joanna.jia@wecistanche.com/ واٹس ایپ: 008618081934791

IL-22- نے گردے کی چوٹ کے علاج کے لیے PFKFB3 کے ذریعے رینل میٹابولک ری پروگرامنگ کی ثالثی کی

وی چن، وغیرہ

گرافیکل خلاصہ

IL-22 کو کم کرتا ہے۔گردہچوٹرینل TECs کی میٹابولک ری پروگرامنگ کے ذریعے، خراب TECs میں مائٹوکونڈریل فنکشن اور گلائکولائسز کو منظم کرتا ہے، اور AMPK/AKT اور PFBFK3 سرگرمیوں کی شمولیت کے ذریعے مائٹوکونڈریل ROS اور غیر فعال مائٹوکونڈریا کے جمع ہونے کو کم کرتا ہے۔ بہتری لانے والاگردہچوٹofIL-22 میٹابولزم کے ریگولیشن کے ذریعے متعلقہ سگنلنگ سسپلٹین سے متاثرہ گردے کے نقصان اور ذیابیطس نیفروپیتھی جانوروں کے ماڈلز میں تصدیق شدہ ہے۔

خلاصہ

گردے کا نقصان ٹیوبول سیلز میں بگڑتی ہوئی میٹابولک حالتوں کا آغاز کرتا ہے جو اختتامی مرحلے کے گردوں کی بیماری (ESTD) کی نشوونما کا باعث بنتی ہے۔ Interleukin-22 (IL- 22) ایک مؤثر علاج کا تریاق ہےگردہچوٹگردے کی بحالی کو فروغ دینے کے ذریعے، لیکن بنیادی مالیکیولر میکانزم کے بارے میں بہت کم معلوم ہے۔ یہاں، ہم سب سے پہلے ثبوت فراہم کرتے ہیں کہ IL-22 کم ہوتا ہے۔گردہچوٹرینل ٹیوبلر اپیٹیلیل سیلز (TECs) کی میٹابولک ری پروگرامنگ کے ذریعے۔ خاص طور پر، ہمارا ڈیٹا تجویز کرتا ہے کہ IL-22 خراب TECs میں مائٹوکونڈریل فنکشن اور گلائکولائسز کو منظم کرتا ہے۔ مزید مشاہدات سے پتہ چلتا ہے کہ IL-22 AMPK/AKT سگنلنگ اور PFBFK3 سرگرمیوں کی شمولیت کے ذریعے مائٹوکونڈریل ری ایکٹیو آکسیجن پرجاتیوں (ROS) اور غیر فعال مائٹوکونڈریا کے جمع ہونے کو کم کرتا ہے۔ چوہوں میں، کی بہتریگردہچوٹاور ان میٹابولزم متعلقہ سگنلنگ کے ریگولیشن کے ذریعے گردے کے افعال کی نیکروسس اور بہتری اور ریکومبیننٹ IL-22 کی مائٹوکونڈریل فٹنس سسپلٹین سے متاثرہ گردے کے نقصان اور ذیابیطس نیفروپیتھی (DN) جانوروں کے ماڈلز میں تصدیق شدہ ہیں۔ ایک ساتھ مل کر، ہماری دریافتیں گردے پر IL-22 کے حفاظتی اثرات کے بارے میں نئی ​​میکانکی بصیرت کو کھولتی ہیں اور IL-22 کے علاج کے مواقع اور گردے کی مختلف بیماریوں میں ملوث میٹابولک ریگولیٹرز کو اجاگر کرتی ہیں۔

مطلوبہ الفاظانٹرلییوکن-22،گردہچوٹ، میٹابولک ری پروگرامنگ، مائٹوکونڈریل dysfunction

Cistanchetubulosaگردے کی بیماری کو روکتا ہے، نمونہ حاصل کرنے کے لیے یہاں کلک کریں۔

1. تعارف

شدیدگردہچوٹ(AKI)، صحت عامہ کی ایک عام تشویش جو کہ زیادہ اموات اور بیماری سے منسلک ہے، دنیا بھر میں ہسپتال میں داخل لاکھوں مریضوں کو متاثر کرتی ہے اور تیزی سے بڑھتے ہوئے واقعات کو ظاہر کرتی ہے۔ نلی نما اپکلا خلیات (TECs)، خاص طور پر proximal tubule میں۔ 4–7 متعدد قسم کے لٹریچر اس بات کی حمایت کرتے ہیں کہ ان کا شدید اور مستقل نقصان اکثر نامکمل اور خراب ٹشووں کی مرمت کا سبب بنتا ہے، جس کے نتیجے میں سوزشی ردعمل، نلی نما انحطاط، گردے کی فبروسس، اور بالآخر بڑھنے کا سبب بنتا ہے۔ آخری مرحلے کے گردوں کی بیماری (ESTD)۔8–10 بدقسمتی سے، ڈائیلاسز پر مبنی معاون دیکھ بھال کے علاوہ، اس کے لیے کوئی اچھی طرح سے قائم شدہ علاج نہیں ہے۔گردہچوٹدستیاب ہیں. لہذا، مریضوں کو ہونے والی تکلیف اور اس کے اہم مالی بوجھ کو کم کرنے کے لیے فعال علاج کی بہت ضرورت ہے۔گردہچوٹافراد اور معاشرے کے لیے۔

Interleukin-22 (IL-22)، IL-10 فیملی سائٹوکائنز کا ایک اہم رکن، نے حال ہی میں اپکلا کو پہنچنے والے نقصان سے پیدا ہونے والے متعدد عوارض میں بقا کے ایجنٹ کے طور پر زبردست توجہ مبذول کروائی ہے۔ 11–13 IL -22 بنیادی طور پر STAT3 سگنلنگ پاتھ وے کو چالو کرنے اور اپکلا پھیلاؤ کو فروغ دینے کے ذریعے بافتوں کے تحفظ اور ہومیوسٹاسس کو ظاہر کرتا ہے۔ ، اور IL-22 کے ساتھ علاج گردوں کے اپکلا کی چوٹ سے بچا سکتا ہے اور نلی نما تخلیق کو تیز کر سکتا ہے۔گردہچوٹIL- 22-حوصلہ افزائی TECs کی بازیابی کے بنیادی میکانزم کے بارے میں بہت کم معلوم ہے۔ IL-22 کی مالیکیولر بنیاد کو سمجھنا اس بات کی کھوج کے لیے کہ IL-22 کس طرح AKI یا ESTD کو روکنے کے لیے کام کرتا ہے اور مالیکیولر موڈیفائرز کے ساتھ ساتھ گردے کو پہنچنے والے نقصان کو روکنے میں اہم عمل کی دریافت کے لیے بھی اہم ہے۔

نقصان کے بعد گردے کی مرمت میٹابولک طور پر منحصر اور پیچیدہ عمل ہے۔ 18 حالیہ شواہد سے پتہ چلتا ہے کہ سیل میٹابولک دستخط گردوں کے خلیوں کی بقا اور پلاسٹکٹی کو منظم کر سکتے ہیں اور اس طرح مفید میکانکی بصیرت فراہم کرتے ہیں کہ کس طرح میٹابولک عمل ٹشو کی مرمت کو کنٹرول کرتے ہیں۔ 19,20 خاص طور پر، یہ نتائج یہ ظاہر کریں کہ PGC1 یا S-nitroso-CoA ریڈکٹیس سسٹم کے ذریعے میٹابولک ری پروگرامنگ اس سے حفاظت کرتا ہے۔گردہچوٹ. میکانکی طور پر، بڑھی ہوئی گلائکولیسس اور آکسیڈیٹیو فاسفوریلیشن (OXPHOS) نمو اور دفاعی سگنلنگ کے راستوں کو فروغ دے سکتی ہے یا اعضاء کی مرمت کے دوران mitosis اور anabolic biosynthesis کے اعلیٰ توانائی بخش تقاضوں کو پورا کر سکتی ہے۔ جگر میں mitochondrial dysfunction، جس میں سیلولر میٹابولک عمل شامل ہوتا ہے۔ 22,24 اس طرح، ہم پوچھتے ہیں کہ آیا IL-22 ان کی میٹابولک حالتوں کو ریگولیٹ کرنے کے ذریعے گردے کو پہنچنے والے نقصان اور اپوپٹوسس سے بچاتا ہے۔ IL-22 ثالثی گردے کی مرمت کے طریقہ کار کا تعین کرنے کے لیے، ہم انسانی قربت والے نلی نما اپیتھیلیل سیلز (PTECs) کا تناؤ کے محرک کے ساتھ علاج کرتے ہیں۔ ہم تجویز کرتے ہیں کہ IL-22 میٹابولک ری پروگرامنگ کو گلائکولائسز اور OXPHOS کو بڑھانے کے لیے چلاتا ہے، جو TECs کی خرابی کو روکتا ہے۔ ہم مزید یہ بھی ظاہر کرتے ہیں کہ IL-22 نے اس پروگرام کو AMPK/AKT سگنلنگ کی ایکٹیویشن اور اس کے مالیکیولر موڈیفائرز کے ذریعے مائٹوکونڈریل dysfunction کو دور کرنے کے لیے آمادہ کیا۔ ہمارے مشاہدات گردے کی بیماریوں کے علاج اور روک تھام کے لیے میٹابولک حالتوں کو ریگولیٹ کرنے پر روشنی ڈالتے ہیں اور عام طور پر اعضاء کی چوٹ کے لیے موثر نئی مداخلتوں کو تیار کرنے کے لیے نئی بصیرت فراہم کرتے ہیں۔

