت میں دونوں میں نمایاں طور پر مختلف نہیں تھے۔ 9986)۔

مزید برآں، ANDI سے تیار کردہ DI اسکور تقریباً یکساں طور پر متعلقہ مائیکرو گرافس (r(34)=0.991, p, 0.0001) سے سیل باڈیز کو دستی طور پر ہٹانے کے بعد حاصل کیے گئے DI اسکورز کے ساتھ ملتے ہیں۔ یہ اعداد و شمار ظاہر کرتے ہیں کہ ANDI بنیادی نیوران کی ثقافتوں میں نیورائٹ انحطاط کی پیمائش کے لیے موزوں ہے، سوما ہٹانے کے آپریشنز کے ساتھ جسے صارف مختلف نیوران کی اقسام سے ملنے کے لیے اپنی مرضی کے مطابق بنا سکتا ہے۔ مزید برآں، ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ کے سامنے آنے والی ثقافتوں میں نیورائٹ کے ٹکڑوں کی نشاندہی 6-OHDA کے علاوہ دیگر ذرائع سے نیورائٹ انحطاط پر مشتمل تجربات میں استعمال کے لیے میکرو کے قابل اطلاق ہونے کو ظاہر کرتی ہے۔ مختلف وجوہات سے وابستہ نیورائٹ انحطاط کا پتہ لگانے میں ANDI کے استعمال کی مزید توثیق کرنے کے لیے، ہم نے صحت مند ہمدرد ثقافتوں یا NGF کی واپسی کا نشانہ بننے والی ثقافتوں کے مائیکرو گرافس میں نیورائٹ انحطاط کی پیمائش کے لیے میکرو کا بھی استعمال کیا۔ جیسا کہ توقع کی گئی ہے، NGF کی واپسی کا نشانہ بننے والی ثقافتوں کی تصاویر سے صحت مند ثقافتوں (F(1,2)= 287, p= 0.0035, R2=0 کی تصاویر کے مقابلے میں نمایاں طور پر زیادہ DI قدریں حاصل ہوئیں۔ 958؛ تصویر 6D، E)۔ اجتماعی طور پر، یہ نتائج یہ ظاہر کرتے ہیں کہ ANDI کو مختلف قسم کے حیاتیاتی سیاق و سباق سے وابستہ نیورائٹ انحطاط کا پتہ لگانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔

چونکہ TH کے لیے داغدار ہونا عام طور پر catecholaminergic neurons کو دیکھنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے، اس لیے ہم نے ANDI کا استعمال کرتے ہوئے نیورائٹ انحطاط کی پیمائش کرنے کے لیے TH کے داغ کو ظاہر کرنے والے مائیکرو گرافس کی مناسبیت کا بھی جائزہ لیا۔ ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ کے سامنے آنے والے صحت مند ہمدرد نیوران کے علاج کے ساتھ علاج کیے جانے والے صحت مند ہمدرد نیوران کی ثقافتوں کو طے کیا گیا تھا اور TH اور b III-tubulin کے لیے امیونو فلوروسینس لیبلنگ کے ساتھ ساتھ DAPI کے لیے کاؤنٹرسٹیننگ کا نشانہ بنایا گیا تھا۔ نیورائٹ امیجز جس میں TH یا b III-tubulin کے لیے داغ دھبے کی تصویر کشی کی گئی ہے، اور DAPI لیبلنگ کی خاصیت والے نیوکلی کی متعلقہ تصاویر، پھر اسی طرح کے کھیتوں میں کیپچر کی گئیں۔ ANDI کو پھانسی دی گئی تھی، اور TH سٹیننگ یا b III-tubulin سٹیننگ والی تصاویر کو نیورائٹ امیجز کے طور پر منتخب کیا گیا تھا۔ ہمارے تجزیوں سے یہ بات سامنے آئی ہے کہ TH سٹیننگ کی تصاویر کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کردہ DI اسکورز b III-tubulin staining (r(28)= 0.962، p، 0.0001؛ تصویر سے حاصل کردہ اسکورز کے ساتھ بہت مضبوطی سے منسلک ہیں۔ 6 ایف، جی)۔ یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ ANDI کے ذریعہ داغ لگانے کے متبادل طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے درست DI پیمائش حاصل کی جا سکتی ہے جو نیورائٹس کی مکمل لیبل لگاتے ہیں، جیسے کہ TH کے لیے امیونو لیبلنگ۔

