سنگل سیل ٹرانسکرپٹومکس ابتدائی اور منتخب پوڈوکیٹ چوٹ کے بعد گردے کے فلٹر سیل سیل تعاملات کو ظاہر کرتا ہے۔
Jul 01, 2024
دائمی گردے کی بیماریاں (CKDs)ابھی تک عالمی سطح پر 700 ملین افراد کو متاثر کیا ہے۔مخصوصفیسی علاجکمی ہے.1 بہت سےگردے کی بیماریاں شروع ہوتی ہیں in دیگلوومیرولس, theفیگردے کی لٹریشن یونٹ۔ گلومیرولس (i) پوڈوکیٹس پر مشتمل ہوتا ہے، پیروں کے وسیع عمل کے ساتھ خصوصی پوسٹ مائٹوٹک خلیات جو ایک دوسرے کے ساتھ سلٹ ڈایافرامس بناتے ہیں اور گلومیرولر کیپلیریوں کے گرد لپیٹتے ہیں۔ (ii) اینڈوتھیلیل خلیات، جو مشترکہ گلوومیرولر بیسمنٹ میمبرین (GBM) پر پوڈوکیٹس کے مخالف ہوتے ہیں۔ (iii) mesangial خلیات، جو ایک میٹرکس بناتے ہیں جو گلوومیرولس کے لیے ساختی مدد فراہم کرتا ہے؛ اور (iv) parietal epithelial خلیات (PECs)، جو Bowman کیپسول کی لائن لگاتے ہیں۔2 Podocyte کی چوٹ، خاص طور پر، گردے کی بہت زیادہ مروجہ، ترقی پسند بیماریوں کا باعث بنتی ہے، بشمول ذیابیطس گردے کی بیماری (DKD)، فوکل سیگمنٹل گلوومیرولوسکلروسیس (FSGS)، اور نیفروٹک سنڈروم (دونوں idiopathic اور جینیاتی)۔ چوٹ کے کینونیکل پیٹرن کے نتیجے میں ایکٹین سائٹوسکیلیٹن کی دوبارہ ترتیب کی وجہ سے پوڈوسیٹ فٹ پروسیس، جسے فٹ پروسیس ایفیسمنٹ کہا جاتا ہے، کا نقصان ہوتا ہے۔ یہ افزائش سلٹ ڈایافرام میں خلل کا باعث بنتی ہے، یہ جسمانی رکاوٹ جو کہ ایک کے طور پر کام کرتی ہے۔فیlter، اس کے بعد پوڈوسیٹ لاتعلقی یا موت۔3,4 دوسری طرف، برقرار پوڈوکیٹس کے علاوہ، کی تشکیل اور دیکھ بھالglomerularفیلٹریشن رکاوٹکی ضرورت ہےانٹراگلومیرولر مواصلات، آٹوکرائن اور پیراکرائن سگنلنگ میکانزم کی ایک سیریز کے ذریعے مضبوطی سے کنٹرول کیا جاتا ہے۔ مثال کے طور پر، ویسکولر اینڈوتھیلیل گروتھ فیکٹر اے (وی ای جی ایف اے) پوڈوکیٹس کے ذریعے چھپے ہوئے اینڈوتھیلیل سیلز کے لیے ایک پروسروائیول سگنل ہے، اور پلیٹلیٹ سے ماخوذ گروتھ فیکٹر بی (PDGFB) اینڈوتھیلیل سیلز کے ذریعے چھپے ہوئے میسنجیئل سیلز کے لیے ایک پروسرائیول سگنل ہے۔5 سیل سیل کے ان تعاملات میں خلل اکثر گلوومرولر بیماریوں کے میزبان میں دیکھا جاتا ہے، بشمول FSGS اور DKD۔6 لہذا، گلوومیرولس میں ابتدائی خلل ڈالنے والی تبدیلیوں کی نشاندہی کرنا نئے اہداف اور علاج کی کامیابی کو بہتر بنانے کا موقع فراہم کر سکتا ہے۔گردے کی بیماریوں کا علاج.
