Anterior Thalamic Nuclei: چوہوں میں غیر مقامی پیئرڈ ایسوسی ایٹ میموری کے لیے ایک کریٹیکل سبسٹریٹ حصہ 2

2|مواد اور طریقے

2.1|جانوروں اور رہائش کے حالات

نر لانگ ایونز چوہوں (12 ماہ کی عمر؛ اوسطاً 630 گرام) تین یا چار کے گروپوں میں میکرولن کے پنجروں (48 28 22 سینٹی میٹر) میں ایک الٹ 12- گھنٹہ روشنی – تاریک سائیکل (رات 8 بجے روشنیاں) پر رکھے گئے تھے۔ )۔

طرز عمل کی جانچ لائٹ سائیکل کے تاریک مرحلے میں ہوئی، ہر ہفتے پانچ سیشن؛ مشاہدات نے اس بات کی تصدیق کی کہ تاریک مرحلے کے دوران چوہے نسبتاً زیادہ متحرک تھے۔ چوہوں کو پانی کی اشتہا کے ساتھ جسم کے وزن کے 85% پر مفت کھانا کھلایا جاتا تھا؛ آپریشن کے بعد صحت یابی کے لیے سرجری سے پہلے اور بعد میں خوراک کو اشتہا پسند تھا۔

سرجری بیماری کے علاج اور جسمانی صحت کو بہتر بنانے کا عمل ہے۔ سرجری کے بعد بحالی کا عمل خصوصی توجہ کی ضرورت ہے۔ جسمانی بحالی کے علاوہ، اچھا محسوس کرنے کے لیے یادداشت کی بحالی پر توجہ مرکوز کرنے کی بھی ضرورت ہوتی ہے۔ آپریشن کے بعد کی بحالی اور یادداشت کے درمیان ایک مضبوط تعلق ہے۔

آپریشن کے دوران، جسم کے منفی ردعمل اور بے ہوشی کی دوائیوں کے اثرات جیسے عوامل اکثر دماغ کی یادداشت کو متاثر کرتے ہیں۔ جسم کے ٹھیک ہونے کے بعد اچھی خوراک، اعتدال پسند ورزش اور مناسب نیند پر توجہ دیں۔ ہسپتال سے باہر صحت یابی کی مدت کے دوران، آپ کو ضرورت سے زیادہ سرگرمیوں سے گریز کرنا اور جسم کی آرام دہ حالت کو برقرار رکھنا چاہیے۔

زندگی گزارنے کی عادات کے علاوہ، مناسب نفسیاتی ایڈجسٹمنٹ بھی صحت اور یادداشت کو بحال کرنے میں مددگار ثابت ہوتی ہے۔ اپنے آپ کو آرام دیں، ایک پرامن دماغ برقرار رکھیں، اور اپنے آپ کو یادداشت کی بحالی میں ایڈجسٹ کرنے میں مدد کریں۔ اس کے ساتھ ساتھ، آپ کو تفریحی سرگرمیوں میں بڑھ چڑھ کر حصہ لینا چاہیے اور اپنے دماغ کو فعال رکھنے اور اپنی علمی اور یادداشت کی صلاحیتوں کو بہتر بنانے کے لیے رشتہ داروں اور دوستوں سے بات چیت کرنی چاہیے۔ اس سرگرمی کو بتدریج بڑھایا جا سکتا ہے اور بنیادی طور پر ہفتے میں ایک بار کیا جا سکتا ہے۔

مختصراً، سرجری کے بعد بحالی کے عمل کو ہر طرف توجہ کی ضرورت ہوتی ہے۔ اچھی زندگی کی عادات اور نفسیاتی ایڈجسٹمنٹ کو برقرار رکھنا جسمانی بحالی اور یادداشت کی بحالی کو فروغ دینے میں بہت اہم کردار ادا کرتا ہے۔ آئیے اس کا مثبت انداز میں سامنا کریں، پورے اعتماد اور امید کے ساتھ۔ ہمیں یادداشت کو بہتر بنانے کی ضرورت ہے، اور Cistanche deserticola نمایاں طور پر یادداشت کو بہتر بنا سکتا ہے، کیونکہ Cistanche deserticola نیورو ٹرانسمیٹر کے توازن کو بھی کنٹرول کر سکتا ہے، جیسے کہ acetylcholine کی سطح میں اضافہ اور ترقی کے عوامل۔ یہ مادے یادداشت اور سیکھنے کے لیے بہت اہم ہیں۔ اس کے علاوہ، گوشت خون کے بہاؤ کو بھی بہتر بنا سکتا ہے اور آکسیجن کی ترسیل کو فروغ دیتا ہے، جو اس بات کو یقینی بنا سکتا ہے کہ دماغ کو کافی غذائی اجزاء اور توانائی ملے، اس طرح دماغی قوت اور برداشت کو بہتر بنایا جا سکتا ہے۔

دماغی افعال کو بہتر بنانے کے طریقے جاننے پر کلک کریں۔

تمام طریقہ کار یونیورسٹی آف کینٹربری اینیمل ایتھکس کمیٹی کے منظور شدہ رہنما خطوط پر عمل کرتے ہیں۔ ریڈیل آرم میز (RAM) اور رن وے میں پری سرجری سے واقفیت کے بعد چوہوں کے چار گروپ بے ترتیب اسائنمنٹ کے ذریعے قائم کیے گئے تھے۔ چار گروپ دو طرفہ ATN گھاووں کے ساتھ تھے یا بدبو اور آبجیکٹ کے محرکات کے درمیان بغیر کسی نشان کے جب جوڑا بنانے والے ایسوسی ایٹ ٹاسک اور اسی طرح کے دو شمع گھاو گروپوں میں تربیت دی جاتی تھی۔