Cistanche علاج کر سکتے ہیںگردہچوٹ

2. مواد اور طریقہ

2.1 ریجنٹس

Oligomycin، rotenone، اور cyanide p-trifluoromethoxy phenyl-hydrazone (FCCP) سی ہارس بائیو سائنسز سے حاصل کیے گئے تھے۔ ریکومبیننٹ IL-22 Novoprotein (چین) کے ذریعہ فراہم کیا گیا تھا؛ cisplatin (Crisp.), MitoTrackerGreen, LY294002, 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanineiodide (JC-1)، اور حاصل کیے گئے تھے۔ بیو ٹائم بائیو ٹیکنالوجی (چین) سے؛ Glut1، -Actin، p-AMPK، AMPK، اور GAPDH کو نشانہ بنانے والے اینٹی باڈیز Abcam سے خریدے گئے تھے۔ STAT3, p-STAT3 (Y705), AKT, p-AKT (S473), PFKFB3، اور Caspase-3 کے لیے اینٹی باڈیز سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی سے خریدے گئے تھے۔ rapamycin، palmitic acid (Palm.)، Z-VAD-FMK اور گلوکوز سگما-الڈرچ سے حاصل کیے گئے تھے۔ MitoSOX، Hoechst33342، MitoTracker Red، اور PKH26 Invitrogen سے حاصل کیے گئے تھے۔

2.2 سیل کلچر

ہیومن پروکسیمل ٹیوبول اپیتھیلیل سیل (HK{{0}}) سیل بینک آف شنگھائی انسٹی ٹیوٹ آف بائیو کیمسٹری اینڈ سیل بیالوجی، چائنیز اکیڈمی آف سائنسز سے حاصل کیا گیا تھا، اور اسے مندرجہ ذیل معیاری پروٹوکول کو برقرار رکھا گیا تھا۔ HK-2 کو چھ کنویں پلیٹوں (1 × 106 سیل/کنویں) یا 96-کنویں پلیٹوں (1 × 105 سیل/کنویں) میں سیڈ کیا گیا تھا اور 90 فیصد RPMI1640 میڈیم (Gibco) میں 100 U/ml پینسلن، 100 µg/ml streptomycin، اور 10 فیصد فیٹل بووائن سیرم (FBS) (Gibco) کے ساتھ ضمیمہ۔ ہم نے پہلے HK-2 کو IL-22 (0.5 µg/ml) کے ساتھ 0.5 h کے لیے، پھر 50 mM d-glucose یا 5 µg/ml cisplatin یا 0.2 mM palmitic acid یا 4 µM doxorubicin (DOX) 24 گھنٹے کے لیے۔ بعض صورتوں میں، خلیوں کو Z-VAD-FMK (10 µM)، کمپاؤنڈ C (5 µM)، LY294002 (20 µM)، یا rapamycin (50 nM) کی موجودگی میں اشارہ شدہ اوقات کے لیے کلچر کیا گیا تھا۔

2.3 سمندری گھوڑوں کے تجربات

ہم نے ایکسٹرا سیلولر ایسڈ ریٹ (ECAR) اور آکسیجن کی کھپت کی شرح (OCR) میں تبدیلیوں کے لیے Seahorse XF96 Extracellular Flux-Analyser کا استعمال کرتے ہوئے TECs کا تجزیہ کیا۔ مختصراً، HK-2 (1 × 105) کو راتوں رات 96-کنویں سی ہارس پلیٹوں پر اگایا گیا۔ اس کے بعد، ہم نے سیل کو سی ہارس پرکھ کے میڈیم سے دھویا جس میں 1 mM پائروویٹ، 10 mM گلوکوز، اور 2 mM گلوٹامین (یا ECAR کی جانچ کے لیے گلوکوز فری) CO2 کے بغیر فضا میں 37◦C پر {{18} }}.5 گھنٹے تجرباتی ڈیٹا کو FCCP (10 µM)، oligomycin (1.0 µM)، rotenone/antimycin A (0.5 µM)، 2-DG (50 µM) کے زیادہ سے زیادہ ارتکاز میں زیر ذکر روکنے والوں کو انجیکشن کرنے کے بعد ریکارڈ کیا گیا۔ ایم ایم)، یا گلوکوز (10 ایم ایم)۔

Cistanche علاج کر سکتے ہیںگردے کی چوٹ

2.4 چوہوں اور جانوروں کے ماڈل

نر BALB/c چوہے (6–8 ہفتے) Slaccas Experimental Animal Co. (شنگھائی، چین) سے خریدے گئے تھے۔ Db/db اور Db/m چوہوں کو نانجنگ یونیورسٹی (نانجنگ، چین) کے ماڈل اینیمل ریسرچ سینٹر نے فراہم کیا تھا۔ تمام چوہوں کو مخصوص پیتھوجین فری (ایس پی ایف) سہولیات میں رکھا گیا تھا اور معیاری پروٹوکول کے بعد اگایا گیا تھا۔ AKI ماڈل کے لیے، BALB/c چوہوں نے cisplatin (20 mg/kg) یا intraperitoneal انجیکشن کے ذریعے نمکین کنٹرول حاصل کیا۔ Db/db چوہوں کو ذیابیطس نیفروپیتھی (DN) کی حوصلہ افزائی کے لیے مقررہ وقت پر زیادہ چکنائی والی خوراک (HFD) کھلائی گئی۔ ڈی بی / ایم چوہوں کو کنٹرول گروپ کے طور پر چاؤ ڈائیٹس کھلایا گیا۔ AKI جانوروں کے تجربات میں، IL-22 کو لگاتار 4 دنوں تک 0.5 mg/kg/day یا 1.5 mg/kg/day کی خوراک پر intraperitoneally انجکشن لگایا گیا تھا۔ DN جانوروں کے تجربات میں، IL-22 کو لگاتار آٹھ ہفتوں تک ہفتہ میں دو بار 2.5 mg/kg کی خوراک پر انٹراپریٹونلی انجیکشن لگایا گیا۔ کنٹرول چوہوں نے پی بی ایس کی مناسب مقدار حاصل کی۔ ہمارے جانوروں کے تجرباتی طریقہ کار کو ان پروٹوکولز کے بعد انجام دیا گیا جس کا جائزہ لیا گیا اور جو کہ سکول آف فارمیسی، فوڈان یونیورسٹی کی اینیمل کیئر اینڈ یوز ایتھکس کمیٹی نے منظور کیا۔ امیونو ہسٹو کیمیکل سٹیننگ، مائٹوکونڈریل میمبرین پوٹینشل کی پیمائش، ہسٹولوجیکل، اور ری ایکٹیو آکسیجن پرجاتیوں (ROS) کے گردے کے حصوں کے سٹیننگ کو انجام دیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے۔22-24

2.5 ریئل ٹائم پی سی آر

ہم نے سیل یا ٹشو کے نمونوں سے TRNzol ری ایجنٹس (Beyotime Biotechnology, China) کے ذریعے کل-RNA حاصل کیا اور پھر MMLV-reverse transscriptase test kit (Beyotime Biotechnology) کا استعمال کرتے ہوئے انہیں cDNA میں نقل کیا۔ ایم آر این اے کے اظہار کی سطح کا تجزیہ ریئل ٹائم پی سی آر آلات (بائیو راڈ) کے ذریعہ SYBR گرین کیو پی سی آر مکس پرکھ کٹ (بیو ٹائم بائیوٹیکنالوجی) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا اور جی اے پی ڈی ایچ میں معیاری بنایا گیا۔

2.6 فلو سائٹومیٹری

گردے کے خلیوں کی نشوونما اور علاج کیا گیا جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے۔ MitoSOX (mitochondrial ROS)، MitoTracker Green (total mitochondrial mass)، اور MitoTracker Red (mitochondrial membrane Potential) سٹیننگ کارخانہ دار کی ہدایات اور سابقہ ​​تحقیق کے مطابق کی گئی تھی۔ CytExpert سافٹ ویئر (BD بایو سائنسز)۔

2.7 گلوکوز کی مقدار

ہم نے کارخانہ دار کے پروٹوکول اور پچھلی تحقیق (GAHK20؛ سگما) کے مطابق گلوکوز اپٹیک پرکھ ٹیسٹ کے ذریعے سیل کلچر سپرنٹنٹ میں گلوکوز کی تعداد کی پیمائش کی۔ خلیوں کی تعداد کے مطابق نتائج کو معمول پر لایا گیا تھا۔

2.8 جین ناک ڈاؤن

ہم نے چھوٹے مداخلت کرنے والے RNA (siRNA؛ RiboBio، China) کو مخصوص جینز کو دستک دینے کے لیے استعمال کیا۔ سب سے پہلے، Lipofectamine RNAiMAX اور siRNA (100 pmol) کو پائپٹنگ کے ذریعے آہستہ سے ملایا گیا اور 0.5 گھنٹے کے لیے 37◦C پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ پھر ہم نے معیاری سیل کلچر میڈیم کو ٹرانسفیکشن کاک ٹیل میں تبدیل کیا اور siRNA جین کی منتقلی کے لیے خلیوں کو 6 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا۔ اگلا، ہم نے ٹرانسفیکشن کاک ٹیل کو ایک تازہ سیل کلچر میڈیم میں تبدیل کیا۔ 48 گھنٹے کے بعد، مزید مطالعات کے لیے گردے کے خلیوں کو IL-22 کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔

Cistanche علاج کر سکتے ہیںگردے کی چوٹ

2.9 مغربی دھبہ

ہم نے RIPA lysis بفر (Beyotime Biotechnology, China) کے ذریعے خلیوں یا بافتوں سے کل پروٹین نکالے۔ پھر، ہم نے 10 منٹ کے لیے 12 000 rpm پر 4◦C پر سینٹرفیوگریشن کے ذریعے لائسیٹس کو اکٹھا کیا۔ اس کے بعد، لائسیٹس کو نمونے کے بفروں کے ساتھ 100◦C پر 15 منٹ کے لیے گرم کیا گیا، جو سوڈیم ڈوڈیسائل سلفیٹ-پولیاکریلامائڈ جیل الیکٹروفورسس (SDS– PAGE) کا نشانہ بنی، اور پولی وینیلائیڈین ڈائی فلورائڈ (PVDF) جھلی، جرمنلیپوریل (MYMIL) میں الیکٹرو ٹرانسفر کیا گیا۔ اس کے بعد جھلیوں کو 5 فیصد بوائین سیرم البومین (BSA) کے ساتھ 2 گھنٹے کے لیے بلاک کر دیا گیا اور راتوں رات 4◦C پر بنیادی اینٹی باڈیز کے ساتھ مل کر انکیوبیٹ کیا گیا۔ تین بار دھونے کے بعد، جھلیوں کو ہارسریڈش پیرو آکسیڈیس کنججٹیڈ سیکنڈری اینٹی باڈیز (CST، USA) سے لگایا گیا تھا۔ پروٹین کے دھبوں کو بہتر کیمیلومینیسینس امیجنگ سسٹم کے ذریعہ تصور کیا گیا تھا۔

2.10 امیونو فلوروسینس

گردے کے خلیات کو 3 فیصد –4 فیصد پیرافارمیلڈہائیڈ سے طے کیا گیا تھا اور 0.1 فیصد ٹریٹن ایکس-100 کے ساتھ پارمیبلائز کیا گیا تھا۔ پھر، ہم نے خلیات کو 5 فیصد BSA کے ساتھ 2 گھنٹے کے لیے بلاک کر دیا۔ خلیوں کو 4◦C پر اینٹی GLUT1 اینٹی باڈی کے ساتھ راتوں رات انکیوبیٹ کیا جاتا تھا، چار بار دھویا جاتا تھا، اور پھر PKH26 سے داغ دیا جاتا تھا۔ اس کے بعد، گردے کے خلیوں کو ہوچسٹ 33342 سے داغ دیا گیا اور سلائیڈوں پر لگایا گیا۔ ڈیٹا کنفوکل مائکروسکوپی کے ذریعہ حاصل کیا گیا تھا۔

2.11 RNA-seq اور بایو انفارمیٹکس

ٹی ای سی کے نمونے (2 × 107) کو لیس کیا گیا تھا اور کارخانہ دار کے پروٹوکول (بیو ٹائم، شنگھائی، چین) کے مطابق، RNeasy منی کٹ کا استعمال کرتے ہوئے کل RNA نکالا گیا تھا۔ Eukaryotic RNA-seq کو اگلی نسل کی ترتیب (NGS) کی ٹیکنالوجی کا استعمال کرتے ہوئے Illumina HiSeq سیکوینسنگ سسٹم پر انجام دیا گیا، جس سے ایک 50-بیس ریڈ لینتھ فراہم کی گئی۔ UCSC mm10 اسمبلی کے خلاف TopHat v2.0.12 کو استعمال کرتے ہوئے ترتیب وار ریڈز کی سیدھ میں کی گئی تھی۔ DESeq2 (http://www.bioconductor.org/packages/release/ bioc/html/DESeq2.html) پیکیج کا استعمال کرتے ہوئے امتیازی اظہار کے تجزیہ کا حساب لگایا گیا اور شماریاتی اہمیت کے تجزیے R (v3.1.1؛ http://www. .r-project.org/)۔ R پیکیج ReactomePA کا استعمال کرتے ہوئے پاتھ وے کی زیادہ نمائندگی کی گئی۔

2.12 شماریات

ڈیٹا کو اوسط ± معیاری انحراف (SD) کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا اور گراف پیڈ پرزم 5 کا استعمال کرتے ہوئے دکھایا گیا تھا۔{1}}۔ دو یا زیادہ گروپوں کا موازنہ کرنے والے نتائج کے لیے، طلباء کے ٹی ٹیسٹ یا تغیر کے یک طرفہ تجزیہ (ANOVA): ***p < 0="" کا="" استعمال="" کرتے="" ہوئے="" فرق="" کا="" حساب="" لگایا="" گیا۔{6}}0="" 1،="" **p=""><0.01، اور="" *p=""><>

Cistanche علاج کر سکتے ہیںگردے کی چوٹ

3 نتائج

3.1 IL-22 TECs میں سیلولر میٹابولزم کو محفوظ رکھتا ہے۔

چونکہ مائٹوکونڈریا کو سیلولر میٹابولزم اور اپوپٹوٹک عملوں کو مربوط کرنے والے اہم آرگنیلز ہونے کا مشورہ دیا گیا تھا، اس لیے ہم نے ٹی ای سی میں مائٹوکونڈریل فنکشن کا اندازہ کیا جس کی حوصلہ افزائی کی گئی تھی۔گردہچوٹعوامل اور IL-22.25 کے ساتھ علاج کیا گیا جیسا کہ شکل 1A–D میں دکھایا گیا ہے، مائٹوکونڈریل بیسل آکسیجن کی کھپت کی شرح (OCR)، زیادہ سے زیادہ سانس لینے کی صلاحیت (MRC)، اور تنفس کو تناؤ کے حالات میں TECs میں کافی حد تک روک دیا گیا تھا۔ خاص طور پر، ان اسامانیتاوں کو بڑی حد تک IL- 22 کے علاج سے روکا گیا تھا۔ ایکسٹرا سیلولر ایسڈیفیکیشن ریٹ (ECAR) سے ظاہر ہونے والے خراب TECs میں Glycolysis، IL-22 plus stimuli-challenged TECs (شکل 1B اور E) کے مقابلے میں بھی واضح طور پر روکا گیا تھا۔ ہم نے مزید یہ ظاہر کیا کہ خراب شدہ TECs میں سمجھوتہ شدہ آکسیڈیٹیو فاسفوریلیشن (OXPHOS) اور گلائکولائسز پین کیسپیس انحیبیٹر (فگر S1) کے شریک علاج کے ذریعے اپوپٹوس کے ثانوی اثرات نہیں تھے۔ اور IL-22-میٹابولک نقائص پر ثالثی اصلاحی اثرات رینل TECs (فگر S2) کے لیے مخصوص تھے۔ مزید برآں، IL-22 نے HK2 خلیات OXPHOS اور glycolysis کو محرکات کی عدم موجودگی میں فروغ دیا، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ میٹابولک راستوں پر IL-22 کے اثرات خراب TECs کے لیے مخصوص نہیں تھے (شکل S3)۔ مزید برآں، ہمارے نتائج نے یہ بھی اشارہ کیا کہ IL-22 نے IL-22R1 کے اظہار اور ٹرانسلوکیشن کو فروغ دیا۔ دریں اثنا، STAT3 کا فاسفوریلیشن اور IL-22 کے میٹابولک ری پروگرامنگ اثرات کو IL-22R1 دستک ڈاؤن (فگر S4) کے ذریعے مکمل طور پر غیر مسلح کر دیا گیا تھا۔ ان نتائج نے تجویز کیا کہ IL-22 نے براہ راست IL-22R1 کو چالو کرنے کے ذریعے TECs کی میٹابولک حالت کو بحال کیا۔ چونکہ شواہد کے متعدد ٹکڑوں نے یہ تجویز کیا تھا کہ Glut1 نے گلائکولائسز اور گلوکوز ہومیوسٹاسس میں بنیادی کردار ادا کیا ہے، لہذا ہم نے پوچھا کہ کیا IL-22 نے Glut1 ٹرانسلوکیشن یا اظہار کو متاثر کیا۔ جیسا کہ متوقع تھا، ہم نے یہ ظاہر کیا کہ IL-22 نے نہ صرف ٹرانسلوکیٹڈ Glut1 کو سیل جھلی کی سطح (PKH26) اور Glut1 ایکسپریشن پر فروغ دیا، بلکہ گلوکوز کے اخراج میں بھی اضافہ کیا (شکل 1F اور G)۔ مجموعی طور پر، ان مشاہدات نے اشارہ کیا کہ IL-22 زخمی TECs میں OXPHOS اور glycolysis کو بڑھا سکتا ہے۔