ایک سائنسی تجربے میں DI پیمائش کرنے کے لیے بہتر طریقہ کار کی افادیت کو ظاہر کرنے کے لیے، ہم نے انسانی میسینسفالک خلیوں میں آکسیڈیٹیو تناؤ سے متاثر نیورائٹ انحطاط میں JNK کے کردار کا اندازہ لگانے کے لیے نیا طریقہ استعمال کیا۔ مختلف LUHMES خلیوں کو JNK inhibitor SP600125 یا گاڑی کے حل کے ساتھ 1 گھنٹہ کے لئے پہلے سے علاج کیا گیا تھا۔ اس کے بعد خلیوں کا علاج 24 گھنٹے کے لیے 6- OHDA کے ساتھ کیا گیا تاکہ آکسیڈیٹیو تناؤ پیدا کیا جا سکے یا گاڑیوں کے حل کے ساتھ۔ فکسڈ سیلز کو b III-tubulin اور DAPI سٹیننگ کے لیے امیونو لیبلنگ کا نشانہ بنایا گیا تھا، اور ANDI کا استعمال فلوروسینس مائیکرو گرافس سے DI پیمائش حاصل کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ جب کہ JNK inhibitor کے ساتھ پہلے سے علاج کی کمی والی ثقافتوں میں 6-OHDA کے سامنے آنے کے بعد نیورائٹ انحطاط کا مظاہرہ کیا گیا، JNK کی روک تھام کے نتیجے میں 6- OHDA-حوصلہ افزائی نیورائٹ انحطاط (p= 0.0001) میں نمایاں اور نمایاں کمی واقع ہوئی۔ , d= 2.0209؛ تصویر 7)۔ یہ نتائج انسانی mesencephalic خلیات میں آکسیڈیٹیو تناؤ کی وجہ سے نیورائٹ انحطاط میں JNK سگنلنگ کے لیے کلیدی کردار کی حمایت کرتے ہیں، اور اہم بات یہ ہے کہ نیورائٹ انحطاط کی تیز رفتار اور درست پیمائش کو آسان بنا کر سائنسی دریافتیں پیدا کرنے کے لیے ہمارے نئے طریقہ کار کی افادیت کو ظاہر کرتے ہیں۔

بحث

نیورائٹ انحطاط مختلف قسم کے نیوروپیتھولوجیکل حالات سے وابستہ ہے، پھر بھی نیورائٹس کے انحطاط کے تحت مالیکیولر میکانزم نامکمل طور پر سمجھے جاتے ہیں۔ نیورائٹ انحطاط کے درست اور موثر تجزیہ کی سہولت فراہم کرنے والے طریقے اس اہم سیلولر واقعہ کو منظم کرنے والے نئے عوامل کی کامیاب شناخت کے لیے ضروری ہیں۔ موجودہ مطالعہ میں، ہم نیورائٹ انحطاط کو کم کرنے کے لیے عام طور پر استعمال ہونے والے طریقہ کار سے وابستہ غلطی کے متعدد ذرائع ظاہر کرتے ہیں۔ ہم تجرباتی اعداد و شمار کی اطلاع دیتے ہیں جو طریقہ کار میں ترمیم کی حمایت کرتے ہیں جو DI تجزیہ کی خرابی کو کم کرنے کے لیے لاگو کیا جا سکتا ہے، اور اس طرح کی ترامیم کو ایک نئے ImageJ میکرو میں شامل کیا جاتا ہے تاکہ اوپن سورس اور مفت سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے تیز، درست اور معروضی DI تجزیوں کے لیے ایک ٹول فراہم کیا جا سکے۔ مزید برآں، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ PD کے سیل کلچر ماڈل میں نیورائٹ انحطاط کی پیمائش کرنے کے لیے کس طرح بہتر طریقہ کار کا اطلاق کیا جا سکتا ہے، یہ ایک ایسا عارضہ ہے جس میں ڈوپیمینجک نیوران میں محوری ٹکڑا ایک ابتدائی مرحلے کا واقعہ ہے جو کہ نیورونل نقصان سے پہلے ہوتا ہے (Tagliaferro and Burke, 2016) .

موجودہ مطالعہ میں، ہم PD کے سیل کلچر ماڈل میں نیورائٹ ڈیجنریشن کی پیمائش کرنے میں ANDI میکرو کی افادیت کا مظاہرہ کرتے ہیں جس میں 6-OHDA کے سامنے آنے والے مختلف LUHMES خلیات شامل ہیں۔

