SLC37A2، فاسفورس سے متعلق ایک مالیکیول ہموار پٹھوں کے خلیوں میں کیلسیفائیڈ اورما میں بڑھتا ہے

عروقی کیلکیفیکیشنکا ایک بڑا ذریعہ ہےدل کی بیماریدائمی گردے کی بیماری کے ساتھ مریضوں میں.ہائپر فاسفیٹیمیاانٹرا سیلولر فاسفورس کی آمد میں اضافہ کی طرف جاتا ہے، جو عروقی ہموار پٹھوں کے خلیوں میں آسٹیو بلاسٹ جیسے خلیوں میں اضافہ کا باعث بنتا ہے۔ PiT-1 فاسفیٹ کو عروقی ہموار پٹھوں کے خلیوں میں منتقل کرتا ہے۔ تاہم، vascular calcification کے طریقہ کار کو مکمل طور پر نہیں سمجھا جاتا ہے. اس مطالعہ نے PiT-1 کے علاوہ امیدواروں کے فاسفورس سے متعلقہ مالیکیولز کی چھان بین کی۔ ہم نے یہ قیاس کیا کہ فاسفورس سے متعلق مالیکیولز سے تعلق رکھتے ہیں۔محلول بردار(SLC) انتہائی خاندانی طور پر عروقی کیلکیفیکیشن میں شامل ہوگا۔ ڈی این اے مائیکرو رے تجزیہ کے نتیجے میں، ہم نے SLC37A2 پر توجہ مرکوز کی اور دکھایا کہ ان خلیوں کا mRNA اظہار کیلسیفائیڈ aortic ہموار پٹھوں کے خلیات (AoSMC) پر بڑھتا ہے۔ SLC37A2 کو گلوکوز-6-فاسفیٹ/فاسفیٹ اور فاسفیٹ/فاسفیٹ ایکسچینج دونوں کو منتقل کرنے کی اطلاع دی گئی ہے۔ ان وٹرو تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ SLC37A2expression AoSMC پر سوزش سے متاثر نہیں ہوا تھا۔ کیلسیفائیڈ AoSMC میں SLC37A2 mRNA اور پروٹین کے اظہار میں اضافہ ہوا۔ Vivo میں، تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ شہ رگ میں SLC37A2 mRNA اظہاردائمی گردے کی بیماریچوہوں کا تعلق اوسٹیوجینک مارکر جینوں سے تھا۔ مزید برآں، SLC37A2 کا اظہار عروقی کیلکیفیکیشن ایریا میں کیا گیا تھا۔دائمی گردے کی بیماری چوہوں. نتیجے کے طور پر، ہم نے دکھایا کہ SLC37A2 مالیکیولز میں سے ایک ہے جس کے ساتھ اضافہ ہوتا ہے۔عروقی کیلکیفیکیشنوٹرو میں اور vivo میں۔

کلیدی الفاظ: SLC37A2،عروقی کیلکیفیکیشن، aortic ہموار پٹھوں کے خلیات،دائمی گردے کی بیماری, ہائپر فاسفیٹمیا

گردے کے کام کے لیے 25% ایکیناکوسائیڈ اور 9% ایکٹیوسائیڈ کے ساتھ قدرتی آرگینک سیسٹانچ ایکسٹریکٹ حاصل کرنے کے لیے یہاں کلک کریں۔

Wecistanche کی معاون خدمت - چین میں سب سے بڑا cistanche برآمد کنندہ:

ای میل:wallence.suen@wecistanche.com

واٹس ایپ٪ 2ftel٪3a٪7b٪7b0٪7d٪7d

مزید تفصیلات کے لیے خریداری کریں:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