شکل 1 IL-22 TECs میں مائٹوکونڈریل فٹنس اور گلائکولائسز کو محفوظ رکھتا ہے۔ (A اور B) ہم TECs کے ایکسٹرا سیلولر ایسڈ ریٹ (ECAR) اور آکسیجن کی کھپت کی شرح (OCR) میں ہونے والی تبدیلیوں کو جانچنے کے لیے Seahorse XF96 Extracellular Flux Analyzer کا استعمال کرتے ہیں۔ TECs میں OCR اور ECAR 50 mM گلوکوز، یا 5 µg/mL سسپلٹین، یا 0.2 mM palmitic acid، یا 4 µM DOX IL{{8} کی موجودگی یا غیر موجودگی میں } (C) TECs کی زیادہ سے زیادہ سانس لینے کی صلاحیت (MRC) کا اندازہ OCR میں حقیقی وقت کی تبدیلیوں سے کیا گیا ہے۔ (D اور E) oligomycin، FCCP، گلوکوز، روٹینون، اور {{10}}DG کے ساتھ انکیوبیٹ ہونے کے بعد TECs کے OCR اور ECAR میں منحنی خطوط۔ (ایف) ٹی ای سی میں جوہری (نیلے)، گلوٹ 1 (سبز) اور پلازما جھلی (سرخ) کا لوکلائزیشن اور اظہار۔ (G) 24 گھنٹے تک IL-22 علاج کے بعد TECs میں گلوکوز کا استعمال۔ n=3; اسکیل بارز، 20 µm؛ طالب علم کا ٹی ٹیسٹ (بغیر جوڑا)؛ ***p <0.001، **p=""><0.01، *p=""><>

3.2 IL-22 Mitophagy کے ایکٹیویشن کے ذریعے TECs میں غیر فعال مائٹوکونڈریا کے جمع ہونے کو بہتر بناتا ہے۔

محرکات کی نمائش کے بعد TECs میں LC3 پنکٹا کی تشکیل (شکل 2F)۔ اس کے بعد ہم نے siRNA-ATG5 (شکل S6) کے ذریعے ٹیوبول سیل میٹابولزم پر اس کے فنکشن کا اندازہ لگانے کے لئے مائٹوفجی کو ختم کردیا۔ ہمارے اعداد و شمار نے تجویز کیا کہ TECs میں مائٹوفگی کی کمی نے IL-22 کے حفاظتی اثرات کو پہلے سے پیش کرنے والی مائٹوکونڈریل فٹنس (فگر 2E) میں نمایاں طور پر روکا ہے، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ IL-22 مائٹوکونڈریل ڈیسفکشن کو مائٹوفیجی کے فعال ہونے سے روکتا ہے۔

Figure 2 IL-22 مائٹوکونڈریل dysfunction اور مائٹوکونڈریل ROS کے جمع ہونے کو مائٹوفجی کی شمولیت سے روکتا ہے۔ (A) مائٹوکونڈریل ماس کو داغ دیا گیا تھا اور مائٹو ٹریکر گرین اور فلو سائٹومیٹری نے اس کا اندازہ لگایا تھا۔ مائٹوکونڈریل آر او ایس کی جانچ مائٹو ایس او ایکس (بی) سے داغے ہوئے ٹی ای سی میں کی گئی۔ MitoTracker Green اور MitoTracker Red (C) سے داغے TECs میں مائٹوکونڈریل جھلی کی صلاحیت کا اندازہ لگایا گیا؛ مائٹوکونڈریل آر او ایس کے جمع ہونے کا اندازہ مائٹو ٹریکر گرین اور مائٹو ایس او ایکس (ڈی) نے کیا۔ (E) کنفوکل امیج کے نتائج نے مائٹوکونڈریل ROS پروڈکشن کی تجویز پیش کی جس کا لیبل MitoSOX ہے۔ (F) نمائندہ خوردبین امیجز نے اشارہ کیا کہ LC3-GFP punctate کی تشکیل IL-22 TECs کی موجودگی یا غیر موجودگی میں 24 گھنٹے کے لیے (A) کے طور پر حوصلہ افزائی کی گئی۔ (E) OCR کا اندازہ 24 گھنٹے کے لیے IL-22 اور siRNA-ATG5 کی موجودگی یا غیر موجودگی میں کیا گیا۔ n=3; طالب علم کا ٹی ٹیسٹ (بغیر جوڑا)؛ ***p < 0۔{13}}01,="" **p=""><0.01, *p=""><>

3.3 IL-22 AMPK/AKT سگنلنگ کو چالو کرنے کے ذریعے TECs کی مائٹوکونڈریل سالمیت کو برقرار رکھتا ہے

AMPK سگنلنگ، سیل کی بقا اور میٹابولزم کو جوڑنے والے ایک اہم سگنلنگ مرکز کے طور پر، کنٹرول شدہ گلوکوز میٹابولزم، لپڈ ترکیب، اور مائٹوکونڈریل فنکشن۔ IL-22 نے AMPK سگنلنگ ٹرانسڈکشن کو چالو کرنے کے ذریعے مائٹوکونڈریل سالمیت کو منظم کیا۔ ہم نے پایا کہ IL-22 نے زخمی TECs میں STAT3/AMPK/AKT سگنلنگ کی منتقلی کی سرگرمی میں اضافہ کیا، جس کا ثبوت STAT3، AMPK، اور AKT (شکل 3A) کے فاسفوریلیشن سے ملتا ہے۔ مزید برآں، ان عملوں کو STAT3 کی کمی والے نلی نما خلیوں میں روک دیا گیا تھا، جس نے یہ ظاہر کیا کہ IL-22 STAT3 (شکل 3B اور C؛ شکل S7) کے ذریعے AMPK/AKT سگنلنگ کو منظم کرتا ہے۔ ہم نے مزید TECs کو کمپاؤنڈ C اور LY294002 کے ساتھ انکیوبیٹ کیا تاکہ AMPK/AKT سگنلنگ ٹرانزیکشنز کو براہ راست روکا جا سکے، اور پھر ان کے مائٹوکونڈریل افعال اور میٹابولزم کی حالتوں کا جائزہ لیں۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ ان سگنلنگ انحیبیٹرز کے ساتھ مشترکہ علاج نے IL-22 کے علاج (شکل 3D–I) کے ذریعے پیدا ہونے والے بہتر OXPHOS اور گلائیکولٹک بہاؤ کو نمایاں طور پر روکا، جس نے تجویز کیا کہ IL-22 نے AMPK کو چالو کرنے کے ذریعے TECs میٹابولزم کو فروغ دیا۔ /AKT سگنلنگ پاتھ وے

تصویر 3 IL-22 کے ذریعہ AMPK/AKT سگنلنگ کی شمولیت مائٹوکونڈریل فٹنس کو برقرار رکھتی ہے۔ TECs کو 50 mM گلوکوز، یا 5 µg/mL cisplatin، یا 0.2 mM palmitic acid، یا 4 µM DOX IL-22، مرکب C کی موجودگی یا غیر موجودگی میں محرک کیا گیا تھا۔ ، یا LY294002 اشارہ شدہ اوقات کے لئے۔ (A اور B) TECs یا STAT3-WT اور STAT3–KD TECs میں AMPK/AKT سگنلنگ پاتھ وے ایکٹیویشن کا جائزہ مغربی بلاٹ تجزیہ کے ذریعے کیا گیا۔ (C اور D) TECs کے OCR اور ECAR میں تبدیلیوں کا تجزیہ کیا گیا۔ (E) TECs میں AMPK/AKT سگنلنگ پاتھ وے ایکٹیویشن کا جائزہ مغربی بلاٹ تجزیہ کے ذریعے کیا گیا۔ (F–I) TECs کے OCR اور ECAR میں تبدیلیوں کو TECs بمقابلہ کمپاؤنڈ C اور LY294002 علاج شدہ TECs میں ماپا گیا۔ طالب علم کا ٹی ٹیسٹ (بغیر جوڑا)؛ n=3; ***p <0.001، **p=""><0.01، *p=""><>

3.4 IL-22 PFKFB3 کی شمولیت کے ذریعے سیلولر میٹابولزم اور TECs کی مائٹوکونڈریل سالمیت کو محفوظ رکھتا ہے۔

مزید برآں، یہ جاننے کے لیے کہ TECs کی مائٹوکونڈریل فٹنس اور میٹابولزم کو کس طرح بہتر کیا گیا، ہم نے محرک کی چوٹ اور IL-22 کے علاج کے بعد جین کے اظہار کا اندازہ لگانے کے لیے RNA سیکوینسنگ تجزیہ (RNA-seq) کا استعمال کیا۔ ہم نے یہ ظاہر کیا کہ IL-22 انکیوبیشن (شکل 4A) کے بعد TECs میں متعدد جین نمایاں طور پر تبدیل ہوئے تھے۔ دستیاب ڈیٹا بیس کا استعمال کرتے ہوئے، ان اپ ریگولیٹڈ جینز کا جین سیٹ افزودگی کا تجزیہ کیا گیا، جس نے AMPK سگنلنگ پاتھ وے اور MYC اہداف سگنلنگ پاتھ وے (Figure S8) میں جین کی قابل ذکر افزودگی کا مشورہ دیا۔ خاص طور پر، PFKFB3 نمایاں طور پر IL-22 کی طرف سے جینوں میں سےگردہچوٹعوامل محرک (شکل 4A)۔ ان مشاہدات کی نشاندہی کنفوکل امیجز، کیو پی سی آر اور ویسٹرن بلاٹ سے بھی کی گئی تھی۔ PFKFB3 کا اعلی اظہار AMPK/AKT سگنلنگ پر منحصر تھا (شکل 4B اور C؛ شکل S9)۔