ہم تجرباتی نتائج کی اطلاع دیتے ہیں جو زیادہ سے زیادہ ذیلی جگہوں کی حمایت کرتے ہیں جن پر ثقافتوں کو قائم کیا جانا چاہئے، اور ساتھ ہی پلیٹنگ کثافت کا مظاہرہ کرتے ہیں جو نیورائٹ انحطاط کے تجزیوں کے لیے موزوں ترین ہے۔ نیورائٹ انحطاط کا مطالعہ کرنے کے لیے اس ماڈل سسٹم کے استعمال کے کئی فوائد ہیں۔ خلیات ایسے نیورائٹس تیار کرتے ہیں جو اچھی طرح سے نیٹ ورک ہوتے ہیں اور عام طور پر .500 ملی میٹر کی لمبائی ہوتی ہے، اور ثقافتیں PD کے کلاسک، نیوروٹوکسن ماڈلز جیسے کہ 6-OHDA، 1-میتھائل{{4} کی وجہ سے نیوروڈیجنریشن کے لیے حساس ہوتی ہیں۔ }}فینیلپائریڈینیم آئن (MPP1)، اور روٹینون (لوتھریئس ایٹ ال۔، 2005؛ ژانگ ایٹ ال۔، 2014؛ سمرنووا ایٹ ال۔، 2016؛ کریمر ایٹ ال۔، 2021)۔ مزید برآں، LUHMES خلیات کی انسانی اصلیت ماڈل سے وابستہ نتائج کی ترجمے میں اضافہ کرتی ہے، اور مشروط لافانی ثقافتوں کی تیز رفتار نسل اور پھیلاؤ میں سہولت فراہم کرتی ہے (Scholz et al.، 2011)۔ اس طرح، ANDI کا استعمال کرتے ہوئے خودکار تجزیوں کے ساتھ مل کر، LUHMES خلیات کو PD سے وابستہ نیورائٹ انحطاط سے متعلق نئی دریافتیں کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے جبکہ پرائمری نیورونل کلچرز کے ساتھ کیے جانے والے غیر خودکار تجزیوں کے مقابلے میں کافی زیادہ تھرو پٹ کی سہولت فراہم کی جا سکتی ہے۔

متعدد تحقیقی گروپوں نے نیورائٹ انحطاط کو منظم کرنے والے عوامل کے بارے میں بصیرت حاصل کرنے کے لیے فیز کنٹراسٹ امیجز کا استعمال کرتے ہوئے ڈی آئی کے تجزیے کیے ہیں (پریس اور ملبرانڈ، 20{{10}}9؛ Kraemer et al.، 2014 ; Di Stefano et al., 2015; Hill et al., 2018; Geisler et al., 2019)۔ یہاں، ہم نیورائٹ انحطاط کی پیمائش کے لیے اس وسیع پیمانے پر استعمال ہونے والے طریقہ سے وابستہ ایک اہم خرابی کی اطلاع دیتے ہیں: فیز کنٹراسٹ امیجز کی بائنرائزیشن برقرار نیورائٹس کا ایک اہم تناسب بکھرے ہوئے ظاہر ہونے کا سبب بنتی ہے۔ اگرچہ مائیکرو گراف کیپچر کرتے وقت حاصل ہونے والے تضاد کی سطح تفتیش کاروں کے لیے دستیاب مائکروسکوپ سسٹم کے لحاظ سے مختلف ہوتی ہے، لیکن یہ مسئلہ مختلف تحقیقی گروپوں کے درمیان وسیع ہے، کیونکہ 0.2 کے DI کو عام طور پر ایک حد کے طور پر قبول کیا جاتا ہے جس کے اوپر ثقافتوں کو انحطاط پذیر سمجھا جاتا ہے۔ ایکسونس، اور زیادہ تر سائنسی رپورٹس جن میں فیز کنٹراسٹ مائیکروگرافس سے DI پیمائشیں شامل ہیں نے 0.1 اور 0.3 کے درمیان صحت مند نیورونز کے لیے DI اسکور رپورٹ کیے ہیں (ساساکی ایٹ ال۔، 2009، 2016؛ ڈی اسٹیفانو ایٹ ال۔، 2015؛ ہل ایٹ ال۔، 2018؛ Loreto et al.، 2020)۔ فلوروسینس مائیکرو گرافس سے حاصل کردہ ہمارے DI تجزیے، نیز نابینا تفتیش کاروں کے موضوعی اسکورز سے پتہ چلتا ہے کہ صحت مند نیوران ثقافتوں میں 10-20٪ نیورائٹ فریگمنٹیشن عام نہیں ہے۔ بلکہ، اس طرح کی ثقافتیں اوسطاً صرف 2.5% نیورائٹ فریگمنٹیشن کی نمائش کرتی ہیں۔ اس طرح، ہماری تلاشیں ایسے طریقوں کی ضرورت پر زور دیتی ہیں جو پیمائش کی غلطی کے اس عام اور اہم ذریعہ کو کم کرکے نیورائٹ انحطاط کے تجزیوں کی درستگی کو بہتر بناتے ہیں۔