کے لیے نئی جڑی بوٹیاںگردے کے امراض کا علاج
NIH نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ذیابیطس اینڈ ڈائجسٹو اینڈ کڈنی ڈیزیز کے تعاون سے DK103658، DK099465، اور DK095045 (AG) گرانٹ کرتا ہے۔ انٹراگلومیرولر کمیونیکیشن، جو آٹوکرائن اور پیراکرائن سگنلنگ میکانزم کی ایک سیریز کے ذریعے سختی سے کنٹرول ہوتی ہے۔ مثال کے طور پر، ویسکولر اینڈوتھیلیل گروتھ فیکٹر اے (وی ای جی ایف اے) پوڈوکیٹس کے ذریعے چھپے ہوئے اینڈوتھیلیل سیلز کے لیے ایک پروسروائیول سگنل ہے، اور پلیٹلیٹ سے ماخوذ گروتھ فیکٹر بی (PDGFB) اینڈوتھیلیل سیلز کے ذریعے چھپے ہوئے میسنجیئل سیلز کے لیے ایک پروسرائیول سگنل ہے۔ خلیوں کے تعاملات اکثر گلوومیرولر بیماریوں کے ایک میزبان میں دیکھے جاتے ہیں، جن میں FSGS اور DKD شامل ہیں۔ 6 اس لیے، گلوومیرولس میں ابتدائی خلل پیدا کرنے والی تبدیلیوں کی نشاندہی کرنے سے نئے اہداف اور گردے کی بیماریوں کے علاج کے لیے علاج کی کامیابی کو بہتر بنانے کا موقع مل سکتا ہے۔
سنگل سیل آر این اے سیکوینسنگ (scRNAseq) نے مخصوص خلل کے بعد پیچیدہ ٹشوز اور سیل سٹیٹس کی انفرادی سیل اقسام کا مطالعہ کرنے کی صلاحیت میں انقلاب برپا کر دیا ہے۔ 7,8 گردے میں حالیہ scRNAseq مطالعات نے صحت مند چوہوں میں گردے کے خلیوں کی اقسام کے ٹرانسکرپشن پروفائلز کے بارے میں بصیرت فراہم کی ہے۔ انسانی نمونے کے ساتھ ساتھ کچھ بیماری کی حالتوں میں، بشمول DKD اور lupus nephritis.9e12 تاہم، گلوومیرولر سیل ریاستوں کے تفصیلی مطالعے کو تجزیہ کے لیے دستیاب خلیوں کی بہت کم تعداد کی وجہ سے محدود کر دیا گیا ہے۔ مزید برآں، پوڈوسیٹ چوٹ پر تمام گلوومیریلر خلیوں میں ہونے والی ابتدائی سیل قسم کی مخصوص تبدیلیوں کی نگرانی نہیں کی گئی ہے اور ان کی وضاحت ابھی باقی ہے۔
ایک ضروری اینڈوجینس پروٹین، سی ٹی سی ایف کے پوڈوکیٹ مخصوص انڈیکیبل ڈیلیٹیشن کے ذریعے پوڈوکیٹ کا خاتمہ، پروگریسو پروٹینورک گردے کی بیماری اور CKD کا باعث بنتا ہے۔ 13 تاریخی طور پر، CKD ماؤس ماڈلز گردے کی چوٹ کو خارجی ٹاکسن یا سرجیکل مداخلتوں کے ذریعے پیدا کیے گئے تھے، جو کہ شارٹ فال کے نظام کو متاثر کرتے ہیں۔ ترتیب وار میکانکی تبدیلیوں کو دوبارہ بیان کرنا۔ سی ٹی سی ایف، ایک ضروری اینڈوجینس مالیکیول کا خاتمہ، تیزی سے پوڈوسیٹ کے نقصان، شدید ترقی پسند البومینیوریا، ہڈیوں کے معدنی میٹابولزم میں تبدیلی، گردے کی خرابی، اور قبل از وقت موت کا باعث بنتا ہے۔ حوصلہ افزائی پوڈوسیٹ چوٹ کے نتیجے میں انٹراگلومیرولر سیل سیل تعاملات میں تبدیلیاں۔ Podocyte CTCF اظہار iCTCFpod / چوہوں میں doxycycline-mediated Cre انڈکشن کے 1 ہفتے میں، ابتدائی وقت پر ناقابل شناخت ہے۔ موجودہ مطالعہ میں، ایک تفصیلی تجزیہ 1-ہفتے کے وقت کے نقطہ پر انجام دیا گیا تاکہ پوڈوسیٹ انجری کے ذریعے کارفرما انٹراگلومیرولر سیل سیل تعاملات میں ابتدائی تبدیلیوں کی نشاندہی کی جا سکے جو بالآخر CKD کی طرف لے جاتے ہیں۔