پچھلے مطالعات میں یہ تجویز کیا گیا تھا کہ PFKFB3 کو متعدد سگنلنگ ٹرانزیکشنز کے ذریعے ریگولیٹ کیا جا سکتا ہے تاکہ چوٹ کے بعد اپکلا کی تخلیق نو اور مرمت کو تیز کیا جا سکے۔ 29,30 اس طرح، ہم نے قیاس کیا کہ IL-22 نے PFKFB3 کو سیلولر میٹابولزم کو برقرار رکھنے اور TECs کی فٹنس کو برقرار رکھنے کی ترغیب دی۔ . ہم نے مشاہدہ کیا کہ AMPK/AKT سگنلنگ کی روک تھام نے PFKFB3 اظہار کو کم کیا (شکل 4D)۔ لہذا، ہم نے PFKFB3 کو خاموش کر دیا تاکہ IL-22 انکیوبیشن کے بعد TECs میں اس کے افعال کا مزید مطالعہ کیا جا سکے۔ ہمارے نتائج نے اشارہ کیا کہ خاموش PFKFB3 نے ECAR اور OCR (فگر 4E اور F) کو بحال کرنے پر IL-22 کے میٹابولک ری پروگرامنگ اثرات کو کم کیا، اور گلوکوز کے اخراج کے ساتھ ساتھ غیر فعال مائٹوکونڈریا (فگر 4G اور H) کو روکا۔ مزید برآں، ہم نے مزید یہ ظاہر کیا کہ IL-22 کے میٹابولک ری پروگرامنگ اثرات کو STAT3-ناک ڈاؤن کے ذریعے مکمل طور پر غیر مسلح کر دیا گیا تھا جبکہ PFKFB3 کا زیادہ اظہار ان فینوٹائپس کو بچانے کے قابل ہو سکتا تھا، تجویز کرتا ہے کہ IL-22 نے بحال کیا براہ راست STAT3-AMPK/AKT-PFKFB3 سگنلنگ کے ذریعے خراب گردے کے اپکلا خلیوں کی میٹابولک حالت (شکل S10)۔ ایک ساتھ مل کر، ان نتائج نے اشارہ کیا کہ PFKFB3 کی ایکٹیویشن نے مائٹوکونڈریل فٹنس اور غیر فعال مائٹوکونڈریا کے خاتمے میں اہم کردار ادا کیا۔گردہچوٹ.

شکل 4 IL-22 PFKFB3 کی شمولیت کے ذریعے TECs کی مائٹوکونڈریل سالمیت اور سیلولر میٹابولزم کو برقرار رکھتا ہے۔ (A) 24 گھنٹے کے لیے IL-22 کی موجودگی یا غیر موجودگی میں گلوکوز، یا سسپلٹین، یا پالمیٹک ایسڈ، یا CCl4 کے ساتھ متحرک TECs میں جین کے اظہار کے لیے آتش فشاں پلاٹ۔ (B) کنفوکل مائکروسکوپک ڈیٹا نے IL-22 علاج کے بعد TECs میں PFKFB3 اوور ایکسپریشن کا مظاہرہ کیا، جس کے لیے AMPK/AKT سگنلنگ ایکٹیویشن کی ضرورت تھی۔ (C) ریئل ٹائم پی سی آر کے نتائج بتاتے ہیں کہ IL-22 نے TECs میں PFKFB3 اوور ایکسپریشن کی حوصلہ افزائی کی، جسے AMPK/AKT سگنلنگ بلاک سے روکا جا سکتا ہے۔ (D) کمپاؤنڈ C اور LY294 کے ساتھ علاج کے بعد TECs میں AMPK/AKT/ PFKFB3 سگنلنگ پاتھ وے ایکٹیویشن002۔ (E اور F) 24 گھنٹے کے لیے IL-22، یا si-PFKFB3 کی موجودگی یا غیر موجودگی میں TECs میں ECAR اور OCR۔ (G) IL-22 یا si-PFKFB3 علاج کے بعد TECs میں گلوکوز کی کھپت 24 گھنٹے۔ (H) MitoTracker Red اور MitoTracker Green سے داغے TECs میں Mitochondrial dysfunction کا جائزہ لیا گیا۔ طالب علم کا ٹی ٹیسٹ (بغیر جوڑا)؛ n=3; ***p < 0.001،="" **p=""><0.01، *p=""><>

3.5 IL-22 گردوں کے ROS کے جمع ہونے اور مائٹوکونڈریل dysfunction کو دبانے کے ذریعے سسپلٹین سے متاثرہ AKI میں گردے کی چوٹ کو کم کرتا ہے۔

ہمارے مفروضے کو جانچنے کے لیے کہ IL-22 نے Vivo میں گردے کی نالی کی چوٹ کو دبانے کے لیے رینل میٹابولک پروفائلز کو ریگولیٹ کیا، ہم نے ابتدائی طور پر IL-22-علاج شدہ چوہوں میں گردوں کے افعال کا جائزہ لیا جن کا انتظام سسپلٹین (شکل 5A) سے کیا گیا تھا۔ سسپلٹین انجیکشن کے چار دن بعد، IL-22 نے نہ صرف ٹیوبلر سیلولر نقصان اور نکسیر کو کافی حد تک کم کیا؛ ان کے گردوں کی خرابی کو بھی نمایاں طور پر کم کیا گیا تھا، جس کا اندازہ خون میں یوریا نائٹروجن (BUN) اور کریٹینائن (Cr) (شکل 5B–D) کے سیرم کی سطح سے لگایا گیا تھا۔ ہم نے مزید تجویز کیا کہ IL-22 کو روکا جائے۔گردہچوٹگردے کی تخلیق نو کو بڑھانے اور AMPK/AKT سگنلنگ اور PFKFB3 کو چالو کرنے کے ذریعے (شکل 5E اور F؛ شکل S11)۔ اس کے بعد، ہم نے سیلولر میٹابولزم اور اپوپٹوسس میں شامل مائٹوکونڈریل ڈیسفکشن کا اندازہ لگانے کے لیے MitoSOX (mitochondrial-specific ROS ڈائی) اور JC-1 (مائٹوکونڈریل میمبرین پوٹینشل پر منحصر ڈائی) کا استعمال کیا۔ چوہوں کے گردے کے حصوں میں جن کا علاج سسپلٹین سے کیا گیا تھا، وہاں ROS کا موازنہ جمع تھا۔ قابل غور بات یہ ہے کہ IL-22 کے علاج کے چار دن بعد، زخمی گردوں میں ROS کی سطح PBS کے علاج کے بعد چوہوں کے ROS کے مقابلے میں واضح طور پر کم ہو گئی تھی (شکل 5G)۔ ایک ساتھ مل کر، ان مشاہدات نے اس بات کا ثبوت پیش کیا کہ IL-22 نے مائٹوکونڈریل فٹنس کو کنٹرول کرنے کے ذریعے سسپلٹین سے متاثرہ AKI میں حفاظتی کردار ادا کیا۔

شکل 5 IL-22 گردوں کے ROS کے جمع ہونے اور غیر فعال مائٹوکونڈریا کی روک تھام کے ذریعے سسپلٹین سے متاثرہ AKI میں گردے کے نقصان کو کم کرتا ہے۔ (A) cisplatin (20 mg/kg) کی وجہ سے گردے کو پہنچنے والے نقصان میں IL-22 کے حفاظتی اثرات کا جائزہ لینے کے لیے تجرباتی پروٹوکولز کا اسکیمیٹک خاکہ۔ PBS بطور وہیکل کنٹرول گروپ اور N-acetyl-l-cysteine ​​(NAC, 150 mg/kg) ایک مثبت کنٹرول گروپ کے طور پر۔ (B اور C) سیرم BUN کی سطح، سیرم Cr کی سطح، گردے کے وزن، اور جسمانی وزن کا اندازہ کیا گیا۔ نمائندہ HE (D)، Ki-67 سٹیننگ (E)، MitoSOX (G)، اور JC{{10} (G) گردے کے حصوں کی تصاویر پیش کی گئیں۔ (F) IL-22-علاج شدہ چوہوں سے گردے کے عرق میں STAT3/AMPK/AKT/PFKFB3 ایکٹیویشن کا موازنہ مغربی دھبے سے کیا گیا۔ طالب علم کا ٹی ٹیسٹ (بغیر جوڑا)؛ n=3; ***p <0.001، **p=""><0.01، *p=""><>

3.6 IL-22 AMPK/AKT سگنلنگ اور PFKFB3 کے ایکٹیویشن کے ذریعے مائٹوکونڈریل ڈیسفکشن کی روک تھام کے ذریعے ذیابیطس سے متاثرہ گردوں کی چوٹ کو کم کرتا ہے۔