آخری نمونے کے سائز تھے (1) Sham-No Trace=7 (یعنی ایک شام-زخم گروپ جس میں بدبو اور اشیاء کے محرکات کے درمیان کوئی وقفہ نہیں ہے جو جوڑے سے وابستہ کام میں استعمال کیا جاتا ہے)؛ (2) Sham-Trace=7 (Shamlesion گروپ کو ایک 10-s ٹریس دیا گیا ہے بدبو کی پیشکش اور شے کے محرکات کے درمیان)؛ (3) ATN-کوئی ٹریس=8؛ اور (4) ATN-ٹریس=9۔ گھاووں کے معیار پر پورا نہ اترنے کی وجہ سے ایک اضافی ATN-lesion ratwas کو خارج کر دیا گیا (نیچے دیکھیں)۔

2.2|سرجری

چوہوں کو isoflurane (انڈکشن 4%؛ مینٹیننس 2.5%) کے ساتھ اینستھیٹائز کیا گیا اور ایک سٹیریوٹیکسک اپریٹس میں ایٹراومیٹک کان کی سلاخوں (Kopf, Tujunga, CA) کے ساتھ رکھا گیا۔ فارنکس کو پہنچنے والے نقصان کو کم کرنے کے لیے تھینسیسر بار کو انٹراورل لائن کے نیچے 7.5 ملی میٹر پر سیٹ کیا گیا تھا۔

ہر نصف کرہ میں، دو ادخال کو اینٹیرووینٹرل نیوکلئس (اے وی؛ اوپری اور نیچے) پر ہدایت کی گئی تھی، اور ایک انفیوژن تھیٹرومیڈیل نیوکلئس (AM) پر ہدایت کی گئی تھی۔ ہر سرجری میں انفرادی چوہے کے بریگما-لیمبڈا فاصلے (تمام قدریں inmm) کے مقابلے میں ایک غیر فعال anterior–posterior (AP) کوآرڈینیٹ استعمال کیا جاتا ہے۔ اے وی گھاووں کے لیے، اے پی کوآرڈینیٹ تھے: B–L 6.9–7.2 کے لیے 2.20؛ B–L 7.3 سے 7.6 کے لیے 2.25؛ 2.30 B–L کے لیے 7.7 سے زیادہ یا اس کے برابر۔ اے وی انفیوژن ڈیورا کے نیچے 5.68 اور 5.73 اور درمیانی لکیر سے 1.52 لیٹرل پر بنائے گئے تھے۔

TheAM انفیوژن {{0}}. اے وی کوآرڈینیٹ سے 1 ملی میٹر زیادہ پچھلا بنایا گیا تھا، ڈیورا سے 5.76 نیچے اور 1.16 لیٹرل؛ پہلا AM گھاو تمام AVinfusions کو مکمل کرنے کے بعد بنایا گیا تھا اور آخری AV گھاووں کی جگہ سے متضاد شروع ہوا تھا۔ 0.15 M N-methyl-d-aspartate (NMDA; Sigma, CastleHill, NSW) in 0.1 M فاسفیٹ بفر (pH 7.20) ہر سائٹ میں 0.04 ul فی منٹ کے ذریعے داخل کیا گیا 2.

اے وی سائٹسپر نصف کرہ نے ڈورسلینڈ وینٹرل سائٹس کے لیے بالترتیب {{0}.12 اور 0.10 ul حاصل کیے؛ ہر اے ایم سائٹ کے لئے 0.06 ul استعمال کیا گیا تھا۔ سرنج کی سوئی 3 منپر سائیڈ تک، پوسٹ انفیوژن تک برقرار رہی۔
شام کے زخموں کی سرجریوں میں بھی یہی طریقہ کار استعمال کیا گیا تھا، لیکن سوئی کو اوپری AV اور AM گھاووں والی جگہوں کے اوپر 1 ملی میٹر تک نیچے کر دیا گیا تھا جس میں کوئی فیوژن نہیں دیا گیا تھا۔

2.3|طرز عمل کے کام

آٹھ بازو کی RAM نے سرجری کے بعد ATN-lesion چوہوں میں مقامی یادداشت کی خرابی کی تصدیق کی۔ ایک رن وے اپریٹس کا استعمال چوہوں کو تمام غیر مقامی کاموں پر تربیت دینے کے لیے کیا گیا تھا، یعنی سادہ گند اور سادہ آبجیکٹ کی تفریق اور گند – آبجیکٹ اور گند – ٹریس – آبجیکٹ پیئرڈ ایسوسی ایٹ کام۔

سرجری سے پہلے، کھانے پر پابندی والے چوہوں کو آٹھ بازو کی RAM کی عادت ڈالی گئی تھی، جو ذیل میں بیان کی گئی ہے، تاکہ 0.1 جی چاکلیٹ کے ٹکڑوں کو بازیافت کیا جا سکے (Foodfirst LTD Auckland, NZ) اور بازو کے دروازوں کے کھلنے اور بند ہونے کے ساتھ موافقت کریں۔ ایک سرخ پرسپیکس رن وے (شکل 1) میں، چوہوں کی ناک میں ایک 2-سینٹی میٹر سرکلر سفید پلاسٹک کی ٹوپی تھی جو فرش کی سطح سے 10 سینٹی میٹر اوپر تھی اور ایک واضح پرسپیکس داخل پر ایک پتلی سپنج کے بیچ میں تھی جو اس کے ساتھ منسلک تھی۔ آخر دیوار.