کے ساتھ مریضوں کی تعداد کے طور پردائمی گردے کی بیماری(CKD)، مریضوں کی تعداد میں اضافہڈائیلاسز کی ضرورت ہےکے ساتھ ساتھ اضافہ ہو جائے گا. زیر علاج مریضوں میں سب سے زیادہ امواتڈائیلاسزکی وجہ سے ہیںقلبی امراضجیسا کہکارڈیک ناکامی, دماغی عوارض، یا myocardial infarction. (2) کا ایک بڑا ذریعہدل کی بیماریایکٹوپک کیلسیفیکیشن ہے، () نرم بافتوں میں کیلشیم فاسفیٹ کرسٹل کی تشکیل اور جمع ہونے کی وجہ سے ایک غیر معمولی بات ہے۔ (4 6) مختلف عوامل جیسے سوزش۔ آکسیڈیٹیو تناؤ، اور پلازما کیلشیم (Ca) اور فاسفورس (P) کی سطحوں میں اضافہ عروقی کیلکیشن کی ترقی میں شامل ہیں۔ ان عوامل میں سے، ہائپر فاسفیمیا سب سے زیادہ مضبوطی سے عروقی کیلکیفیکیشن سے وابستہ ہے۔ (7.8) Hyperphosphatemia گردوں کے افعال میں کمی کی موجودگی میں P کے زیادہ استعمال کی وجہ سے ہوتا ہے۔ لہذا، ڈائیلاسز سے گزرنے والے مریضوں کو P. (79-12) کی مقدار کو محدود کرنے کی ضرورت ہے تاہم، یہ اطلاع دی گئی ہے کہعروقی کیلکیفیکیشنجب ڈائیلاسز شروع ہوتا ہے تو پہلے ہی ترقی کر رہا ہوتا ہے۔ یہ ابتدائی مرحلے کے CKD والے مریضوں میں بھی دیکھا گیا ہے جب ہائپر فاسفیمیا واضح نہیں ہوتا ہے۔ (3) نتیجتاً، زندگی کی تشخیص کو بہتر بنانے کے لیے ابتدائی مرحلے کے CKD والے مریضوں میں ویسکولر کیلکیفیکیشن کو روکنا ضروری ہے۔

جو عروقی ہموار پٹھوں کے خلیوں (VSMC) میں P کی بڑھتی ہوئی آمد کا باعث بنتا ہے۔ P کی آمد PiT-1 کے ذریعے ہوتی ہے، VSMC کی سیل جھلی کی سطح پر ایک ٹرانسپورٹر۔ PiT- محلول کیرئیر (SLC) کا ایک رکن ہے، جس میں SLC20A1.04 کے ذریعے انکوڈ کردہ سوڈیم فاسفیٹ ٹرانسپورٹر شامل ہے PiT- فاسفیٹ کو Na پر منحصر خلیے کی جھلیوں میں منتقل کرتا ہے اور اس کے بعد پی ٹی کی سطح بلند ہونے کی وجہ سے میٹرکس معدنیات کی وجہ سے۔ P کی سطح بڑھ جاتی ہے، VSMC آسٹیوجینک ٹرانسکرپشن عوامل کا اظہار کرنا شروع کر دیتا ہے، جیسے کہ رنٹ سے متعلق ٹرانسکرپشن فیکٹر 2(Runx2)(16) اس اثر کے بعد آسٹیو بلاسٹ مخصوص جینز، جیسے آسٹیوپونٹن اور اوسٹیوکالسن کے اظہار میں اضافہ ہوتا ہے۔ اس کے علاوہ، ہموار پٹھوں کے مخصوص پروٹین کے اظہار کو کم کر دیا. جیسے ہموار پٹھوں کا پروٹین 22-0 (SM22-0)، ہوتا ہے۔ نتیجے کے طور پر، VSMC آسٹیو بلاسٹ جیسے خلیوں میں تبدیل ہو جاتا ہے۔ (1718)حالیہ طبی مطالعات سے معلوم ہوا ہے کہ خون میں کیلشیم کی سطح۔ پروٹین کے ذرات (CPP)، جو کیلشیم فاسفیٹ کولائیڈل ذرات کی نمائندگی کرتے ہیں، گردوں کے کام میں کمی کے ساتھ بڑھتے ہیں۔ (19-21) مزید برآں، خون کے CPP اور P کی سطحوں کے ساتھ ارتباط کی اطلاع دی گئی ہے۔