اگرچہ ڈی آئی پیمائش پر مشتمل زیادہ تر مطالعات میں نیورائٹ انحطاط کے تجزیوں کو انجام دینے کے لیے فیز کنٹراسٹ امیجز کا استعمال کیا گیا ہے، کئی ریسرچ گروپس نے حال ہی میں سائٹوسکیلیٹل فلیمینٹس جیسے نیوروفیلمنٹ میڈیم پولی پیپٹائڈ یا b -b-tubulin (Wakatsuki) کے لیے امیونو لیبل والے نیوران کی تصاویر کا استعمال کرتے ہوئے DI پیمائش کی ہے۔ et al. تاہم، مائیکروسکوپی کی کون سی شکل نیورائٹ انحطاط کی پیمائش کے لیے موزوں ہے، یہ واضح نہیں ہے، کیونکہ یہ سمجھنے کے لیے تحقیقات کی ضرورت ہے کہ آیا نیورائٹ انحطاط کے دوران ان سائٹوسکیلیٹل پروٹینز کے لوکلائزیشن میں تبدیلیاں نیورائٹ مورفولوجی میں کل تبدیلیوں کو مناسب طریقے سے نمونہ بناتی ہیں، اور ساتھ ہی اس کا جائزہ لینے کے لیے بھی۔ فلوروسینس مائیکرو گرافس کے ساتھ حاصل کردہ DI پیمائشیں فیز کنٹراسٹ مائیکروگرافس سے حاصل کی گئی اسی طرح کی پیمائشوں سے منسلک ہوتی ہیں۔ یہاں، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ فلوروسینس مائیکروگرافس جس میں b III-tubulin داغ کی تصویر کشی کی گئی ہے وہ نہ صرف نیورائٹ فریگمنٹیشن کی درستگی کی نمائندگی کرتے ہیں بلکہ ان کے اعلیٰ تضاد اور بائنرائزیشن پر مصنوعی ٹکڑے کرنے کے لیے حساسیت میں کمی کی وجہ سے زیادہ درست DI پیمائش کی سہولت بھی فراہم کرتے ہیں۔ اس طرح، ہمارے نتائج نیورائٹ انحطاط کی پیمائش کرنے کے لئے b III-tubulin سٹیننگ کے استعمال کی افادیت کو اجاگر کرتے ہیں۔

نیورائٹ کے انحطاط کی پیمائش کرنے کے لیے ڈی آئی کے تجزیوں پر مشتمل شائع شدہ مطالعات میں، نیورائٹ کے ٹکڑوں کا پتہ لگانے کے لیے استعمال کیے جانے والے سائز اور گردش کے پیرامیٹرز کافی مختلف ہیں۔ مثال کے طور پر، ایک حالیہ مطالعہ جس میں کلچرڈ ہپپوکیمپل نیورونز میں نیورائٹ انحطاط کا اندازہ لگایا گیا تھا جس میں 4–900 پکسلز کے سائز کے پیرامیٹرز کا استعمال کیا گیا تھا (لی ایٹ ال۔ 0–10،000 پکسلز (واکٹسوکی وغیرہ، 2011)۔ اس طرح کے تغیر کی ایک ممکنہ وجہ یہ ہے کہ نیورائٹ کے ٹکڑوں کا پتہ لگانے میں ذرہ تجزیہ سائز کے پیرامیٹرز کی افادیت تصویر کے ریزولوشن کے لحاظ سے مختلف ہوتی ہے کیونکہ ذرہ کی کھوج کے سائز کے پیرامیٹرز پکسل یونٹوں سے وابستہ ہیں۔ بدقسمتی سے، DI کے تجزیوں پر مشتمل زیادہ تر شائع شدہ مطالعات میں تجزیوں کے لیے استعمال ہونے والی تصویری ریزولوشن کی تفصیل شامل نہیں ہے۔ اس طرح، ایک پروٹوکول کے ذریعے معیاری تجزیہ کے پیرامیٹرز کا قیام جو اہم تفصیلات کو مکمل طور پر ظاہر کرتا ہے جیسے کہ تجویز کردہ تصویری ریزولوشن کی ضرورت ہے۔ یہاں، ہم رپورٹ کرتے ہیں کہ نیورائٹ فریگمنٹ کا پتہ لگانے کے لیے سب سے عام طور پر پیش کردہ پیرامیٹرز، 20– 10،000 پکسلز (شن ایٹ ال۔، 2012؛ ڈی اسٹیفانو ایٹ ال۔، 2015؛ ساساکی ایٹ ال۔، 2016؛ لوریٹو اور ال۔ نیورائٹ فریگمنٹ کا پتہ لگانے کے لیے کم از کم سائز کے معیار کو کم کرنا ٹکڑوں کا پتہ لگانے کی حساسیت کو بڑھاتا ہے، جبکہ اس کے ساتھ ساتھ تصویری نمونے اور غیر نیورائٹ ملبے کی تعداد میں اضافہ ہوتا ہے جو نیورائٹ کے ٹکڑے کے طور پر غلط طور پر پائے جاتے ہیں۔ ایسے پیرامیٹرز کی تلاش میں جو پتہ لگانے کی حساسیت اور غلط مثبتیت کی شرحوں میں بہترین توازن پیدا کریں گے، ہم نے 10–10 کے تجزیہ پیرامیٹرز کی نشاندہی کی،000 فیز کنٹراسٹ مائیکروگرافس سے حاصل کردہ بائنرائزڈ امیجز میں نیورائٹ کے ٹکڑوں کا سب سے درست پتہ فراہم کرتے ہوئے، جبکہ 5–10 کے پیرامیٹرز،000 فلوروسینس مائیکروگرافس سے حاصل کردہ بائنرائزڈ امیجز میں نیورائٹ کے ٹکڑوں کی درست ترین شناخت میں سہولت فراہم کرتے ہیں۔ جب کہ یہ تعین 1280 1024 کی تصویری ریزولوشن کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے تھے، اس طرح کے پیرامیٹرز کو 1024 پکسلز کے عمودی سائز کی خاصیت والی دیگر ریزولوشنز پر کی گئی تصاویر میں نیورائٹ فریگمنٹ کی درست شناخت کو بھی قابل بنانا چاہیے، جیسے کہ {{ کی عام فل سکرین ریزولوشن۔ 27}}، چونکہ اس طرح کی تصاویر میں دکھائے گئے نیوران اسی طرح کے پکسل سائز کے ہوں گے۔