مواد اور طریقے
جانوروں کی دیکھ بھال
اس مطالعہ کو ہارورڈ میڈیکل اسکول کے بریگھم اور خواتین کے اسپتال میں جانوروں کی دیکھ بھال اور استعمال کمیٹی نے منظور کیا تھا۔ تمام جانوروں کے مطالعے برگھم اور خواتین کے ہسپتال، ہارورڈ میڈیکل اسکول میں اینیمل کیئر اینڈ یوز کمیٹی کے قائم کردہ اور منظور شدہ رہنما خطوط کے مطابق کیے گئے تھے۔ iCrepod-Ctcfwt/fl چوہے بنائے گئے جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے13 اور iCrepod-Ctcffl/fl (iCTCFfl/fL) اور iCrepod-Ctcfwt/wt [وائلڈ-قسم (WT)] چوہوں کو پیدا کرنے کے لیے پیدا کیا گیا تھا۔ اس تحقیق میں نر اور مادہ دونوں چوہوں کا استعمال کیا گیا۔ Doxycycline (4 g/L) (Sigma D9891) کو پینے کے پانی میں مسلسل دیا گیا جس میں iCTCFfl/fL (iCTCFpod / چوہے پیدا کرتا ہے) اور WT لیٹر میٹ کنٹرول چوہوں (6 سے 8) دونوں کو سوکروز (50 g/L) (VWR BDH0308) شامل تھا۔ doxycycline کے استعمال کے آغاز میں ہفتوں کی عمر) خاص طور پر پوڈوسیٹس میں Cre اظہار کو چلانے کے لیے۔
پورے گردے سے گلومیرولر افزودگی
iCTCFpod / اور WT چوہوں کو doxycycline علاج کے 1 ہفتے کے بعد قربان کیا گیا، اور گردے جلدی سے الگ کیے گئے اور برف کے ٹھنڈے ہینکس کے متوازن نمک کے محلول (کیٹلاگ نمبر 14170112، تھرمو سائنٹیفک، والتھم، ایم اے) سے دھوئے گئے۔ گردے کے کیپسول کو ہٹانے کے بعد، گلومیرولی کو چھلنی کی تکنیک کا استعمال کرتے ہوئے 4 C پر افزودہ کیا گیا 14 180-mm، 75-mm اور 53-mm چھلنی کے ساتھ۔ 53-ملی میٹر کی چھلنی سے جمع کیے گئے گلومیرولر افزودہ حصوں کو برف کے ٹھنڈے 1 ہینکس کے متوازن نمک کے محلول سے دھویا گیا اور برف پر رکھا گیا۔
سنگل سیل معطلی کی تیاری
لائبریری کی تیاری اور سنگل سیل کی ترتیب
سنگل سیلز کو 10 کرومیم 30 سنگل سیل پلیٹ فارم کے ذریعے کرومیم سنگل سیل 30 لائبریری، جیل بیڈ، اور چپ کٹس (10 جینومکس، پلیز اینٹون، CA) کا استعمال کرتے ہوئے کارخانہ دار کے پروٹوکول پر عمل کیا گیا۔ مختصراً، 10،000 سیلز کو چپ کے ہر چینل میں شامل کیا گیا تاکہ کرومیم آلے میں ایملشن میں جیل بیڈز میں تقسیم کیا جا سکے، اس کے بعد سیل لیسز اور بوندوں میں RNA کی بار کوڈ شدہ ریورس ٹرانسکرپشن۔ ایملشن کو توڑنے کے بعد ایمپلیفیکیشن، فریگمنٹیشن، اور اڈاپٹر اور سیمپل انڈیکس کا اضافہ کیا گیا۔ لائبریریوں کو ایک ساتھ جمع کیا گیا تھا اور Illumina HiSeq پر ترتیب دیا گیا تھا۔
ہائبرڈائزیشن چین کا رد عمل
