Stx2 مختلف جین کے اظہار کی حوصلہ افزائی کرتا ہے اور قریبی نلکی میں سرکیڈین تال جین کو پریشان کرتا ہے Ⅱ

3. بحث

3.1 STEC مریضوں اور جانوروں کے ماڈلز میں قریبی نلی نما پیتھالوجی

اولیگوریا کی علامت ہے۔شدید نلی نما necrosis(اے ٹی این)۔ ATN کی وجہ سے، sloughed epithelial خلیات سیال کے بہاؤ کو کم کرنے کے لیے tubules کے lumen میں رکاوٹ ڈالتے ہیں جو oliguria کے طور پر ظاہر ہوتا ہے۔ STEC کے مریضوں میں، oliguria اور anuria اکثر ایسے نتائج ہوتے ہیں جو ATN کی تجویز کرتے ہیں۔ STEC متعدی بیماری کے ابتدائی مراحل کے دوران قربت والے نلی کے فنکشن میں کمی کو پیشاب کی 2MG اور NAG میں اضافہ کے طور پر دکھایا گیا ہے [3,33]۔ B2MG ایک 12 kDa چھوٹا پروٹین ہے جو آزادانہ طور پر گلوومیرولی کے ذریعے فلٹر کیا جاتا ہے اور صحت مند حالت میں قریبی نلیوں کے ذریعے مکمل طور پر جذب ہوتا ہے۔ تاہم، ایک بار قریبی نلیوں کو نقصان پہنچانے کے بعد، پیشاب میں 2MG کی مقدار بڑھ جاتی ہے اس طرح قربت والے نلی نما فنکشن کے لیے بائیو مارکر کے طور پر کام کرتی ہے۔ NAG 130 kDa کا ایک بڑا لائسوسومل انزائم ہے اور قربت والی نلی میں بڑا گلوکوسیڈیس ہے۔ بڑے سائز کی وجہ سے، گلوومیرولس NAG کو فلٹر نہیں کر سکتا جبکہ خراب شدہ proximal tubules NAG کو پیشاب میں خارج کرتے ہیں۔ اس طرح، پیشاب کی NAG میں اضافہ قریبی نلی نما نقصان کا ایک اور بائیو مارکر ہے۔ گلومیرولر ہسٹوپیتھولوجی جیسے کہ فائبرن میں رکاوٹ والے کیپلیریاں STEC کے مریضوں کی کثرت سے پائی جاتی ہیں۔ تاہم، مندرجہ بالا پیشاب کے اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ ابتدائی بیماری میں نلی نما نقصانات۔ اس کے علاوہ، STEC کے مریضوں کے پیشاب میں نلی نما اپیتھیلیم پر مشتمل کاسٹ ہوتے ہیں جو کہ نقصان دہ قربت والے نلی نما خلیات کے sloughing کا نتیجہ ہے [1]۔ جانوروں کے ماڈلز میں، قربت والے نلی نما خلیات کی sloughing اکثر STEC انفیکشن اور Stx انجیکشن ماڈلز [25–27,34] دونوں میں پائی جاتی ہے۔ موجودہ مطالعہ میں، ہمیں Stx2-انجیکٹ شدہ murine گردوں میں proximal tubular خلیات کا sloughing ملا جو Stx2-کی حوصلہ افزائی قربتی نلی نما تبدیلی (شکل 1) کا مشورہ دیتا ہے۔ نیز، ہمیں ماؤس اور دونوں میں Stx2 رسیپٹر Gb3 کا پتہ چلاانسانی گردے کے قریبی نلیاںلومینل سائیڈ ایکسپریشن کے ساتھ جو کہ قریبی نلیوں کے ساتھ Stx2 کے براہ راست تعامل کا اشارہ ہے (اعداد و شمار 2 اور 3)۔ PDK4 فاسفوریلیٹس پائروویٹ ڈیہائیڈروجنیز اپنی سرگرمی کو روکتا ہے جس کے نتیجے میں گلوکوز کے استعمال میں کمی اور طویل روزے اور بھوک کے جواب میں چربی کے تحول میں اضافہ ہوتا ہے۔ یہ الگ تھلگ اپکلا خلیوں کو لاتعلقی کی حوصلہ افزائی سیل موت (انوکیس) [35] سے بچاتا ہے۔ PDK4 کی ابتدائی چوٹی 4 h پر تھی، پھر ایک اور چوٹی 8 h پر تھی (شکل 5A)۔ اسے 12 گھنٹے پر کم کیا گیا، لیکن وہاں سے اس میں 72 گھنٹے تک بتدریج اضافہ ہوا جس میں لاگ2-گنا تبدیلی آئی اور 3 (12-گنا تبدیلی) (شکل 5A) کے ساتھ ختم ہوئی۔ اپکلا خلیات کی لاتعلقی Stx2-انجیکٹڈ ماؤس پروکسیمل نلی نما خلیات (سلاونگ) میں نسبتاً برقرار مورفولوجی (شکل 1) میں واقع ہوئی، یہ PDK4 اپ گریجولیشن کا عکاس ہو سکتا ہے۔