نیورائٹ ٹکڑے کی پیمائش میں چھوٹے، غیر نیورائٹ ملبے کو شامل کیے جانے سے بچنے کے لیے متعدد تحقیقی گروپوں نے ذرہ تجزیہ کے پیرامیٹرز کو ترتیب دیتے وقت کم از کم سائز کا معیار استعمال کیا ہے (شن ایٹ ال۔ 2015؛ Sasaki et al.، 2016؛ Li et al.، 2017؛ Loreto et al.، 2020؛ Shin and Cho، 2020؛ Sundaramoorthy et al.، 2020)۔ تاہم، اس طرح کے مطالعے نے غلطی سے ٹوٹل نیورائٹ ایریا کی پیمائش میں چھوٹے، غیر ٹکڑے والے مادے کو شامل کیا ہے، کیونکہ اس طرح کی پیمائشیں تصویر میں موجود تمام سیاہ پکسلز کے رقبے کو جمع کرکے حاصل کی جاتی ہیں۔ یہاں، ہم DI تجزیہ سے پہلے تصویر سے چھوٹے، غیر ٹکڑے والے ملبے کو ہٹانے کے لیے پارٹیکل ریموور پلگ ان کی افادیت کا مظاہرہ کرتے ہیں۔ پلگ ان کے استعمال نے فیز کنٹراسٹ امیجز سے حاصل کردہ نیورائٹ ڈیجنریشن پیمائش کی حساسیت میں نمایاں اضافہ کیا۔ اس طرح، ہمارے نتائج فیز کنٹراسٹ مائیکرو گرافس کا استعمال کرتے ہوئے ڈی آئی تجزیہ کرنے والے تفتیش کاروں کے لیے پارٹیکل ریموور پلگ ان کی قدر کو نمایاں کرتے ہیں۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ فلوروسینس مائیکرو گراف میں کم چھوٹے، غیر نیورائٹ ملبے کو نمایاں کیا گیا ہے، اور اس طرح، ٹکڑے کا پتہ لگانے کے لیے پانچ پکسلز کا کم سائز کا معیار استعمال کیا جا سکتا ہے۔ اگرچہ پانچ پکسلز سے کم سائز کے نان نیورائٹ ملبے کو ہٹانے سے فلوروسینس مائیکروگرافس سے حاصل کی گئی ڈی آئی پیمائشوں کو نمایاں طور پر متاثر نہیں کیا گیا، اس طرح کے آپریشنز ایسی اقدار فراہم کرتے ہیں جو نظریاتی طور پر زیادہ درست ہیں اور اسی لیے ANDI میں شامل تھے۔