ہم نے اور دوسروں نے یہ ظاہر کیا تھا کہ IL-22 ذیابیطس نیفروپیتھی (DN) میں حفاظتی طاقت کا استعمال کر سکتا ہے، جو ESTD کی بنیادی وجہ تھی۔31–33 بنیادی میکانزم کا مزید مطالعہ کرنے کے لیے، ہم نے db/db چوہوں کو خوراک دی چربی والی خوراک (HFD) اور پھر 8 ہفتوں تک IL-22 (2.5 ملی گرام/کلوگرام، آئی پی) کے ساتھ ان کا علاج کیا (شکل 6A)۔ جب چوہوں کو صرف HFD کے ساتھ کھانا کھلایا گیا، تو ہمیں گردے کے نلی نما فبروسس اور پھیلاؤ، ایٹروفی کے علاوہ ملا۔ اس کے برعکس، جب چوہوں کا علاج IL-22 کے ساتھ کیا گیا، تو گردوں کے فبروسس اور ہسٹوپیتھولوجی میں نمایاں طور پر بہتری آئی، ساتھ ہی گردے کے افعال بھی۔ بہتر گردے کے افعال کو سیرم Cr، BUN کی سطح میں کمی، اور کل پیشاب کی البومن/24 h (UAE) کی سطح (شکل 6B–E) سے بھی ظاہر کیا گیا۔ اس بات کا مطالعہ کرنے کے لیے کہ آیا یہ سرگرمیاں مائٹوکونڈریا سے وابستہ تھیں، ہم نے سیلولر میٹابولزم اور اپوپٹوسس میں شامل مائٹوکونڈریل فنکشن کا اندازہ کیا۔ نتائج نے اشارہ کیا کہ بڑھتی ہوئی مائٹوکونڈریل ROS کی سطح اور جمع شدہ غیر فعال مائٹوکونڈریا کو IL-22 علاج (شکل 6F اور G) کے ذریعے نمایاں طور پر کم کیا گیا تھا۔ مزید مطالعہ کرنے کے لیے کہ آیا گردے میں IL-22 کے حفاظتی افعال PFKFB3 کے ذریعے ثالثی کیے گئے تھے، ہم نے PFKFB3 کو گرانے کے لیے چوہوں کو PFKFB3 shRNA اڈینو وائرس کا انجیکشن لگایا۔ ہمارے ڈیٹا نے اشارہ کیا کہ IL-22 کے HFD-حوصلہ افزائی گردوں کی چوٹ، نیکروسس، سٹیٹوسس، مائٹوکونڈریل dysfunction، اور ROS جمع کرنے اور متعلقہ سگنلنگ پاتھ ویز کو چالو کرنے پر PFKFB3 دستک ڈاؤن کے ذریعے نمایاں طور پر مسدود کر دیا گیا تھا (Figure-G6) . IL-22 (شکل 6H) کے ساتھ علاج کے بعد AMPK/AKT سگنلنگ کا بڑھتا ہوا اظہار بھی دیکھا گیا۔ گردے کی خرابی کے خاتمے کے ساتھ ساتھ، PFKFB3 کے تاثرات اور سیلولر میٹابولزم میں اہم خامروں کو بھی IL-22-علاج شدہ چوہوں کے گردوں میں بہتر کیا گیا تھا (شکل 6H اور I)۔ مزید برآں، بڑے اعضاء پر ہسٹولوجیکل تجزیہ نے IL-22 کے انجیکشن کے بعد کوئی مورفولوجیکل چوٹوں کی نشاندہی نہیں کی، یہ تجویز کرتا ہے کہ IL-22 اہم ضمنی اثرات یا زہریلے رد عمل کے بغیر ایک محفوظ تریاق ہو سکتا ہے۔گردہچوٹعوارض (شکل 12S)۔ مجموعی طور پر، ہمارے ڈیٹا نے تجویز کیا کہ IL- 22 نے AMPK/AKT سگنلنگ ٹرانسڈکشن کو چالو کرنے، ROS کے جمع ہونے کی روک تھام، اور PFKFB3 کے ذریعے مائٹوکونڈریل فنکشن ریگولیشن کے ذریعے گردے کے نقصان کو کم کیا۔

شکل 6 IL-22 AMPK/AKT سگنلنگ اور PFKFB3 کو چالو کرنے کے ذریعے غیر فعال مائٹوکونڈریا کی روک تھام کے ذریعے ذیابیطس سے متاثرہ گردوں کے نقصان کو کم کرتا ہے۔ (A) ذیابیطس سے متاثرہ گردوں کے نقصان میں IL-22 کے حفاظتی اثرات کا جائزہ لینے کے لیے تجرباتی پروٹوکول کا اسکیمیٹک خاکہ۔ Db/m بطور گاڑی کنٹرول گروپ۔ (B-D) سیرم BUN کی سطح، سیرم Cr کی سطح، اور UAE کا جائزہ لیا گیا۔ نمائندہ HE (E)، MitoSOX (F)، اور JC-1 (G) گردے کے حصوں کی تصاویر پیش کی گئیں۔ (H اور I) IL-22-علاج شدہ چوہوں سے گردے کے عرق میں STAT3/AMPK/AKT/PFKFB3 ایکٹیویشن کا موازنہ مغربی دھبے سے کیا گیا۔ طالب علم کا ٹی ٹیسٹ (بغیر جوڑا)؛ n=3; ***p < 0۔{14}}01،="" **p=""><0.01، *p=""><>

4. بحث

IL-22 مدافعتی خلیات، جیسے NK خلیات، نیوٹروفیلز، پیدائشی لمفائیڈ خلیات (ILCs)، اور T خلیات کے ذریعے خفیہ ہوتا ہے، لیکن ان خلیوں کو براہ راست متاثر نہیں کرتا ہے۔ یہ بنیادی طور پر اپکلا خلیوں کے افعال کو منظم کرتا ہے جس کی وجہ سے محدود IL-22 اپکلا خلیوں پر R1 اظہار بشمول TECs۔ 15,34 پہلے کے مطالعے نے تجویز کیا ہے کہ IL-22 گردوں کے اپکلا کی چوٹ سے حفاظت کر سکتا ہے اور نلی نما تخلیق کو تیز کر سکتا ہے۔ NLRP3 کی سوزش کی روک تھام اور STAT3 اور AKT سگنلنگ کو چالو کرنے کے ذریعے۔ IL کے فنکشن کی سالماتی بنیاد کا مزید تعین کرنے کے لیےگردہچوٹ، ہم سب سے پہلے اس بات کی تحقیق کرتے ہیں کہ آیا IL-22 ان کی میٹابولک حالتوں کو منظم کرنے کے ذریعے گردے کے خلیوں کی خرابی اور بعد میں اپوپٹوسس کو کم کر سکتا ہے۔ مزید یہ کہ ہم دو ماڈلز کا مطالعہ کرتے ہیں۔گردہچوٹIL-22 انتظامیہ کے ساتھ امراض (AKI اور DN) اور کنٹرول گروپس کے مشاہدات کا موازنہ کریں۔ ہم اشارہ کرتے ہیں کہ IL-22 مائٹوکونڈریل سالمیت کو برقرار رکھنے کے لیے میٹابولک ری پروگرامنگ کو درست کرتا ہے، زخمی TECs میں مائٹوکونڈریل ROS کے جمع ہونے کو کم کرتا ہے، اور گردے کے ترقی پسند نقصان اور نیکروسس کو کم کرتا ہے۔ مزید برآں، ہماری دریافتوں سے پتہ چلتا ہے کہ IL- 22 TECs اور گردوں میں AMPK/AKT سے وابستہ سگنلنگ پاتھ ویز کو چالو کر سکتا ہے، جو اپکلا زخم بھرنے اور سیل کی بقا کے اہم ثالث ہیں، تاکہ مائٹوکونڈریل dysfunction اور بگڑتے ہوئے میٹابولک اور اوپن پروفائلز کو کم کیا جا سکے۔ IL-22 ثالثی گردوں کے حفاظتی طریقہ کار کے لیے فیلڈ۔ مجموعی طور پر، ہمارے نتائج بتاتے ہیں کہ IL-22 کے گردوں کے حفاظتی اثرات میٹابولک ری پروگرامنگ کے عمل کے ذریعے ثالثی کر رہے ہیں۔

گردے کے تحفظ میں OXPHOS اور glycolysis کا اہم کردار پچھلی مطالعات میں سامنے آیا ہے، جہاں پائروویٹ کناز M2 (PKM2) کی روک تھام کرنے والی S-nitrosylation کے ذریعے ایندھن کے استعمال میں توازن رکھنا گردے کی حفاظت کرتا ہے۔گردہچوٹ.19 ہمارے نتائج، میٹابولک ریگولیٹرز کے اظہار اور گلوکوز کی مقدار میں اضافے کے ذریعے IL-22 کے ذریعے OXPHOS اور گلائکولائسز کے فروغ کی تجویز کرتے ہیں، یہ ظاہر کرتے ہیں کہ IL-22 بگڑتی ہوئی میٹابولک حالتوں کو معکوس کرتا ہے۔گردہچوٹ. یہ مشاہدات ریکومبیننٹ آئریسن کے گردوں کے حفاظتی افعال سے مطابقت رکھتے ہیں اور ہیپاٹوسائٹس سے حاصل ہونے والے نتائج سے بھی مطابقت رکھتے ہیں، جہاں سیلولر افعال کے لیے OXPHOS اور glycolysis دونوں کی ضرورت ہوتی ہے، لیکن اگر ان کو روکا جائے، تو بنیادی ٹیوبیل خلیے اور ہیپاٹوسائٹس غیر فعال ہو جاتے ہیں۔ 36

Mitochondrial dysfunction کلیدی مالیکیولر بنیاد کے طور پر ابھرا ہے جو میٹابولک پروفائلز اور سیل کی موت کو مربوط کرتا ہے۔ اس کے ساتھ، ہم یہ واضح کرتے ہیں کہ چوٹ کے عوامل کے محرک پر، IL-22 کے ساتھ TECs کے علاج نے مائٹوکونڈریل ROS اور غیر فعال مائٹوکونڈریا کے جمع ہونے میں بہتری لائی تھی جیسا کہ کنٹرول گروپس میں مائٹوکونڈریل سالمیت اور فنکشن میں کمی واقع ہوئی ہے۔ اہم بات یہ ہے کہ، AMPK سگنلنگ پاتھ ویز، اہم انرجی سینسرز، سیلولر ہومیوسٹاسس کو برقرار رکھنے اور سیل یا ٹشو کو پہنچنے والے نقصان کو روکنے کے لیے میٹابولک عمل کو ماڈیول کرتے ہیں۔ AMPK/AKT سگنلنگ یہ ظاہر کرنے کے لیے کہ IL-22 ایک براہ راست طریقہ میں مائٹوکونڈریل dysfunction کو روکتا ہے، جو TECs کی سانس کی صلاحیت کو برقرار رکھنے کے لیے بہت ضروری ہے۔ مزید برآں، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ STAT3 کے ذریعے IL-22 سگنلنگ کے مائٹوکونڈریل فٹنس کو محفوظ رکھنے پر براہ راست اثرات مرتب ہوتے ہیں، جیسا کہ ان کی پہلے تحقیق کی گئی ہے کہ حوصلہ افزائی شدہ STAT3 فاسفوریلیشن مائٹوکونڈریل سالمیت کے تحفظ کے لیے اہم ہے۔40,41