تمام ہائبرڈائزیشن چین ری ایکشن (HCR) v3 ری ایجنٹس (Probes، hairpins، اور buffers) مالیکیولر ٹیکنالوجیز (Pasadena, CA) سے خریدے گئے تھے۔ بافتوں کے پتلے حصے (10 میٹر) 24-کنویں کے شیشے کے نیچے والی پلیٹوں (کیٹلاگ نمبر 82050-898, VWR, Radnor, PA) میں 1:5{{38} کے ساتھ لیپت کیے گئے تھے۔ } کی کمزوری ٹشو میں درج ذیل حل شامل کیے گئے تھے: 10% فارملین (کیٹلاگ نمبر 100503- 120، VWR) 15 منٹ کے لیے، 1 PBS کے دو واش (کیٹلاگ نمبر AM9625، تھرمو فشر سائنٹیفک)، 20 پر ice-cold 70% EtOH C 2 گھنٹے (رات بھر)، 0.2% ٹوین-20 (SSCT) کے ساتھ 5 نمکین سوڈیم سائٹریٹ کے تین واش (کیٹلاگ نمبر 15557044، تھرمو فشر سائنٹیفک)، ہائبرڈائزیشن بفر (مالیکیولر ٹیکنالوجیز) 10 منٹ تک، تحقیقات ہائبرڈائزیشن بفر راتوں رات، 15 منٹ کے لیے واش بفر (مالیکیولر ٹیکنالوجیز) کے چار واش، 5 SSCT کے تین واش، 10 منٹ کے لیے ایمپلیفیکیشن بفر (مالیکیولر ٹیکنالوجیز)، اور 5 SSCT کے ساتھ 15 منٹ کے تین واش (1:10،{31) }} DAPI، کیٹلاگ نمبر TCA2412-5MG, VWR) دوسرے واش میں۔ ہیئر پنوں کو راتوں رات ایمپلیفیکیشن بفر میں ہیٹ ڈینیچر کیا گیا تھا۔ نمونے 5 SSCT میں محفوظ اور امیج کیے گئے تھے۔ امیجنگ ایک گھومنے والی ڈسک کنفوکل (Nikon Eclipse Ti پر Yokogawa W1) آپریٹنگ NIS-elements AR سافٹ ویئر پر کی گئی تھی۔ تصویری تجزیہ اور پروسیسنگ امیج جے فجی سافٹ ویئر ورژن 2.1.0/1.53c (NIH، Bethesda، MD؛ http://imagej.nih.gov/ij) پر کی گئی تھی۔
ڈیٹا پروسیسنگ اور کوالٹی کنٹرول
A Cellranger toolkit (version 2.1.1) was used to perform demultiplexing using the cellranger mkfastq command and the cellranger count command for alignment to the mouse transcriptome, cell barcode partitioning, collapsing unique molecular identifier (UMI) to transcripts, and gene-level quantification. Cells were filtered to include cells expressing a minimum of 500 genes and a maximum of 4000 genes. Furthermore, the percentage of reads mapping to mitochondrial genes was capped at 12%. DoubletFinder was used to identify potential doublets.15 Clusters with >75% خلیات کو اعلی اعتماد والے ڈبلٹس کے طور پر درجہ بندی کیا گیا تھا مزید تجزیہ سے ہٹا دیا گیا تھا۔ بقیہ خلیات کو ہائی کنفیڈینس ڈبلٹس کے طور پر درجہ بند کیا گیا تھا انہیں بھی مزید تجزیہ سے ہٹا دیا گیا تھا۔ تجزیہ میں اس فرق کے حساب سے خلیوں کی تعداد کو کم کرنا شامل ہے۔ مثال کے طور پر، اگر کسی دیے گئے سیل کی قسم میں کم WT خلیات تھے، تو ICTCF خلیات کا ایک بے ترتیب نمونہ WT خلیات کی تعداد کے برابر تفریق اظہار کے تجزیہ کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔
غیر زیر نگرانی کلسٹرنگ اور جہتی کمی
Seurat R پیکیج16 ورژن 3 میں پہلے سے طے شدہ ترتیبات۔ . UMIs کی تعداد اور مائٹوکونڈریل جینز (ScaleData) میں ریڈز میپنگ کے تناسب کی وجہ سے ناپسندیدہ تغیر واقع ہوا۔ جہت میں کمی انتہائی متغیر جینوں پر پرنسپل جزو تجزیہ (رن پی سی اے) کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی۔ PCElbowPlot() فنکشن کو مزید تجزیہ کے لیے پرنسپل اجزاء میں فرق کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ تمام سیلز کو کلسٹر کرنے کے لیے، پہلے 40 پرنسپل اجزاء نے تمام تغیرات کو کافی حد تک پکڑ لیا۔ سالماتی طور پر الگ الگ کلسٹرز کی شناخت ڈیفالٹ پیرامیٹرز (FindClusters) اور 0.4 (FindNeighbours) کی ریزولوشن کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی۔ اعداد و شمار کو پروسیس کیا گیا اور اسکیل کیا گیا جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے گلوومرولر خلیوں کو سب سیٹ کرنے کے بعد۔ 0.3 (FindNeighbours) کی ریزولوشن میں ڈاؤن اسٹریم کلسٹرنگ کے لیے کل 30 پرنسپل اجزاء استعمال کیے گئے تھے۔
سیل کی قسم کی درجہ بندی
کلسٹر سے افزودہ یا مارکر جین کی گنتی Wilcoxon رینک سم ٹیسٹ (FindAllMarkers) کے ذریعے کی گئی تھی تاکہ کلسٹر سیلز میں جینز کے فرق کے اظہار کے لیے دوسرے تمام خلیات کے مقابلے اور ان جینز کو منتخب کیا جائے جو ایڈجسٹ شدہ P ویلیو (جھوٹی دریافت کی شرح) {{1 کے کٹ آف کو پاس کرتے ہیں۔ }}.05 بطور کلسٹر نمائندہ۔ کلسٹر شناخت کو بالغ گردے کے خلیوں کی اقسام کے لٹریچر سے تیار شدہ جینوں کی فہرست کے ساتھ ڈیٹا سے چلنے والے جینوں کا موازنہ کرکے تفویض کیا گیا تھا۔
امتیازی جین اظہار کا تجزیہ
Seurat (FindMarkers) میں جوڑے کے لحاظ سے تفریق اظہار کا تجزیہ لاگ فولڈ تبدیلی کی حد کو {{0}}.01 پر سیٹ اور پہلے سے طے شدہ پیرامیٹرز کے ساتھ استعمال کیا گیا تاکہ مخصوص کلسٹر میں iCTCFpod / اور WT خلیات کے درمیان امتیازی اظہار کا تجزیہ کیا جا سکے۔ FindMarkers کے اندر، ident.1 کو کلسٹر مخصوص iCTCFpod/خلیات پر سیٹ کیا گیا تھا، اور ident.2 کو متعلقہ کلسٹر کے مخصوص WT سیلز پر سیٹ کیا گیا تھا۔ ایڈجسٹ P <0.05 والے جین کو اہم سمجھا جاتا تھا۔
حد سے زیادہ نمائندگی کا تجزیہ
زیادہ نمائندگی کے تجزیے کا استعمال اس بات کا تعین کرنے کے لیے کیا گیا تھا کہ آیا کسی بھی معروف حیاتیاتی افعال یا عمل کو مختلف طریقے سے ظاہر کیے گئے جینز کی فہرست (فہرستوں) میں زیادہ نمائندگی یا افزودہ کیا گیا تھا۔ پہلے سے طے شدہ پیرامیٹرز استعمال کیے گئے تھے، اس کے علاوہ، ont Z BP، pvaluecutoff Z 0.25، اور qvaluecutoff Z 0.25۔ R پیکج enrichplot (GitHub, https://github.com/YuLab-SMU/enrichplot، آخری بار 30 اگست 2021 تک رسائی حاصل کی گئی) اس کے بعد افزودگی کے اعلیٰ شرائط کی منصوبہ بندی کرکے افزودگی کے نتائج کو دیکھنے کے لیے، خاص طور پر emapplot فنکشن کا استعمال کیا گیا۔