انہیں دھکیلنے کے لیے بھی شکل دی گئی تھی (ناک یا پنجے کا استعمال کرتے ہوئے) ایک چیز جو اس کی بنیاد کے عقبی حصے میں کھانے کے کنویں کے اوپری حصے میں لگی ہوئی تھی جسے 5 8.5 3 سینٹی میٹر کے لکڑی کے بلاک کے مرکز میں رکھا گیا تھا۔ کھانے میں چاکلیٹ کے ٹکڑے تھے (اور ریسیس کے نیچے ناقابل رسائی کھانا رکھا گیا تھا)۔ پری ٹریننگ کے لیے استعمال ہونے والی چیز دوبارہ استعمال نہیں کی گئی۔ سرجری کے بعد، ریکوری چوہوں کو رام اور رن وے دونوں سے دوبارہ واقف کرایا گیا۔

2.4|رام میں مقامی ورکنگ میموری

سرجری کے بعد، بغیر کھڑکی والے کمرے (3 3 میٹر) کے بیچ میں واقع RAM کا استعمال کرتے ہوئے مقامی ورکنگ میموری کا تجربہ کیا گیا۔ بھولبلییا میں ایک سرمئی پینٹ شدہ لکڑی کا 35 سینٹی میٹر چوڑا مرکزی مرکز تھا جس میں آٹھ ایلومینیم بازو تھے (65 سینٹی میٹر لمبا 8.6 سینٹی میٹر چوڑا، 4.5 سینٹی میٹر اونچی سرحدوں کے ساتھ)، کمرے کے فرش سے 67.5 سینٹی میٹر بلند تھا۔ پرسپیکس کی صاف دیواریں (19 سینٹی میٹر لمبی اور 25 سینٹی میٹر اونچی) ہر بازو کے ایک طرف حب سے پھیلی ہوئی ہیں تاکہ چوہوں کو بازوؤں کے درمیان کودنے سے روکا جا سکے۔

ہر ایک بازو کے آخر میں لکڑی کے کھانے کا ایک سیاہ کنواں (5 8.5 3 سینٹی میٹر)، جس کے نیچے ناقابل رسائی کھانا تھا، ہر بازو کے آخر میں رکھا گیا تھا۔ جانچ کے دوران، ہر ایک کے شروع میں کھانے میں 2 0.1 جی چاکلیٹ کے ٹکڑے موجود تھے۔ مقدمے کی سماعت واضح Perspexguillotine دروازے، جو مرکز کے نیچے سے پللی سسٹم کے ذریعے اٹھائے جاسکتے ہیں، شوہر کے بازوؤں تک رسائی کو کنٹرول کرتے ہیں۔

RAM میں مسلسل دس دن کی باقاعدہ تربیت کا استعمال مقامی ورکنگ میموری کو جانچنے کے لیے کیا جاتا تھا۔ چوہے کو مرکزی مرکز میں رکھا گیا تھا، اور 10 سیکنڈ بعد، تمام آٹھ بازو کھول دیے گئے تھے، اور چوہے کو ایک انتخاب کرنے کی اجازت دی گئی تھی جس کی وضاحت بازو کی دہلیز پر دونوں پچھلی پاؤں کے طور پر کی گئی تھی۔ ایک بار جب چوہا بازو میں گھس گیا تو تمام دروازے بند کر دیے گئے اور اسے 15 سیکنڈ تک بازو تک محدود رکھا گیا چاہے اس نے صحیح انتخاب کیا ہو۔

چوہے کو واپس مرکزی مرکز میں جانے کی اجازت دی گئی اور 10 سیکنڈ تک وہاں رکھا گیا اس سے پہلے کہ تمام دروازے دوبارہ کھولے جائیں تاکہ بازو کے دوسرے انتخاب کی اجازت دی جا سکے۔ مقدمے کا اختتام اس وقت ہوا جب رتھڈ نے تمام آٹھ بازوؤں کا دورہ کیا، 20 بازو کے انتخاب کیے گئے تھے یا 10 منٹ گزر چکے تھے۔

2.5|غیر مقامی کام: سادہ امتیازی سلوک اور جوڑ کے ساتھ مل کر سیکھنا

سادہ تفریق اور جوڑ بنانے والے دونوں کاموں نے ایک ہی ریڈ پرسپیکس رن وے (93 26 26 سینٹی میٹر) کا استعمال کیا جو ایک 75- سینٹی میٹر اونچی میز پر رکھا گیا تھا (شکل 1)۔ رن وے کو تین عمودی طور پر ہٹنے والے دروازوں (ریڈ پرسپیکس، 26 26 سینٹی میٹر) سے تقسیم کیا جا سکتا ہے جنہیں مخصوص طرز عمل کی بنیاد پر منتخب کیا گیا تھا۔ جہاں تک واقفیت کا تعلق ہے، 6.5 6 8 ملی میٹر پتلا اسفنج جس کے مرکز میں ٹوپی ہے ایک چاکلیٹ فوڈ ریوارڈ (شکل 1)۔