متعدد قسم کے لٹریچر نے پہلے اشارہ کیا ہے کہ PFKFB3 سیل میٹابولزم میں مرکزی ماڈیولر کا کردار ادا کرتا ہے۔ 29–30,42 یہاں، ہم پہلے یہ ظاہر کرتے ہیں کہ IL-22 TECs میں AMPK/AKT سگنلنگ کے ذریعے PFKFB3 ایکٹیویشن کو فروغ دیتا ہے، IL تجویز کرتا ہے۔ {6}} PFKFB3 کے کنٹرول کو شامل کرکے میٹابولک حالتوں کو منظم کرتا ہے۔ مزید برآں، پچھلے مطالعات مزید بتاتے ہیں کہ PFKFB3 بہت سارے خلیات یا بافتوں میں مبالغہ آمیز OXPHOS اور گلائکولیسس کو کنٹرول کرنے کے لیے اہم ہے۔ PFKFB3 کو چالو کرنے کے ذریعے TECs کا علاج کیا گیا۔ IL-22 کے متعدد ڈاؤن اسٹریم ماڈیولٹرز میں سے جن کی تحقیق کی گئی ہے، ہمارا ڈیٹا واضح کرتا ہے کہ PFKFB3 کو TECs کے نقصان کے دوران IL-22 علاج کے بعد نمایاں طور پر اپ گریڈ کیا گیا ہے اور یہ کہ STAT3–AMPK/AKT PFKFB3 محور تحفظ کے لیے اہم ہے۔ کے دوران mitochondrial سالمیت کیگردہچوٹ(شکل 7)۔ ان کی چھان بین باقی ہے کہ آیا IL-22 STAT3–AMPK/AKT-PFKFB3 سگنلنگ پاتھ وے کو چالو کرنے کے ذریعے دیگر میٹابولک ریگولیٹرز اور گردے کی چوٹ سے متعلق عمل کو بھی منظم کرتا ہے۔

تصویر 7 ہمارے نتائج STAT3-AMPK/AKT-PFKFB3 محور کو چالو کرنے کے ذریعے گردے کے نقصان کا علاج کرنے کے لیے گردے کے سیل میٹابولزم کو کنٹرول کرنے میں IL-22 کے ایک اہم کردار کی وضاحت کرتے ہیں۔ یہ نتائج بتاتے ہیں کہ IL-22 کے علاج کے مواقع اور متعلقہ میٹابولک سگنلنگ کو نشانہ بنانا گردے کے متعدد نقصانات کے علاج یا روک تھام کے لیے براہ راست سازگار ہو سکتا ہے۔

5. نتائج

آخر میں، ہم نے گردے کے نقصان میں IL-22 کے علاج کی صلاحیت اور بنیادی میکانزم کا مظاہرہ کیا۔ IL-22 نے مائٹوکونڈریل سالمیت کو محفوظ رکھنے کے لیے میٹابولک ری پروگرامنگ کے ذریعے رینل سیل میٹابولزم کو منظم کیا۔ ان کے ریگولیٹرز (یعنی، AMPK، Akt، اور PFKFB3) کی روک تھام غیر معمولی میٹابولک پروفائلز اور مائٹوکونڈریل فٹنس کے نقصان کا باعث بن سکتی ہے، جیسا کہ TECs میں بے ساختہ-22 علاج کے ساتھ اشارہ کیا گیا ہے، جس میں غیر فعال مائٹوکونڈریا اور مائٹوکونڈریل آر او ایس میں اضافہ ہوا تھا۔ سب سے اہم بات، چوہوں کے ماڈلز میں مائٹوکونڈریل dysfunction اور ROS کے جمع ہونے سے گردے کو پہنچنے والے نقصان کو IL-22 علاج کے ذریعے STAT3-AMPK-AKT-PFKFB3 سگنلنگ کو چالو کرنے کے ذریعے کافی حد تک کم کیا گیا تھا۔ اس طرح، ہمارے مطالعے نے اشارہ کیا کہ متعلقہ میٹابولک سگنلنگ کو نشانہ بنانا گردے کو نقصان پہنچانے والی متعدد بیماریوں کے لیے براہ راست سازگار ہو سکتا ہے اور IL-22 ان بیماریوں کی روک تھام اور علاج کے لیے ایک ممکنہ علاج کا ایجنٹ ہے۔

Cistanche مصنوعات علاج کر سکتے ہیںگردے کی چوٹ

منجانب: 'IL-22-علاج کے لیے PFKFB3 کے ذریعے رینل میٹابولک ری پروگرامنگ کی ثالثیگردہچوٹکی طرف سےوی چن، وغیرہ

---کلین ترجمہ میڈ. 2021;11:e324۔

حوالہ جات

1. مہتا آر ایل، برڈمین ای اے، سرڈا جے، وغیرہ۔ ایکیوٹ کی پہچان اور انتظامگردہچوٹبین الاقوامی سوسائٹی آف نیفرولوجی میں 0 بائی 25 گلوبل سنیپ شاٹ: ایک کثیر القومی کراس سیکشنل مطالعہ۔ لینسیٹ 2016؛387:2017-2025۔

2. Lameire NH، Bagga A، Cruz D، et al. شدیدگردہچوٹ: ایک بڑھتی ہوئی عالمی تشویش۔ لینسیٹ 2013؛382:170-179۔

3. مہتا RL، Cerdá J، Burdmann EA، et al. بین الاقوامی سوسائٹی نیفرولوجی کا 0بائی 25 اقدام برائے شدیدگردہچوٹ(2025 تک زیرو قابل روک تھام اموات): نیفروولوجی کے لیے انسانی حقوق کا مقدمہ۔ 2015؛385:2616-2643۔

4. لیوی اے ایس، جیمز ایم ٹی۔ شدیدگردہچوٹ. این انٹرن میڈ۔2017;167:ITC66-ITC80۔

5. Jansen MPB، Florquin S، Roelofs JJTH. شدید میں پلیٹلیٹس کا کردارگردہچوٹ. نیٹ ریو نیفرول۔ 2018؛14:457-471۔

6. اگروال اے، ڈونگ زیڈ، ہیرس آر، وغیرہ۔ AKI کے سیلولر اور مالیکیولر میکانزم۔ جے ایم سوک نیفرول۔ 2016؛27:1288-1299۔

7. Linkermann A, Chen GC, Dong G, Kunzendorf U, KrautwaldS, Dong Z. AKI میں سیل ڈیتھ ریگولیٹڈ۔ J Am Soc Nephrol.2014;25:2689-2701۔

8. Ferenbach DA، Bonventre JV. AKI کے بعد خرابی کی مرمت کا طریقہ کار گردے کی تیز رفتار عمر اور CKD.Nat Rev Nephrol کا باعث بنتا ہے۔ 2015؛11:264-276۔

9. چاولہ LS، Eggers PW، Star RA، Kimmel PL. شدیدگردہچوٹاور گردے کی دائمی بیماری ایک دوسرے سے منسلک سنڈروم کے طور پر۔ این انگل جے میڈ۔ 2014؛371:58-66۔

10. He L، Wei QQ، Liu J، et al. CKD پر AKI: زیادہ چوٹ، دبی ہوئی مرمت، اور بنیادی میکانزم۔ کڈنی انٹر۔2017;92:1071-1083۔

11. Forbester JL، Lees EA، Goulding D، et al. Interleukin-22 انسانی اپکلا خلیوں میں سالمونیلا انٹریکا ٹائفیموریم کے خلاف تحفظ پیدا کرنے کے لیے فاگولیسوسومل فیوژن کو فروغ دیتا ہے۔ Proc Natl Acad Sci USA۔ 2018؛ 115:10118-10123۔

12. Geng H, Bu HF, Liu F, et al. سوجن آنتوں کے ؤتکوں اور اپکلا خلیوں میں، انٹرلییوکن 22 سگنلنگ H19 طویل نان کوڈنگ RNA کے اظہار کو بڑھاتا ہے، جو میوکوسل کی تخلیق نو کو فروغ دیتا ہے۔ معدے. 2018؛ 155:144-155۔

13. Aden K، Tran F، Ito G، et al. ATG16L1 cGAS-STING کے ذریعے آنتوں کے اپکلا میں انٹرلییوکن-22 سگنلنگ کو آرکیسٹریٹس کرتا ہے۔ J ExpMed. 2018؛ 215:2868-2886۔

14. Huber SN، Gagliani LA، Zenewicz FJ، et al. IL-22BP کو سوزش کے ذریعہ کنٹرول کیا جاتا ہے اور آنت میں ٹیومرجنیسیس کو ماڈیول کرتا ہے۔ فطرت 2012؛491:259-263۔