تاہم، عام پلازما P کی سطح کے ساتھ ابتدائی مرحلے کے CKD والے مریضوں میں ویسکولر کیلسیفیکیشن کا مشاہدہ کیا گیا ہے۔ (13) اس کے علاوہ PiT-1 mRNA کا اظہار تمام ٹشوز میں ہوتا ہے۔ اس طرح ایک اور مالیکیول بنیادی طور پر عروقی کیلکیفیکیشن کے علاقے میں کام کر سکتا ہے۔ اطلاعات ہیں کہسوزشvascular calcification کو فروغ دیتا ہے. سوزش کے عوامل جیسے کہ انٹرلییوکن (IL)-1B، IL-6، اور ٹیومر نیکروسس فیکٹر-الفا (TNF-a) VSMC کو آسٹیو بلاسٹ پسند خلیوں میں تفریق کا باعث بنا CAMP پاتھ وے کے ذریعے، جو آسٹیو بلاسٹ تفریق میں ایک کردار ادا کرتا ہے۔ IllB، IL-6، اور TNF-a بھی ایسے عوامل ہیں جو ہائی پی لیولز کی وجہ سے بڑھے ہوئے عروقی کیلکیفیکیشن سے وابستہ ہیں۔3233) تاہم۔ موجودہ اعداد و شمار عروقی کے طریقہ کار کی پوری طرح وضاحت نہیں کرتے ہیں۔

ان عوامل کی طرف سے حوصلہ افزائی کیلسیفیکیشن. ہم نے یہ قیاس کیا کہ P سے متعلق دیگر مالیکیولز بھی ہو سکتے ہیں جیسے کہ SLC سپر فیملی میں، عروقی کیلکیفیکیشن میں شامل ہیں۔ ہم نے SLC میں جھلی کے پروٹینز پر فوکس کیا اور عروقی کیلکیفیکیشن میں ملوث ہونے کے لیے PiT-1 کے علاوہ ممکنہ امیدوار P سے متعلقہ مالیکیولز کی چھان بین کی۔ مزید برآں، ہم نے ویڈیو اور ویوو میں امیدوار مالیکیولز اور ویسکولر کیلکیفیکیشن کے درمیان تعلق کی جانچ کی۔

مواد اور طریقے

سیل کلچر۔ لونزا (بیسل، سوئٹزرلینڈ) سے نارمل ہیومناورٹکس موتھ مسکل سیلز (AoSMC) حاصل کیے گئے تھے AoSMC کو کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق کلچر کیا گیا تھا۔ AoSMC کو گروتھ میڈیم میں برقرار رکھا گیا تھا (5% فیٹل بوائن سیرم (FBS) کے ساتھ ضمیمہ ہموار پٹھوں کے سیل بیسل میڈیم، ایپیڈرمل گروتھ فیکٹر، انسولین، فبروبلاسٹ گروتھ فیکٹر-B، اور gentamicin/amphotericin-B)۔ میڈیا ہر دوسرے دن تبدیل ہوتا رہا۔ AoSMC کو 37 ڈگری پر نمی والے 5% CO انکیوبیٹر میں اگایا گیا اور اس وقت تک برقرار رکھا گیا جب تک کہ سنگم تک نہ پہنچ جائے اور پھر تجربات میں استعمال کیا جائے۔

Calcified AoSMC. AoSMC کی Calcification کی حوصلہ افزائی کی گئی جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے۔ 435) AOSMC کو Dulbecco'smodified Eagles میڈیم میں 15% FBS اور penicillin-streptomycin کے ساتھ کلچر کیا گیا تھا اور 2.6 mM P کے ساتھ 3، 6 اور 12 دن کے لیے کلچر کیا گیا تھا۔ P کی حراستی کو P bufferNaH، PO/Na، اور HPO کے ذریعے ایڈجسٹ کیا گیا۔ پی ایچ 7.2)۔ دیگر AoSMCs 2.6 mM P کے ساتھ مہذب نہیں تھے۔