اسفنج کو رن وے کے ایک ہٹنے کے قابل دروازے (جوڑے کے ساتھ منسلک کاموں کے لیے) یا رن وے کی آخری دیوار (سادہ امتیازی کام کے لیے) سے جوڑا گیا تھا۔ ہر بدبو کے لیے ایک مختلف ڈور پلس اسفنج استعمال کیا گیا تھا، جو 5 ملی لیٹر سورج مکھی کے تیل کے ساتھ ملایا گیا تھا جس میں نیوزی لینڈ کے مادہ کے 20 ul ضروری تیلوں کے ساتھ ملایا گیا تھا۔

بدبو لیموں اور لونگ تھی جوڑے کے ساتھی کاموں کے لیے، اور دار چینی اور چونا آسان امتیازی کاموں کے لیے، یا متوازن گروہوں میں الٹا۔ ہلکی اور بصری طور پر الگ الگ اشیاء (شکل 1) کو کھانے کے کنویں کے اوپر اس کی بنیاد کے عقب میں ایک قلابے کے ذریعے جوڑا گیا تھا تاکہ ایک چوہا کھانے کے انعام کے لیے کنویں کو تلاش کرنے کے لیے آسانی سے چیز کو پیچھے دھکیل سکے (یا تو ناک یا پنجا)۔

ایک لکڑی کا فریم (1.8 میٹر اونچا فرش سے 1.3 میٹر چوڑا)، کالے پردوں میں لپٹا، ٹیسٹنگ کے دوران مقامی اشارے کو کم کرنے کے لیے ٹیسٹ ایریا کے تمام اطراف میں بند۔

سادہ تفریق (صرف بدبو؛ صرف آبجیکٹ) اور جوڑے کے ساتھ منسلک کاموں میں 'go/no-go' طریقہ کار استعمال کیا گیا۔

ہر سیشن کے لیے پہلی آزمائش کا آغاز چوہے کو سٹارٹ ایریا میں 120 سیکنڈ کے لیے روک کر کیا گیا تاکہ تھیمز کے ساتھ دوبارہ ہم آہنگ ہو سکے۔ اس کے بعد کی آزمائشوں نے اس آغاز کے علاقے میں 20 سیکنڈ کا استعمال کیا۔ Allrats کو روزانہ سیشن میں 12 بڑے پیمانے پر ٹرائلز موصول ہوئے، جس میں چھگو (انعام) اور چھ نو-گوس (غیر انعام یافتہ) ٹرائلز بے ترتیب ترتیب میں تھے۔ ایک سیشن میں لگاتار تین سے زیادہ یا تین نو گو ٹرائل نہیں چلائے گئے۔

بدبو کے چار مختلف جوڑوں میں سے کوئی بھی - آبجیکٹ محرکات کو لگاتار آزمائشوں پر دہرایا نہیں گیا تھا۔ سادہ امتیازی کاموں میں درست آئٹمز اور جوڑے کے ساتھ منسلک کاموں میں صحیح محرک جوڑے کا مقابلہ مختلف تھا۔

سادہ بدبو کی تفریق کے لیے، تھیوڈورائزڈ اسفنج کے بیچ میں ٹوپی میں ناک کے پوک کے طور پر ایک ردعمل کی تعریف کی گئی تھی۔ صرف اسفنج کو سونگھنا ایک نہ جانے والا ردعمل سمجھا جاتا تھا۔ بو کے لیے سپنج کے مرکز میں ٹوپی میں کھانا ہمیشہ موجود رہتا تھا۔ یہاں go/no-go پہلو سے مراد یہ ہے کہ آیا شے کو یہ ظاہر کرنے کے لیے دھکیل دیا گیا تھا کہ آیا رن وے کے آخر میں کھانے کا انعام دیا گیا تھا۔

آبجیکٹ کے لیے، جواب کو ناک یا پنجے کے ساتھ کسی بھی دھکے کے طور پر بیان کیا گیا تھا جو آبجیکٹ کو پیچھے کی طرف جھکا دیتا ہے۔ اس وقت سے تاخیر جب آخری دروازہ اٹھایا گیا تھا اور جب چوہا بدبو کے ساتھ تعامل کرتا تھا (ٹوپی میں ناک ڈالنا؛ سادہ گند کی تفریق کے لیے) یا کسی چیز کے ساتھ (قبضے پر پیچھے دھکیل دیا گیا، سادہ آبجیکٹ کی تفریق اور جوڑ بنانے والے کاموں کے لیے) ایک پرسکون سٹاپ واچ (ڈک اسمتھ، نیوزی لینڈ) کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا۔

مبصر دروازے کو چلانے اور رویے کو ریکارڈ کرنے کے لیے پردے کے اندر اور رن وے سے ملحق بیٹھا تھا۔ ایک ٹرائل کو 'درست' کے طور پر نامزد کیا گیا تھا اگر چوہے نے گو ٹرائل پر 8 سیکنڈ سے کم میں جواب دیا یا بغیر گو ٹرائلز پر 8 سیکنڈ سے پہلے جواب نہیں دیا۔