15. Lindemans CA, Calafiore M, Mertelsmann AM, et al.Interleukin-22 intestinal-stem-cell-mediated epithe lial regeneration کو فروغ دیتا ہے۔ فطرت 2015؛528:560-564۔

16. Xu MJ, Feng D, Wang H, Guan Y, Yan X, Gao B. IL-22 proximal tubule epithelium کو نشانہ بنا کر رینل اسکیمیا ریپرفیوژن انجری کو کم کرتا ہے۔ جے ایم سوک نیفرول۔ 2014؛25:967-977۔

17. کلکرنی او پی، ہارٹر اول، مولے ایس آر، وغیرہ۔ ٹول نما رسیپٹر 4-حوصلہ افزائی IL-22 گردے کی تخلیق نو کو تیز کرتا ہے۔ جے ایم سوک نیفرول۔ 2014؛25:978-989۔

18. کانگ ایچ ایم، آہن ایس ایچ، چوئی پی، وغیرہ۔ گردوں کے نلی نما اپکلا خلیوں میں خراب فیٹی ایسڈ آکسیکرن گردے کے فبروسس کی نشوونما میں کلیدی کردار ادا کرتا ہے۔ نیٹ میڈ. 2015؛21:37-46۔

19. زو ایچ ایل، ژانگ آر، آنند پی، وغیرہ۔ S-nitroso-CoA ریڈکٹیس سسٹم کے ذریعے میٹابولک ری پروگرامنگ سے حفاظت کرتا ہے۔گردہچوٹ. فطرت 2019؛ 565:96-100۔

20. Dumesic PA، Egan DF، Gut P، et al. ایک ارتقائی طور پر محفوظ uORF چوہوں، مکھیوں اور بلیو فن ٹونا میں PGC1 اور آکسیڈیٹیو میٹابولزم کو منظم کرتا ہے۔ سیل میٹاب۔ 2019؛ 30:190-200۔

21. Shyh-Chang N، Zhu H، Yvanka de Soysa T، et al. Lin28 سیلولر میٹابولزم کو دوبارہ پروگرام کرکے ٹشو کی مرمت کو بڑھاتا ہے۔ سیل 2013؛ 155:778-792۔

22. چن ڈبلیو، لوان جے، وی جی، وغیرہ۔ انٹرلییوکن-22 کے Vivo ہیپاٹو سیلولر اظہار میں ممکنہ اینٹی ہیپاٹائٹس علاج کے طور پر دخول پر مبنی ہائبرڈ نینو پارٹیکلز کا استعمال۔ بائیو میٹریلز۔ 2018؛ 187:66- 80۔

23. چن ڈبلیو، ژانگ ایکس، فین جے، وغیرہ۔ انٹرلییوکن-22 کو apolipoprotein AI کے ساتھ ٹیتھر کرنے سے چوہوں کو ایسیٹامنفین سے متاثرہ جگر کی چوٹ سے نجات ملتی ہے۔ تھرانوسٹکس۔ 2017؛7:4135-4148۔

24. زائی ڈبلیو، چن ڈبلیو، وو زیڈ، وغیرہ۔ غیر الکوحل فیٹی جگر کی بیماری کے علاج کے لیے پولی میٹفارمین اور پینےٹریشن پر مبنی ہائبرڈ نینو پارٹیکلز کے ذریعے جگر میں ٹارگٹڈ انٹرلییوکن-22 جین کی ترسیل۔ ACS ایپل میٹر انٹرفیس۔ 2019؛ 11:4842-4857۔

25. کھچو ایم، ہیرس آر، سلیک آر ایس۔ مائٹوکونڈریا نیورل اسٹیم سیل کی قسمت اور علمی فعل کے مرکزی ریگولیٹرز کے طور پر۔ نیٹ ریو نیوروسکی۔ 2019؛ 20:34-48۔

26. Ip WKE, Hoshi N, Shouval DS, Snapper S, Medzhitov R. IL-10 کا اینٹی سوزش اثر میکروفیجز کے میٹابولک ریپروگرام منگ کے ذریعے ثالثی کیا جاتا ہے۔ سائنس 2017؛356:513-519۔

27. Saito Y، Chapple RH، Lin A، Kitano A، Nakada D. AMPK مائیلوڈ لیوکیمیا میں لیوکیمیا شروع کرنے والے خلیوں کو بون میرو میں میٹابولک تناؤ سے بچاتا ہے۔ سیل سٹیم سیل۔ 2015؛17:585- 596۔

28. میہائیلووا ایم ایم، شا آر جے۔ AMPK سگنلنگ پاتھ وے سیل کی نشوونما، آٹوفیجی اور میٹابولزم کو مربوط کرتا ہے۔ نیٹ سیل بائیول۔ 2011؛13:1016-1023۔

29. Li FL، Liu JP، Bao RX، et al. Acetylation Glycolysis کو فروغ دینے کے لیے PFKFB3 کو سائٹوپلازم میں جمع کرتا ہے اور خلیات کو سسپلٹین سے متاثرہ اپوپٹوسس سے بچاتا ہے۔ نیٹ کمیون۔ 2018؛ 9:508۔

30. De Bock K، Georgiadou M، Schoors S، et al. پی ایف کے ایف بی کا کردار سیل 2013؛ 154:651-663۔

31. Dudakov JA، Hanash AM، van den Brink MR. انٹرلییوکن-22: امیونو بایولوجی اور پیتھالوجی۔ Annu Rev Immunol. 2015؛33:747- 785۔

32. وانگ ایس، لی وائی، فین جے، وغیرہ۔ انٹرلییوکن-22 نے NLRP3 کی سوزش کی ایکٹیویشن کی روک تھام کے ذریعے ذیابیطس نیفروپیتھی میں گردوں کی چوٹ اور فائبروسس کو کم کیا۔ سیل ڈیتھ ڈس۔ 2017؛ 8:e2937۔

33. شین وائی ایل، چن ڈبلیو، ہان ایل، وغیرہ۔ VEGF-B اینٹی باڈی اور انٹرلییوکن-22 فیوژن پروٹین لپڈ کے جمع ہونے اور اشتعال انگیز ردعمل کو روکنے کے ذریعے ذیابیطس نیفروپیتھی کو کم کرتا ہے۔ Acta Pharm Sin B. 2020. https://doi.org/10.1016/j. apsb.2020.07.002.

34. Ouyang W, O'Garra A. IL-10 فیملی سائٹوکائنز IL-10 اور IL-22: بنیادی سائنس سے طبی ترجمہ تک۔ قوت مدافعت. 2019؛50:871- 891۔

35. Xiang X، Feng D، Hwang S، et al. Interleukin-22 چوہوں میں دوبارہ تخلیق کے خراب ہونے والے راستوں کو دوبارہ پروگرام کر کے شدید آن دائمی جگر کی ناکامی کو دور کرتا ہے۔ جے ہیپاٹول۔ 2020؛72:736-745۔

36. چن ڈبلیو، زائی ڈبلیو، فین جے، وغیرہ۔ انٹرلییوکن-22 مائٹوکونڈریل فٹنس کو برقرار رکھنے اور جگر کی چوٹ کے علاج کے لیے میٹابولک اڈاپٹیو ری پروگرامنگ چلاتا ہے۔ تھرانوسٹکس۔ 2020؛ 10:5879-5894۔

37. پینگ ایچ، وانگ کیو، لو ٹی، وغیرہ۔ Myokine ثالثی پٹھوں-گردے کراسسٹالک خراب شدہ گردوں میں میٹابولک ری پروگرامنگ اور فائبروسس کو دباتا ہے۔ نیٹ کمیون۔ 2017؛ 8:1493۔

38. Saberi B, Ybanez MD, Johnson HS, Gaarde WA, Han D, Kaplowitz N. Protein kinase c (PKC) c-jun-n-terminal kinase (jnk) پر منحصر اور آزاد سگنلنگ راستوں کے ذریعے acetaminophen hepatotoxicity میں حصہ لیتا ہے۔ ہیپاٹولوجی. 2014؛59:1543-1554۔

39. مو آر، لائی آر، لو جے، وغیرہ۔ بہتر آٹوفیجی IL-22 کے ایسٹامنفین سے متاثرہ جگر کی چوٹ کے خلاف حفاظتی اثرات میں معاون ہے۔ تھرانوسٹکس۔ 2018؛ 8:4170-4180۔

40. Wegrzyn J، Potla R، Chwae YJ، et al. سیلولر سانس میں مائٹوکونڈریل اسٹیٹ 3 کا فنکشن۔ سائنس 2009؛323:793-797۔

41. چن ڈبلیو، ہو وائی، جو ڈی. نیوروڈیجنریٹیو عوارض کے لیے جین تھراپی: پیشرفت، بصیرت، اور امکانات۔ ایکٹا فارم سین بی 2020؛ 10:1347-1359۔

42. Cao Y، Zhang X، Wang L، et al. PFKFB3-ثالثی اینڈوتھیلیل گلائکولیسس پلمونری ہائی بلڈ پریشر کو فروغ دیتا ہے۔ Proc Natl Acad Sci USA۔ 2019؛ 116:13394-13403۔

43. Doménech E, Maestre C, Esteban-Martínez L, et al. AMPK، اور PFKFB3 مائٹوٹک گرفتاری کے دوران مائٹوفگی کے جواب میں گلائکولیسس اور بقا میں ثالثی کرتے ہیں۔ نیٹ سیل بائیول۔ 2015؛17:1304- 1316۔