ڈی این اے مائیکرو رے۔ AoSMC نمونوں کا کل RNA 2.6 mM P کے ساتھ مہذب اور مہذب نہیں استعمال کیا گیا تھا۔ ٹوٹل آر این اے 5۔ SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver۔ 2 مائیکرو رے کا استعمال تقریباً 26،000 جینوں کی جانچ کے لیے کیا گیا تھا۔ تناسب کا حساب AoSMC کلچرڈ کے اظہار کی سطح کو 2.6 mM کے ساتھ 12 دن کے لیے AoSMC غیر مہذب کے اظہار کی سطح سے 2.6 mM P کے ساتھ تقسیم کر کے لگایا گیا تھا۔

ڈی این اے مائیکرو رے

AoSMC نمونوں کا کل RNA 2.6 mM P کے ساتھ مہذب اور مہذب نہیں استعمال کیا گیا تھا۔ ٹوٹل آر این اے 5۔ SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver۔ 2 مائیکرو رے کا استعمال تقریباً 26،000 جینوں کی جانچ کے لیے کیا گیا تھا۔ تناسب کا حساب AoSMC پر اظہار کی سطح کو 2.6 mM کے ساتھ 12 دن کے لیے AoSMC غیر مہذب پر اظہار کی سطح سے 2.6 mM P. SLC37A2 کے عروقی سوزش میں اظہار کے ساتھ تقسیم کر کے لگایا گیا۔ AoSMC میں اشتعال انگیز ردعمل پیدا کرنے کے لیے، خلیوں کو گروتھ میڈیم کے ساتھ کلچر کیا گیا یہاں تک کہ وہ سنگم پر پہنچ گئے اور پھر 1 ugmL lipopolysaccharides (LPS) (LPS from escherichia coli O111:B4؛ سگما، سینٹ لوئس، MO) کے ساتھ 24 اور 72 کے بغیر علاج کیا گیا۔ 2.6 mM P. دیگر AoSMC کو ریئل ٹائم پولیمریز چین ری ایکشن (PCR) تجزیہ کے ساتھ کلچر نہیں کیا گیا تھا۔ 24 اور 72 گھنٹے کے لئے ایل پی ایس کے ساتھ علاج کیے جانے والے اے او ایس ایم سی سے کل آر این اے نکالا گیا تھا اور ایل پی ایس کے ساتھ علاج نہیں کیا گیا تھا۔ ایس وائی بی آر گرین پر مبنی مقداری ریئل ٹائم پی سی آر کو مصنوعی سی ڈی این اے کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا تھا اور ہر ایک ٹارگٹ جین کے لیے ایک مناسب پرائمر سیٹ کیا گیا تھا جس میں aStepOnePlus ریئل ٹائم پی سی آر سسٹم (اپلائیڈ بایو سسٹم، فوسٹر سٹی، CA) تھا۔ پرائمر کی ترتیب حسب ذیل تھی: انسانی IL-6۔{32}}AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' اور {{34}GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'; انسانی SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3' اور 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3'؛ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- اور 5-CTCTGGGGIGGCAGTGATGGC-3.IL-6 اور SLC37A2 mRNA اظہار کی سطحوں کو GLCCHXD کے ساتھ کیلکولائزیشن کے بعد SLC37A2 ایم آر این اے ایکسپریشن لیولز کیلکولائزیشن کے ساتھ کیلکولائزیشن نارمل تھی۔ AoSMC۔ کل AoSMC سے 2.6 mM P کے ساتھ کلچر نہیں کیے گئے اور AoSMC سیل 2.6 mM P کے ساتھ 3، 6، 9، 12 اور 14 دنوں کے لیے نکالے گئے۔ ریئل ٹائم PCR ترکیب شدہ cDNA کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔ پرائمر کی ترتیب اس طرح تھی مندرجہ ذیل: انسانی Runx2، 5-TGAGAGCCGCTTCTCCAACCC-3'، اور 5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3۔ Runx2 اور SLC37A2 mRNA اظہار کی سطحیں APPH کے ساتھ نارملائزیشن کے بعد شمار کی گئیں۔