چونکہ DI کے تجزیوں کو صرف نیورائٹس کی خصوصیت والی تصاویر کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا جانا چاہیے، اس لیے تجزیہ کے طریقہ کار کا اطلاق بنیادی طور پر سیل باڈیز کو ہٹانے کے لیے قابل عمل کلچر سسٹمز کے استعمال تک محدود کر دیا گیا ہے، جیسے کہ ایکسپلانٹ کلچرز جن میں سیل باڈیز کو جسمانی طور پر نکالا جا سکتا ہے (Catenaccio et al. ، 2017؛ شن اور چو، 2020) یا مائکرو فلائیڈک آلات میں ثقافتیں جو سوما اور ایکسون کمپارٹمنٹس کو الگ کرنے میں سہولت فراہم کرتی ہیں (کوسکر ایٹ ال۔ متبادل طور پر منقطع ثقافتوں کے ساتھ DI تجزیہ کرنا مائیکرو گرافس سے سیل باڈیز کو ڈیجیٹل ہٹانے سے وابستہ تھکا دینے والی اور وقت طلب محنت کے ذریعے حاصل کیا جا سکتا ہے (Kraemer et al.، 2014)۔ موجودہ مطالعہ میں، ہم نے انکشاف کیا ہے کہ ANDI مائکروگرافس سے DI پیمائش کی کارکردگی کو قابل بناتا ہے جس میں LUHMES خلیات شامل ہیں جو 2D کلچر سسٹم میں الگ الگ اور موزیک طور پر تقسیم ہوتے ہیں۔ ہمارے نتائج یہ بھی ظاہر کرتے ہیں کہ ANDI تجزیوں کو انجام دینے کے لیے درکار وقت میں 24-گنا کمی کی سہولت فراہم کرتا ہے، اور ANDI میں کارروائیوں سے سوما ہٹانے سے متعلق DI تجزیہ کے نتائج برآمد ہوتے ہیں جو کہ دستی سوما کو ہٹانے کے بعد کیے گئے اسی طرح کے تجزیوں کے ساتھ 98% کو جوڑتے ہیں۔ امیج جے کا فری ہینڈ ٹول۔ اس طرح، میکرو ایک ایسے عمل کے ذریعے خودکار سوما ہٹانے کے ذریعے تجزیوں کی کارکردگی میں خاطر خواہ اضافہ کرتا ہے جو درستگی کی قربانی نہیں دیتا، اور اس طرح کے آپریشنز موزیک طور پر تقسیم شدہ سیل باڈیز کے ساتھ منقسم ثقافتوں کا تجزیہ کرنے کے طریقہ کار کی مناسبیت کو بڑھاتے ہیں۔

تصاویر سے سیل باڈی کو خودکار طریقے سے ہٹانے کی سہولت فراہم کرنے کے علاوہ، ANDI میں DI تجزیہ کرنے کے لیے روایتی طریقہ کار میں کئی ترمیمات شامل ہیں، بشمول فلوروسینس مائیکرو گرافس کا استعمال، نظر ثانی شدہ پارٹیکل تجزیہ پیرامیٹرز، اور چھوٹے، غیر نیورائٹ ملبے کو ہٹانے کے لیے پارٹیکل ریموور کا استعمال۔ تصاویر سے. ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ یہ اصلاحات اجتماعی طور پر DI قدریں حاصل کرتی ہیں جو اندھی اور موضوعی اسکورنگ کے ذریعے حاصل کی جانے والی زیادہ قریب سے تخمینی اقدار ہیں۔ اس طرح، تجزیہ کرنے کے لیے درکار وقت کو کافی حد تک کم کرنے کے علاوہ، ANDI DI پیمائش کی سہولت فراہم کرتا ہے جو روایتی طریقہ کے مقابلے میں، زیادہ درست طریقے سے نیورائٹ انحطاط کی عکاسی کرتا ہے جس کا تفتیش کاروں نے مبینہ طور پر کوالٹیٹو امیج تجزیہ سے مشاہدہ کیا ہے۔

DI تجزیہ کرنے کے روایتی طریقے کی ایک خرابی یہ ہے کہ اس طرح کے تجزیوں کے لیے ImageJ کے استعمال کی تربیت کی ضرورت ہوتی ہے تاکہ صارف ImageJ آپریشنز کے ایک تھکا دینے والے سیٹ سے واقف ہو۔ مزید برآں، تجزیوں کو مؤثر طریقے سے انجام دینے کے لیے، صارف کو بیچ کے تجزیوں کو انجام دینے یا مخصوص مراحل کے عمل کو نیم خودکار کرنے کے لیے اسکرپٹ لکھنے کے لیے مزید تربیت کی ضرورت ہوتی ہے۔ تجزیہ کو مکمل طور پر خودکار بنا کر، ANDI میکرو کو ڈاؤن لوڈ کرنے اور اس پر عمل کرنے سے متعلق صرف چند مراحل میں DI پیمائش کی سہولت فراہم کرتا ہے۔ صارف دوستی کو بڑھانے کے لیے، میکرو میں تجزیہ کرنے کے لیے تصاویر پر مشتمل ڈائریکٹریز کو منتخب کرنے کے لیے ایک انٹرفیس فراہم کرنے کے لیے کوڈ شامل ہے، نیز صارف کی پسند کی ڈائرکٹری میں نتائج کی تصاویر اور ڈیٹا ٹیبلز کے آؤٹ پٹ کو سہولت فراہم کرنے کے لیے۔ مزید برآں، اسکرپٹ میں پیمائش کی غلطیوں یا صارف کی غلطیوں کو روکنے کے لیے ڈیزائن کی گئی متعدد خصوصیات شامل ہیں، بشمول پچھلے ImageJ نتائج کی خودکار کلیئرنگ؛ اس بات کو یقینی بنانے کے لیے تصویری پیمانے کی معلومات کو ہٹانا کہ پکسل یونٹس کا استعمال کرتے ہوئے پیمائش درست طریقے سے کی جاتی ہے۔ امیج جے کلر سیٹنگز، پیمائش سیٹنگز، اور پارٹیکل اینالائزر پیرامیٹرز کی مناسب ترتیب؛ غلطی کے پیغام کی پیشکش اگر صارفین غلطی سے ایسی ڈائرکٹریز منتخب کرتے ہیں جن میں تصاویر کی غیر مساوی تعداد ہوتی ہے جس میں b III-tubulin سٹیننگ اور DAPI سٹیننگ کو دکھایا جاتا ہے۔ تجزیے کی پیشرفت کی نشاندہی کرنے والی لاگ تفصیل؛ اور ونڈوز 10 کے ذریعے خودکار .ini فائل جنریشن سے وابستہ بگس کو روکنے کے لیے کوڈنگ۔ مجموعی طور پر، یہ خصوصیات DI کے تجزیوں کو زیادہ صارف دوست بناتی ہیں، جو نیورائٹ ڈیجنریشن سے متعلق مطالعات میں دلچسپی کو بڑھا سکتی ہیں۔