2.6|سادہ امتیازات

چوہوں میں سے نصف نے سادہ گند کی تفریق کے کام کی تربیت حاصل کی جس کے بعد سادہ آبجیکٹ کی تفریق اور دوسرے نصف کے برعکس۔ ڈور X (شکل 1a) کے درمیان تاخیر اور رن وے کے آخر میں گند اور آبجیکٹ کے ساتھ تعامل ریکارڈ کیا گیا۔ چوہوں کو سادہ بدبو اور سادہ آبجیکٹ کے امتیازی کام پر تربیت دی جاتی تھی جب تک کہ وہ کسوٹی پر نہ پہنچ جائیں (مسلسل 2 دنوں میں 80٪ درست)۔

سادہ گند کے امتیازی کام کے لیے، ہر آزمائش پر ایک ہی گند پیش کیا گیا تھا۔ یہ تفریق کرنے کے لیے کہ دو بدبو میں سے کس کو کھانے کے انعام کے ساتھ جوڑا گیا تھا جو کمپارٹمنٹ B کے آخر میں سپنج میں پیش کیا گیا تھا (شکل 1a)۔

سادہ آبجیکٹ امتیازی کام میں، کمپارٹمنٹ B کے آخر میں ہر آزمائش پر ایک ہی چیز پیش کی گئی تھی (شکل 1 میں نہیں دکھایا گیا)۔ تھیراٹ کو یہ جاننا تھا کہ دو اشیاء میں سے کس چیز کو کھانے کے انعام کے ساتھ جوڑا گیا تھا جس کے تحت آبجیکٹ کے نیچے پیش کیا گیا تھا۔

2.7|پیئرڈ ایسوسی ایٹ ٹاسکس (ٹریس اور نو-ٹریس) ان کاموں میں عمودی طور پر ہٹائے جانے والے دروازوں کی ایک نئی ترتیب استعمال کی گئی ہے (شکل 1)۔ چوہوں نے سیکھا کہ دو بدبو میں سے کون سی اشیاء کی جوڑی کو انعام دیا جائے گا (جیسے گند 1 + آبجیکٹ اے اور اوڈور 2 + آبجیکٹ بی) اور کون سی جوڑی کو انعام نہیں دیا گیا (یعنی گند 1 + آبجیکٹ بی اور گند 2 + آبجیکٹ A)۔

جوڑی سے قطع نظر، رن وے کے دوسرے کمپارٹمنٹ میں جانے کی اجازت دینے پر چوہوں کو ہمیشہ بدبو کی پیشکش کا انعام ملتا تھا۔ یہ 'نو-ٹریس' حالت کے لیے کمپارٹمنٹ C تھا جس میں کمپارٹمنٹ A استعمال نہیں کیا گیا تھا اور کمپارٹمنٹ B اسٹارٹ کمپارٹمنٹ تھا۔ بدبو 'ٹریس' کی حالت کے لیے کمپارٹمنٹ B کے آخر میں تھی، جس کے لیے کمپارٹمنٹ A کو اسٹارٹ باکس کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔

ٹریس کی حالت میں چوہوں کو کمپارٹمنٹ C میں رکھ کر بدبو اور آبجیکٹ کے محرکات کے درمیان 10- تاخیر کا سامنا کرنا پڑا، جبکہ بغیر ٹریس کنڈیشن میں چوہوں کو بدبو کے ساتھ تعامل کے فوراً بعد شے کے سامنے لایا گیا (بعد میں انعام کا کھانا)۔ ٹریس اور بغیر ٹریس دونوں حالتوں میں، ہم نے کمپارٹمنٹ ڈی کو عبور کرنے میں تاخیر ریکارڈ کی، جب سے دروازہ اٹھایا گیا جب تک کہ چوہا کسی چیز کے ساتھ بات چیت نہ کرے یا 8 سیکنڈ تک اس کے ساتھ بات چیت کرنے سے باز رہے۔

ریٹس کے دو گروپس (شام-زخم اور اے ٹی این-زخم) کو تھیوڈور – آبجیکٹ پیئرڈ ایسوسی ایٹ ٹاسک (کوئی ٹریس گروپس) پر تربیت دی گئی تھی اور دو متعلقہ گروپوں کو تھیوڈور – ٹریس – آبجیکٹ پیئرڈ ایسوسی ایٹ ٹاسک (ٹریس گروپس) پر تربیت دی گئی تھی جب تک کہ وہ معیار تک پہنچ گئے (3 دن میں 80% درست ٹرائلز) یا زیادہ سے زیادہ 50 دن۔

2.8|حصول کے بعد برقرار رکھنے کا ٹیسٹ

کسی بھی چوہے کے لئے جوڑ بنانے والے ساتھی کام کو برقرار رکھنا معیار تک پہنچنے کے 5 دن بعد یا 50 دن کی تربیت کے بعد کیا گیا تھا۔ اس سیشن میں ایک ہی دن میں 12 بڑے پیمانے پر انعام یافتہ/غیر انعامی ٹرائلز کا استعمال کیا گیا جیسا کہ اس چوہے کے لیے پہلے استعمال کیا گیا تھا۔