مغربی بلوٹنگ تجزیہ۔

کل پروٹین AoSMC نمونوں سے جمع کیا گیا تھا جو ریئل ٹائم پی سی آر تجزیہ کے لئے استعمال ہونے والی اسی شرائط کے تحت مہذب تھا۔ ان نمونوں کو Tris-buffered saline (pH 75) کا استعمال کرتے ہوئے 5% NP-40 اور 1% protease inhibitor کاک ٹیل کے ساتھ ملایا گیا تھا۔ بی سی اے پروٹین آسے کٹ (تھرمو فشر سائنٹیفک والتھم، ایم اے) کا استعمال کرتے ہوئے پروٹین کی حراستی کے نمونوں کی پیمائش کی گئی۔ اور ارتکاز کو ویسٹرن بلوٹنگ کے ذریعے ایڈجسٹ کیا گیا تھا، سوڈیم ڈوڈیسائل سلفیٹ-پولی کریلامائڈ جیل الیکٹروفورسس کا استعمال کرتے ہوئے 10% پولی کریلامائیڈ جیل میں 10 ugs پروٹین کو الگ کیا گیا تھا۔ جھلی کا علاج SLC37A2antibody (Novus Biologicals, Centennial, CO) یا GAPDH اینٹی باڈی (GeneTex, Irvine, CA) کے ساتھ بنیادی اینٹی باڈیز کے طور پر کیا گیا تھا، جو Rabbit lgG Horseradish peroxidase-conjugated antibody (R&D Systems، Minneary antibody) کے ساتھ لگایا گیا تھا۔ اور Amersham ECL سلیکٹ (GE Healthcare. Buckinghamshire, England) اور luminescent image analyzer (LAS-1000 plus, FUNIFILM, Tokyo, Japan) کا استعمال کرتے ہوئے تصور کیا گیا۔ lmagel کا استعمال کرتے ہوئے بینڈ کی مقدار درست کی گئی۔

تجرباتی

تمام مطالعاتی پروٹوکولز کو یونیورسٹی آف ہیوگو، سکول آف ہیومن سائنس اینڈ انوائرمنٹ کی اخلاقیات کمیٹی نے منظور کیا تھا۔ بارہ ہفتے پرانے نر، سپراگ ڈولی چوہوں کو جاپان SLC (شیزوکا، جاپان) سے خریدا گیا تھا۔ چوہوں کو ایک 12-روشنی، 12-گھنٹہ تاریک سائیکل (09:00-21:00) پر برقرار رکھا گیا تھا اور کھانے اور اضافی خالص پانی تک مفت رسائی کی اجازت دی گئی تھی۔

تجرباتی غذا میں ایک کنٹرول P خوراک (10% P، 0.6Ca، 20% پروٹین)، ایک ایڈنائن غذا (0.75% ایڈنائن) شامل ہے۔ ، 1۔ .6% Ca، 10%پروٹین)، اور AIN93-G غذا (اورینٹل خمیر، ٹوکیو، جاپان) کیسین کے ساتھ بطور پروٹین ماخذ۔ 3637) ایک کم پروٹین والی خوراک کی اطلاع دی گئی ہے کہ وہ چوہوں میں عروقی کیلکیفیکیشن کو فروغ دیتے ہیں جن میں ایڈنائن کی وجہ سے گردوں کی ناکامی ہوتی ہے، اس لیے پروٹین پر پابندی لگائی گئی تھی۔=23) کو ایک ہفتہ کے لیے معیاری MF خوراک (اورینٹل خمیر) کھلائی گئی 13 ہفتے کی عمر میں، چوہوں کو 2 گروپوں میں تقسیم کیا گیا تھا: کنٹرول گروپ (n=5) اور ایڈنائن سے متاثرہ CKD گروپ (n=18)۔ کنٹرول گروپ کو 6 ہفتوں کے لیے کنٹرول P خوراک ملی۔ . ایڈنائن سے متاثرہ CKD گروپ نے تقریباً 3 ہفتوں تک ایڈنائن کی خوراک حاصل کی اور پھر اسے مزید 2 ذیلی گروپوں میں تقسیم کیا گیا: CKD-LP گروپ (n=8) یا CKDHP گروپ (n=10)۔ CKD-LP گروپ اور CKD-HP گروپ کے چوہوں نے بالترتیب 3 ہفتوں کے لیے ایل پی ڈائیٹ اور HP ڈائیٹ حاصل کی، تجرباتی مدت کے دوران روزانہ کھانے کی مقدار ریکارڈ کی گئی۔ ایڈنائن غذا کے دوران، خون کے نمونے دم کی رگ سے 10:00 AM اور 11:00 AM کے درمیان دوسرے ہفتے تک ہفتے میں ایک بار اور اس کے بعد پلازما کی سطح کی نگرانی کے لیے ہر 2 دن میں ایک بار جمع کیے گئے۔ LP غذا یا HP غذا کے دوران، خون کے نمونے ہفتے میں ایک بار جمع کیے جاتے تھے۔ پیشاب کے نمونے جمع کیے گئے اور پیشاب کا حجم ہر ہفتے ایک بار ریکارڈ کیا گیا۔ چوہوں کو آئس فلورین (واکو پیور کیمیکل انڈسٹریز۔ اوساکا جاپان) اور لیپروٹومیز کا استعمال کرتے ہوئے بے ہوشی کی دوا کے ساتھ قربانی دی گئی۔ کمتر وینا کاوا اور تھوراکوابڈومینل شہ رگ سے لیے گئے خون کے نمونے تجزیہ کے لیے جمع کیے گئے۔