ایک تجربے میں اس کی افادیت کو ظاہر کرنے کے لیے، ہم نے 6-OHDA کے سامنے آنے والے LUHMES سیل کلچرز میں نیورائٹ ڈیجنریشن میں JNK کے تعاون کا جائزہ لینے کے لیے ANDI کا استعمال کیا۔ JNK ایک تناؤ سے چلنے والا کناز ہے جس کی اطلاع غیر پرائمیٹ اصل (شن ایٹ ال۔، 2012) کے پیریفرل نیوران میں نیورائٹ انحطاط کی کلید کے طور پر دی گئی ہے، لیکن میسینسفلک انسانی خلیوں میں نیورائٹ انحطاط میں کناز کے کردار کو سمجھنے کے لیے مزید مطالعات کی ضرورت ہے۔ . یہاں، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ JNK کی روک تھام انسانی mesencephalic خلیات کو آکسیڈیٹیو تناؤ سے وابستہ نیورائٹ انحطاط سے نمایاں طور پر بچاتی ہے۔ اس طرح کے نتائج نہ صرف انسانی بیماری کے ماڈل سے منسلک نیورائٹ انحطاط میں JNK کے ایک اہم کردار کو ظاہر کرتے ہیں بلکہ نئی سائنسی دریافتیں کرنے کے لیے خودکار اور معروضی تصویری تجزیہ کرنے کے لیے ANDI کی افادیت کی بھی مثال دیتے ہیں۔

جب کہ ANDI کو ابتدائی طور پر 6-OHDA کے سامنے آنے والے مختلف LUHMES خلیوں کی ثقافتوں میں نیورائٹ انحطاط کی تیز رفتار اور درست پیمائش کی سہولت فراہم کرنے کے لیے ڈیزائن کیا گیا تھا، ہمارے نتائج یہ بھی بتاتے ہیں کہ میکرو کو دیگر وجوہات کی وجہ سے نیورائٹ انحطاط کا پتہ لگانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے، جیسے ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ یا نیوروٹروفین کی واپسی کی نمائش۔ مزید برآں، میکرو کے ورژن 1.1 میں ایک ڈائیلاگ باکس شامل ہے جو تفتیش کاروں کو مخصوص سائز کے نیوران کے لیے سوما ہٹانے کے آپریشنز کو اپنی مرضی کے مطابق کرنے کے قابل بناتا ہے۔ ہمارا ڈیٹا اس بات کی بھی تائید کرتا ہے کہ b III-tubulin کے لیے امیونو لیبلنگ کے علاوہ داغ لگانے کے طریقے نیورائٹ انحطاط کی درست پیمائش کے لیے استعمال کیے جا سکتے ہیں۔ اگرچہ ہم DI پیمائش کی درستگی کی تصدیق کے لیے پائلٹ اسٹڈیز کے استعمال کی تجویز کرتے ہیں جب سیل کی اقسام کے ساتھ ANDI کا استعمال کرتے ہوئے یا داغ لگانے کے طریقے جن کا پہلے تجربہ نہیں کیا گیا تھا، یہ نتائج اس بات کی تائید کرتے ہیں کہ میکرو عام طور پر مہذب نیوران میں نیورائٹ انحطاط کی پیمائش کے لیے ایک ورسٹائل ٹول ہے۔ چونکہ ANDI کو ٹشو میں نیورائٹ انحطاط کی پیمائش کے لیے بہتر نہیں بنایا گیا ہے، اس لیے ہم فی الحال صرف مہذب خلیوں سے وابستہ نیورائٹ انحطاط کا تجزیہ کرنے کے لیے اس کے استعمال کی سفارش کرتے ہیں۔ تاہم، ANDI کے لیے کوڈ عوامی طور پر دستیاب ہے اور اس طرح ویوو اسٹڈیز یا دیگر ایپلی کیشنز کے مطابق اسکرپٹ میں ترمیم کرنے میں دلچسپی رکھنے والے تفتیش کاروں کے لیے بھی کارآمد ہو سکتا ہے۔