2.9|ہسٹولوجی

2.9.1|پرفیوژن اور ٹشو جمع کرنا

برقرار رکھنے کے ٹیسٹ سے 3 دن پہلے، ایک چوہوں کو ایک اندھیرے والے کمرے میں 90 منٹ کے لیے خالی صاف پنجرے سے آشنا کیا گیا تھا۔ تھریٹینشن ٹیسٹ کے آخری ٹرائل کے فوراً بعد، چوہے کو پرفیوژن سے 90 منٹ پہلے واقف تاریک خاموش کمرے میں اس کے پنجرے میں رکھا گیا۔

چوہوں کو سوڈیم پینٹوباربیٹل (125 ملی گرام/کلوگرام) کے ساتھ گہرائی سے بے ہوشی کی گئی اور دماغ کو ٹھیک کرنے کے لیے سیلائن کے بعد پیرافارملڈہائیڈ [4% PFA in 0.1 M فاسفیٹ بفر (PB)] کے ساتھ ٹرانسکارڈیلی طور پر پرفیوز کیا گیا۔ دماغ کو 4% PFA میں بعد میں طے کیا گیا جس کے بعد ایک طویل مدتی حل میں کم از کم 48 گھنٹے (20% گلیسرول 0.1 M PB میں)۔ کورونل 40-μm حصوں کو فریزنگ مائیکروٹوم (تھرمو فشر، یو کے) کا استعمال کرتے ہوئے اکٹھا کیا گیا اور ایک کریو پروٹیکٹنٹ محلول (30% گلیسرول، 30% ایتھیلین گلائکول 0.1 M PB میں) میں 20 C پر محفوظ کیا گیا جب تک کہ امیونو ہسٹو کیمسٹری کے لیے پروسیس نہ ہو جائے۔

کورونل حصوں کو دو الگ الگ سیریز میں جمع کیا گیا تھا۔ پہلی سیریز نے امیونو ہسٹو کیمسٹری (یعنی پانچ میں سے ایک) کے لیے پانچ cryovials میں لگاتار حصوں کو حاصل کیا۔ اس سلسلے میں پریفرنٹل کورٹیکس سے سیپٹل ایریا تک حصوں کا ایک پچھلا بلاک (تقریباً {{0}.7 سے 0.6 ملی میٹر بریگما) اور میڈیوڈورسل تھیلامس (بریگما سے تقریباً 3.5 ملی میٹر) کاڈل تک ایک پچھلا بلاک شامل تھا۔ retrosplenial cortex.

دوسری سیریز نے گھاووں کی تصدیق کے لیے لگاتار حصوں کو حاصل کیا۔ یہ حصے ATN کے فوراً پچھلے حصے سے لے کر پوسٹرئیر میڈیوڈورسل تھیلامس تک (تقریباً 0.6 سے 3.5 ملی میٹر بریگما) میں جمع کیے گئے تھے۔

2.9.2|Neu-N سٹیننگ اور ATN-lesion Verification

پورے اے ٹی این ریجن میں فری فلوٹنگ سیکشنز کو 30 کے لیے اینڈوجینس پیرو آکسیڈیز بلاک کرنے والے بفر میں انکیوبیشن سے پہلے 0.1 M فاسفیٹ بفرڈ نمکین کے ساتھ ٹریٹن-X (0.2%؛ PBSTx) میں دھویا گیا (3 10 منٹ) کم از کم [1% ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ (H2O2)، 50% میتھانول (CH3OH) 2%PBSTx میں]۔

سیکشنز کو راتوں رات 4 C inanti-NeuN پرائمری اینٹی باڈی (1:5000؛ monoclonal-MouseCat # MAB377؛ ملی پور، کیلیفورنیا USA) PBSTx میں 1٪ نارمل گوٹ سیرم (NGS؛ لائف ٹیکنالوجیز، NZ) کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔

اضافی اینٹی باڈی بفر کو PBSTx کے ساتھ ہٹا دیا گیا تھا اور اس کے بعد بایوٹینیلیٹڈ بکری اینٹی ماؤس سیکنڈری اینٹی باڈی (1:1000 Cat# BP-9200-50: VectorLaboratories، California USA) میں راتوں رات 4 C پر PBSTx اور 1% NGS میں انکیوبیشن کی گئی تھی۔ حصے کمرے کے درجہ حرارت پر 2 گھنٹے کے لیے ExtrAvidin (peroxidase conjugated؛ 1:1000؛ Sigma، NSW Australia)، PBSTx اور 1% NGS میں رکھے گئے تھے۔

اضافی ExtrAvidin اور Triton X{{0}} کو ہٹانے کے لیے، حصوں کو PBS، PB، اور پھر Tris بفر (pH 7.4 in distilled H20) میں دھویا گیا تاکہ سیکشنز کو ویژولائزیشن کے لیے تیار کیا جا سکے۔ DAB 0.05%؛ سگما، Tris بفر میں 0.01% H2O2 میں)۔

DAB ردعمل (تقریباً 5 منٹ) Tris بفر (1 10 منٹ واش) کا استعمال کرتے ہوئے روک دیا گیا تھا، اور سیکشنز کو راتوں رات PB at4 C میں جیلیٹائزڈ سلائیڈوں پر چڑھنے سے پہلے رکھا گیا تھا اور خشک ہونے کی اجازت دی گئی تھی۔ انکسائلین کو صاف کرنے اور ڈی پی ایکس (06522؛ سگما-الڈرچ) اور ایک کور سلپ کے ساتھ نصب ہونے سے پہلے سلائیڈز کو تھرو گریڈ شدہ الکحل (70%–100%) سے پانی کی کمی کی گئی تھی۔