گردے کے لیے CISTANCHE TUBULOSA ایکسٹریکٹ پاؤڈر

چونکہ NHERF1 (SLC9A3R1) ایکسٹرا سیلولر میٹرکس [36]، ایکٹین سائٹوسکلٹن آرگنائزیشن، اور سیل مورفولوجی کو برقرار رکھنے میں خلیے کی معمول کی پابندی میں حصہ ڈالتا ہے، اس جین کے کم اظہار کے نتیجے میں خلیات کی کمی جیسے نتائج ہو سکتے ہیں (شکل 5K)۔

قریبی نلیوں پر Stx2 کا اثر STEC متعدی بیماری کے لیے ایک اہم عنصر لگتا ہے۔ تاہم، Vivo proximal tubular خلیات پر توجہ مرکوز کرنے والے جین کے اظہار میں تبدیلیاں پہلے دستیاب نہیں تھیں۔ کیپرز وغیرہ۔ [37] Stx2+LPS انجیکشن والے چوہوں کے گردوں میں مختلف جینز (DEGs) دکھائے اس طرح کہ زیادہ تر پہلے اور بڑے پیمانے پر تبدیل شدہ جین LPS کے اثر و رسوخ سے تھے اور بہت دیر سے تبدیل ہونے والے جین Stx2 اثر سے تھے۔ . ان کے اعداد و شمار نے گردے کے امتیازی جین کے اظہار میں قیمتی بصیرت ظاہر کی لیکن اس تبدیلی کے ذمہ دار خلیوں کی اقسام کو الگ نہیں کیا۔ موجودہ مطالعہ میں، ہم نے ماؤس سے مائیکرو رے ڈیٹا کا موازنہ کرکے ڈی ای جی کو تلاش کرنے کی کوشش کی جو قریبی نلی نما خلیوں سے وابستہ ہیں۔گردے اور انسانی پرائمری پروکسیمل نلی نماخلیات جن کا علاج Stx2 سے کیا گیا تھا۔

3.2 Stx میں ملوث قریبی نلی نما عوامل

3.2.1 سرگرمی (I)، Gb3 پر Stxs بائنڈنگ کے ذریعے سگنل کی نقل و حمل

Stxs کے B ذیلی یونٹس نان ریسیپٹر src ٹائروسین کناز یس فاسفوریلیشن [4] کو دلاتے ہیں۔ فاسفوریلیٹڈ یس اپنی کناز سرگرمی کے ذریعہ بہاو سگنلنگ مالیکیولز کو متحرک کرتا ہے اور سائٹوسکلٹن کو دوبارہ بنانے کی طرف جاتا ہے [5]۔ Y357 میں یس سے وابستہ پروٹین (YAP) فاسفوریلیشن YAP نیوکلیئر ٹرانسلوکیشن کو آمادہ کرنے کے لیے جانا جاتا ہے جہاں یہ CTGF [38] جیسے ٹارگٹ جینز کو آمادہ کرنے کے لیے ٹرانسکریشنل کو ایکٹیویٹر کے طور پر کام کرتا ہے۔ میٹری سیلولر پروٹینز CYR61 (CCN1) اور CTGF (CCN2) ایکسٹرا سیلولر میٹرکس (ECM) میں خفیہ ہوتے ہیں اور رسیپٹر انٹیگرینز اور سیل کی سطح سے منسلک ہیپران سلفیٹ پروٹیوگلائکنز (HSPGs) [9] کو بائنڈنگ کرکے سیل-ECM آسنجن کو برقرار رکھنے میں تعاون کرتے ہیں۔ CCN1 اور 2 ٹرانسکرپشن کا کلیدی مالیکیول YAP ہے، اور اسے Hippo سگنلنگ پاتھ وے کے تحت نارمل حالت میں غیر فعال (سیرین ریزیڈیو 127 پر فاسفوریلیٹڈ) رکھا جاتا ہے۔ ایک بار جب کم سیل سیل آسنجن کا پتہ چل جاتا ہے، YAP (S127) مزید فاسفوریلیٹ نہیں ہوتا ہے جس سے اسے نیوکلئس میں داخل ہونے کی اجازت ملتی ہے، اور CCN1 اور 2 کی نقل میں اضافہ ہوتا ہے [41–43]۔ CCN1 اور 2 سیل کھوئے ہوئے بافتوں کی مرمت کے لیے زخم بھرنے والے مالیکیولز کے طور پر کام کرتے ہیں [38,44]۔ ہمارے ڈیٹاسیٹ میں، CCN1 اور 2 کے پاس پہلے کے ٹائم پوائنٹ (6 h) پر چھوٹی چوٹیاں تھیں۔ یہ Stx2 بائنڈنگ-حوصلہ افزائی ہاں ایکٹیویشن کی عکاسی کر رہا ہے۔ بعد کے گھنٹوں، 12 گھنٹے یا بعد میں CCN1 اور 2 کے زیادہ اظہار کو دلانے کے لیے Hippo سگنلنگ پاتھ وے کو بند کر کے Sloughing نے مزید YAP ایکٹیویشن کو متحرک کیا ہو گا (شکل 5C)۔