لیگینڈ ریسیپٹر تجزیہ
iTALK19 کو ligands کے رسیپٹرز کا نقشہ بنانے کے لیے استعمال کیا گیا تھا جو iCTCFpod/podocytes میں مختلف انداز میں ظاہر کیے گئے تھے۔ خاص طور پر، RawParse کا استعمال ہر جین کے اوسط اظہار کا حساب لگانے کے لیے کیا گیا تھا، سیورٹ سے سکیلڈ ڈیٹا کا استعمال کرتے ہوئے۔ ڈیٹا ٹائپ زیڈ میان کاؤنٹ کا استعمال کرتے ہوئے فائنڈ ایل آر کو لیگنڈ اور رسیپٹر جوڑوں کی شناخت کے لئے استعمال کیا گیا تھا۔ LRPlot کے پہلے سے طے شدہ پیرامیٹرز کا استعمال کرتے ہوئے دلچسپی کے لیگینڈ اور رسیپٹر جوڑے بنائے گئے تھے۔ لائنوں کی موٹائی لیگنڈ کے رشتہ دار اوسط اظہار کی نشاندہی کرتی ہے، اور تیر کے نشان کا سائز رسیپٹر کے رشتہ دار اوسط اظہار کی نشاندہی کرتا ہے۔
NicheNet تجزیہ
R پیکیج NicheNet20 کا استعمال ligandreceptor کے تعاملات کی پیشین گوئی کرنے کے لیے کیا گیا تھا جو کہ خلیے کی دلچسپی میں جین کے اظہار میں تبدیلیاں لا سکتے ہیں۔ اس تجزیہ کے لیے تمام پوڈوسیٹ کلسٹرز اور تمام اینڈوتھیلیل کلسٹرز کو یکجا کیا گیا تھا۔ تمام ڈیفالٹ پیرامیٹرز کو تیاری کے لیے 0.11 کی کم کٹ آف حد مقرر کرنے کے استثنا کے ساتھ استعمال کیا گیا تھا_ligand_ٹارگٹ_تصویر کے لیے۔ HCR امیج پروسیسنگ اور کوانٹیفیکیشن امیجز پر ImageJ2 سافٹ ویئر (NIH، Bethesda، MD؛ http://imagej.nih.gov/ij) کا استعمال کرتے ہوئے کارروائی کی گئی۔ ImageJ فائلوں کے لیے، ورژن 2.1.0/1.53c استعمال کیا گیا تھا (http://imagej.net/ Contributors (آخری بار 2 اگست 2020 تک رسائی حاصل کی گئی)۔ Raw ND2 فائلوں کو رولنگ بال طریقہ (رولنگ Z 50 سلائیڈنگ اسٹیک) کا استعمال کرتے ہوئے پس منظر کو گھٹا دیا گیا تھا۔ اس کے بعد زیڈ اسٹیک امیجز کی اوسط شدت کا اندازہ لگایا گیا تھا، اور سیل پروفائلر ورژن 3.1.5 (براڈ انسٹی ٹیوٹ آف ایم آئی ٹی اور ہارورڈ، کیمبرج، ایم اے) 21 کو الگ کر دیا گیا تھا۔ DAPI چینل اور باقی چینلز میں مربوط فلوروسینس کی پیمائش کے لیے چار WT اور چار iCTCFpod/ چوہوں کی تین 40 امیجز کی مقدار درست کی گئی تھی۔
Wecistanche کی معاون خدمت - چین میں سب سے بڑا cistanche برآمد کنندہ:
ای میل:wallence.suen@wecistanche.com
واٹس ایپ٪ 2ftel٪3a٪7b٪7b0٪7d٪7d
مزید تفصیلات کے لیے خریداری کریں:
https://www.xjcistanche.com٪2014-شاپ
گردے کے کام کے لیے 25% ایکیناکوسائیڈ اور 9% ایکٹیوسائیڈ کے ساتھ قدرتی آرگینک سیسٹانچ ایکسٹریکٹ حاصل کرنے کے لیے یہاں کلک کریں۔