ATN میں Neu-N-مثبت خلیوں کی تعداد کو زخم کی حد کا تعین کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ اس نے پورے ATN میں چار40-μm حصوں میں سے ہر ایک کے لیے بائیں اور دائیں نصف کرہ دونوں کے حصے استعمال کیے اور ImageJ (NIH, USA) کا استعمال کرتے ہوئے مقدار کا تعین کیا گیا۔ LeicaDM6 B سیدھے مائکروسکوپ اور DFC7000T کیمرہ (لائیکا مائیکرو سسٹم، جرمنی) پر NeuN- مثبت سیل اسٹیننگ کی تصویر 5 مقاصد پر لی گئی۔

خلیوں کی خودکار گنتی امیج جے (تصویری تجزیہ سافٹ ویئر، نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ، NIH، USA) کے ذریعے حاصل کی گئی تھی۔ اے ٹی این کے علاقے میں نیوران کے ارد گرد کے علاقے کو دستی طور پر منتخب کیا گیا تھا اور تصاویر کو {{0}} بٹ گرے اسکیل میں تبدیل کیا گیا تھا، پس منظر کو گھٹا دیا گیا تھا (رولنگ=40)، ماسک میں تبدیل کیا گیا تھا اور واٹرشیڈ فنکشن کو لاگو کیا گیا تھا، اور دہلیز سے اوپر کے تمام نیورونل سیل ('میکس اینٹروپی' تھریشولڈ، سرکلرٹی 0.5–1.0) شمار کیے گئے تھے۔

پتہ لگانے کی حد تمام سیکشنز کے لیے یکساں تھی۔ ATN میں سیل کاؤنٹ ظاہر کرنے کے لیے سیلوں کے خودکار NeuN-داغ دار نیوکلی کو شام چوہوں میں سے نو میں شمار کیا گیا تھا (پانچ Sham-Trace گروپ میں اور چار Sham-No Trace گروپ میں)۔

تمام ATN-زخم والے چوہوں میں بچ جانے والے خلیوں کے NeuN-stainednuclei کی خودکار گنتی کا موازنہ شمع چوہوں میں مشاہدہ کیے جانے والے NeuN خلیوں کی اوسط گنتی سے کیا گیا۔ قابل قبول گھاووں کی تعریف ATN میں خلیات کے 50% نقصان کے معیار تک پہنچنے کے طور پر کی گئی تھی، کم از کم 25% فی نصف کرہ۔ یہ پچھلے مطالعات میں ATN-lesion کے معیار کے مطابق ہے (Mitchell & Dalrymple-Alford, 2005, 2006; Perryet al., 2018)۔

2.9.3|Zif268 امیونو ہسٹو کیمسٹری

فری فلوٹنگ سیکشنز پر اسی طرح عمل کیا گیا جیسا کہ NeuN کے لیے، لیکن خرگوش پولی کلونل Zif268 پرائمری اینٹی باڈی (Egr-1; 1:1000 Cat# sc-110; Santa CruzBiotechnology, USA) میں 72 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ 1% NGS کے ساتھ PBSTx میں 4 C، اس کے بعد PBSTx اور 1% NGS میں راتوں رات بایوٹینیلیٹڈ بکری اینٹی ریبٹ سیکنڈری اینٹی باڈی (1:1000: ویکٹر لیبارٹریز بی اے-1000) میں انکیوبیشن۔

ڈی اے بی ویژولائزیشن (18 منٹ) کے بعد، دلچسپی کے ہر علاقے میں زیف268-مثبت سیل سٹیننگ کو ہلکے خوردبین (لائیکا، جرمنی) کے ساتھ 10 مقصد کے ساتھ تصویر کشی کی گئی تھی۔ NIH، USA) اسی انداز میں NeuNpositive خلیات کی طرح، ماسوائے سرکلرٹی کو 0.65–1.0 پر سیٹ کیا گیا تھا۔

تمام خطوں کے لیے Zif268-مثبت خلیات کی تعداد نے ایک ہی تھریشولڈ الگورتھم کا استعمال کیا، جس میں ہر چوہے کی دلچسپی کے دو سے چھ حصے کے درمیان مقدار طے کی گئی۔ اوسط Zif268-مثبت سیل کی گنتی فی mm2 تمام حصوں میں (دونوں نصف کرہ سے) دلچسپی کے علاقے میں استعمال کیا گیا تھا۔

2.10|ڈیٹا کا تجزیہ

ANOVA Statistica (v13; Dell Inc.) کا استعمال کرتے ہوئے چوہوں کے چار گروپوں (Sham-No Trace, Sham-Trace, ATN-No Trace اور ATNTrace) میں درمیانی فرق کو جانچنے کے لیے کیا گیا تھا۔ دہرائے جانے والے اقدامات کے عوامل دنوں کے لیے شامل کیے گئے (RAM اور سادہ امتیاز)، ٹرائلز کے بلاکس (جوڑا بنانے والے کام)، اور Zif268 متعلقہ علاقوں یا دلچسپی کے ذیلی علاقوں میں شمار کیے گئے۔