شہ رگ پر SLC37A2 اظہار۔

جمع شدہ تھوراکوابڈومینل شہ رگ کا تقریباً ایک تہائی حصہ کیلکیفیکیشن کو دیکھنے اور امیونوسٹیننگ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ شہ رگ پیرافین میں سرایت کر گئی تھی اور 4-um حصے کاٹے گئے تھے۔ مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق کیلشیم کٹ (پولی سائنسز. وارنگٹن، PA) کے لیے وان کوسا طریقہ استعمال کرتے ہوئے حصوں کو داغ دیا گیا تھا۔ امیونوسٹیننگ تجزیہ سیریل سیکشن کے ساتھ کیا گیا تھا۔ حصوں کو SLC37A2 اینٹی باڈی کے ساتھ راتوں رات 4 ڈگری پر انکیوبیٹ کیا گیا اور پھر کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ تک ہسٹو فائن سمپل سٹین ریٹ MAX-POMULTI) (نیچیری بایوسینسز، ٹوکیو، جاپان) کے ساتھ علاج کیا گیا۔ اس کے بعد، حصوں کا علاج DABsubstrate kit (Nichirei) سے کیا گیا۔

کل آر این اے باقی منجمد تھوراکوابڈومینل شہ رگ سے نکالا گیا تھا۔ ریئل ٹائم پی سی آر ترکیب شدہ سی ڈی این اے کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا تھا۔ پرائمر کی ترتیب حسب ذیل تھی: چوہا آسٹیو پونٹین، 5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' اور 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' اور؛ چوہا SLC37A2،{{8}TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' اور 5'-CTGATGGGCTTTCTGGACATG-3۔ آسٹیوپونٹن mRNA اور SLC37A2 mRNA اظہار کی سطحیں GAPDH کے ساتھ معمول پر آنے کے بعد شمار کی گئیں۔

شماریاتی تجزیہ.

ڈیٹا کو اوسط + SE کے طور پر پیش کیا جاتا ہے۔ ٹی ٹیسٹ کے ذریعے گروپوں کے درمیان اختلافات کا تجزیہ کیا گیا۔ فاسفیٹ سے حوصلہ افزائی کیلسیفائیڈ AoSMC تجربات میں، ڈنیٹ کے طریقہ کار کے بعد تغیر کے یک طرفہ تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے اختلافات کا تجزیہ کیا گیا۔ CKD ماڈل کے تجربات میں، K ruskal-Wallis ٹیسٹ کے بعد اسٹیل-Dwass طریقہ کے ذریعے اختلافات کا تجزیہ کیا گیا۔ اسپیئر مین کے ارتباطی گتانک رینک ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے ارتباط کے گتانک (rs) کا تعین کیا گیا تھا۔ تمام ٹیسٹوں کے لیے۔ دو دم والی p اقدار<0.05 were considered statistically significant.