آخر میں، یہ مضمون نیورائٹ انحطاط کی مقدار درست کرنے کے لیے وسیع پیمانے پر استعمال شدہ طریقہ سے وابستہ غلطی کے عام ذرائع کو ظاہر کرنے والا ڈیٹا پیش کرتا ہے۔ طریقہ کار کو بہتر بنانے کے لیے تجرباتی نقطہ نظر کا استعمال کیا گیا تھا، اور اس طرح کے اضافہ کو ایک مفت اور اوپن سورس امیج جے میکرو میں شامل کیا گیا تھا جسے نیورائٹ انحطاط کے لیے فلوروسینس مائیکروگرافس کے تیز، درست اور معروضی تجزیہ کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ ہماری تلاشیں مائیکرو گرافس میں نیورائٹ انحطاط کی مقدار کے لیے ANDI کی افادیت کو ظاہر کرتی ہیں جس میں PD کے سیل کلچر ماڈل کو دکھایا گیا ہے، اور ساتھ ہی اس اصول کا ثبوت بھی فراہم کیا گیا ہے کہ میکرو دیگر حیاتیاتی سیاق و سباق سے وابستہ نیورائٹ انحطاط کا پتہ لگا سکتا ہے۔ صارف دوست میکرو تفتیش کاروں کے لیے نیورائٹ فرگمنٹیشن کی مقدار معلوم کرنے کے لیے درکار وقت کو کم کر دے گا جبکہ نیورائٹ انحطاط کے بنیادی عوامل کا جائزہ لینے والے مطالعات کے تھرو پٹ اور درستگی میں اضافہ کرے گا۔ ANDI میکرو درج ذیل URL پر دستیاب ہے: https://github.com/kraemerb/kraemerlab۔

حوالہ جات

1. Aarsland D, Creese B, Politis M, Choudhuri KR, Ffytche DH, Weintraub D, Ballard C (2017) پارکنسن کی بیماری میں علمی کمی۔ نیٹ ریو نیورول 13:217–231۔

2. ایڈلبرٹ آر، کولمین ایم پی (2013) جائزہ: عمر سے متعلق نیوروڈیجینریٹو عوارض میں ایکسن پیتھالوجی۔ نیوروپتھول ایپل نیوروبیول 39:90–108۔

3. Bové J، Perier C (2012) پارکنسنز کی بیماری کے نیوروٹوکسن پر مبنی ماڈل۔ نیورو سائنس 211:51-76۔

4. Catenaccio A, Llavero Hurtado M, Diaz P, Lamont DJ, Wishart TM, Court FA (2017) axonal-internsic and glial-associated co-regulation of axon degeneration کا مالیکیولر تجزیہ۔ سیل ڈیتھ Dis 8: e3166۔

5. Cosker KE، Pazyra-Murphy MF، Fenstermacher SJ، Segal RA (2013) ہدف سے حاصل شدہ نیوروٹروفنز کوآرڈینیٹ ٹرانسکرپشن۔

6. Di Stefano M, Nascimento-Ferreira I, Orsomando G, Mori V, Gilley J, Brown R, Janeckova L, Vargas ME, Worrell LA, Loreto A, Tickle J, Patrick J, Webster JRM, Marangoni M, Carpi FM, Pucciarelli S, Rossi F, Meng W, Sagasti A, Ribchester RR, et al. (2015) چوٹ لگنے کے بعد NAD پیشگی نکوٹینامائڈ مونونوکلیوٹائڈ (NMN) میں اضافہ ایکسون انحطاط کو فروغ دیتا ہے۔ سیل ڈیتھ فرق 22:731–742۔

7. Fukui K (2016) ری ایکٹو آکسیجن پرجاتیوں میں خلیے کی موت کو شامل کرنے سے پہلے نیورائٹ انحطاط کا باعث بنتی ہے۔ J Clin Biochem Nutr 59:155–159۔

8. Geden MJ، Deshmukh M (2016) Axon Degeneration: سیاق و سباق الگ الگ راستوں کی وضاحت کرتا ہے۔ کر اوپین نیوروبیول 39:108–115۔

9. Geisler S, Doan RA, Cheng GC, Cetinkaya-Fisgin A, Huang SX, Höke A, Milbrandt J, DiAntonio A (2019) Vincristine اور bortezomib ایک مشترکہ SARM1- پر منحصر ایکسن ڈیجنر کو فعال کرنے کے لیے الگ الگ اپ اسٹریم میکانزم کا استعمال کرتے ہیں۔ پروگرام JCI انسائٹ 4:e129920۔

10. Hernandez DE, Salvadores NA, Moya-Alvarado G, Catalan RJ, Bronfman FC, Court FA (2018) axonal degeneration by glutamate excitotoxicity induced by necroptosis کے ذریعے ثالثی کی جاتی ہے۔ J Cell Sci 131:jcs214684۔

For more information:1950477648nn@gmail.com