RAM اور سادہ امتیازی کاموں دونوں کے لیے انووا نے چار گروپوں کا موازنہ کیا تاکہ اس بات کی تصدیق کی جا سکے کہ دو Sham-lesion اور دوATN-lesion گروپ ایک دوسرے کے ساتھ مطابقت رکھتے تھے، لیکن نوٹ کریں کہ RAM یا سادہ امتیازی کاموں میں کوئی ٹریس جزو نہیں تھا۔ رن وے میں سادہ تفریق اور جوڑ بنانے والے دونوں کاموں کے لیے، انفرادی ٹرائلز میں لیٹنسی ڈیٹا کی باہمی تبدیلی کو تغیر کی یکسانیت کو یقینی بنانے کے لیے استعمال کیا جاتا تھا۔

کسی بھی ٹیسٹ کے دن، تبدیل شدہ تاخیر نے چھ غیر انعام یافتہ ٹرائلز اور چھ انعام یافتہ ٹرائلز میں سے ہر ایک کے لیے اوسط تاخیر پیدا کی۔ سادہ امتیازی کاموں کے لیے، ہم نے درمیانی تاخیر کے فرق کے اسکور کا تجزیہ کیا (ثواب یافتہ ٹرائلز کی اوسط مائنس اس کے بعد انعام یافتہ ٹرائلز کی اوسط) لیکن ڈیٹا اسٹوریج کی ناکامی کی وجہ سے الگ الگ انعام یافتہ اور غیر انعام یافتہ ٹرائلز کا نہیں۔

تینوں تاخیر کے اقدامات جوڑ بنانے والے ساتھی میموری کاموں (غیر انعام یافتہ ٹرائلز، انعام یافتہ ٹرائلز اور تاخیر کا فرق) کے لیے دستیاب تھے۔ متعدد موازنہوں کا حساب کتاب کرنے اور قسم I اور قسم II کی غلطیوں کو متوازن کرنے کے لیے، ہم نے رویے کے تجزیوں کے لیے p < 0.02 کی اہمیت کی سطح کا استعمال کیا کیونکہ جوڑے کے ساتھ منسلک کام میں تین متعلقہ اقدامات تھے (غیر انعام یافتہ ٹرائلز، انعام یافتہ ٹرائلز اور مطلب تاخیر کا فرق)۔

Zif268 اظہار کے لیے دلچسپی کے علاقوں کے لیے چھ بنیادی تجزیے تھے، ان تجزیوں میں اہمیت p < 0.01 پر رکھی گئی تھی۔ پوسٹہاک نیومین – کیولس (این کے) ٹیسٹوں نے جوڑے کے لحاظ سے گروپ اختلافات کا اندازہ کیا۔ سادہ اہم اثرات کا تجزیہ اس وقت استعمال کیا گیا جب بار بار اقدامات کے عوامل پر مشتمل اہم تعاملات تھے۔

3|نتائج

3.1|زخم کی تصدیق

ATN کے زخموں والے 18 چوہوں میں سے ایک کے علاوہ باقی تمام نے ATN کو 50% دو طرفہ نقصان اور کم از کم 25% فی نصف کرہ کے بنیادی معیار کو پورا کیا۔ درمیانی دو طرفہ نقصان دونوں ATN-lesion گروپوں میں 76% تھا (حد: ATN-No Trace, 61%–93%; ATN-Trace, 63%–93%; شکل 2)۔ خارج کیے گئے چوہے میں صرف ایک نصف کرہ میں تسلی بخش زخم تھا (48% کل، 75% بائیں اور 20% دائیں)۔

شکل 2d سے پتہ چلتا ہے کہ ATN نیورون کے لیے NeuN کا شمار ATN-lesion چوہوں (M=3388, SD=2024) میں پائی جانے والی قدروں سے بالکل نیچے تھے (M=15، 339، SD=1065؛ یہ شمار ایسے ہی تھا جس کی اطلاع فراسٹ ایٹ ال، 2020 کے ذریعے دی گئی تھی)۔ 17 چوہوں میں سے آٹھ (4 ٹریس گروپ میں اور چار نو-ٹریس گروپ میں) کو میڈیوڈورسل تھیلامس (MD) یا ری یونینز/رومبائڈ (Re/Rh) نیوکلی کو کوئی نقصان نہیں پہنچا تھا، اور نسبتاً کم نقصان ہوا تھا۔ یہ ڈھانچے باقی نو چوہوں میں زخموں کے ساتھ۔

جب MD کو نقصان پہنچا تو یہ پچھلے پہلوؤں میں تھا جو ATN سے متصل تھا۔ لہذا، بریگما سے تقریباً {{0}.72 سے +2.10 ملی میٹر تک MD نقصان کا اندازہ لگایا گیا، جہاں یہ پورے خلیات کے 0% سے 41% کے نقصان کے درمیان تھا۔ گروپ (میڈین=21%)۔ جب Re/Rh کو نقصان ہوا، تو یہ ATN خطے سے بھی ملحق تھا، اس لیے اس کا اندازہ بریگما سے تقریباً 1.08 سے 2.04 ملی میٹر تک لگایا گیا، جہاں یہ 0% سے 33% (میڈین=6%) کے درمیان تھا۔ نوٹ کریں کہ یہ صد صد قدریں پورے MD اور Re/Rhregions کی نمائندگی نہیں کرتی ہیں، کیونکہ تمام ATN-lesion چوہوں میں دونوں نیوکللی کے پچھلے حصے برقرار تھے۔

For more information:1950477648nn@gmail.com