3.2.2 سرگرمی (II)، ER-Stress/UPR کو دلانا

Stxs ER تک پہنچتے ہیں، جہاں A1 کے ٹکڑے اور B ذیلی یونٹس کھولے ہوئے پروٹین کی نقل کرتے ہیں [9,10,45,46]۔ گلوکوز ریگولیٹڈ پروٹین 78 kDa (Grp78، بائنڈنگ امیونوگلوبلین پروٹین (Bip)) تین UPR کلیدی پروٹین Inositol-Requiring enzyme-1 (Ire-1)، پروٹین kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) کو لنگر انداز کر رہا ہے۔ ) اور عام حالت کے دوران ER جھلی میں ٹرانسکرپشن فیکٹر 6 (ATF6) کو چالو کرنا۔ تاہم، Grp78 کی انفولڈ پروٹینوں سے زیادہ تعلق کی وجہ سے، یہ ان لنگر والے پروٹینوں کو جاری کرتا ہے۔ ATF6 ریلیز کے بعد چالو ہوتا ہے اور CHOP (DDIT3) اور X-box بائنڈنگ پروٹین 1 (XBP-1) mR NAs کو بڑھاتا ہے، جبکہ Ire-1 XBP-1 mRNA کو XBP بنانے کے لیے الگ کرتا ہے{{ 22}} پروٹین، جو CHOP (DDIT3) ٹرانسکرپشن میں حصہ ڈالتا ہے۔ PERK ایکٹیویشن ATF4 ایکٹیویشن کی طرف لے جاتا ہے جو CHOP (DDIT3) mRNA کو بھی بڑھاتا ہے۔ لہذا، CHOP (DDIT3) mRNA میں اضافہ UPR [47,48] کی ایک پہچان ہے۔ Stxs کو UPR دلانے کی اطلاع دی جاتی ہے اور CHOP (DDIT3) کو ہمارے ڈیٹاسیٹ (شکل 5D – G) میں الگ کردیا گیا ہے۔

GDF15 کا تعلق ٹرانسفارمنگ گروتھ فیکٹر بیٹا (TGF) فیملی سے ہے۔ حال ہی میں، GDF15 کو ذیابیطس کی دوا میٹفارمین کی وجہ سے وزن میں کمی میں ثالثی کے لیے دکھایا گیا ہے [49]۔ میٹفارمین زبانی طور پر زیر انتظام چوہوں میں، آنتوں اور گردوں کے GDF15 mRNA میں اضافہ ہوا جس کے نتیجے میں سیرم GDF15 میں اضافہ ہوا۔ GDF15 کی گردش کھانے کی مقدار کو دبانے اور جسمانی وزن کو کم کرنے کے لیے برین اسٹیم سے محدود رسیپٹر کے ذریعے کام کرتی ہے [50]۔ میٹفارمین کے زیر انتظام چوہوں میں، رینل GDF15 میں اضافہ کم از کم جزوی طور پر CHOP (DDIT3) کے ضابطے کے تحت ہوتا ہے۔ ہمارے ڈیٹاسیٹ کے Stx2-کے چوہوں کے گردوں کے انجیکشن میں، CHOP (DDIT3) ابتدائی طور پر 4 گھنٹے پر ایک بہت ہی چھوٹی چوٹی کے ساتھ بڑھتا ہے اور پھر 48 گھنٹے کی طرف بڑھتا ہوا رجحان شروع ہوتا ہے جہاں اس نے لاگ کی سطح کو برقرار رکھا{{16} }} 1.3 کے ارد گرد گنا تبدیلی (شکل 5E)۔ STRING کلسٹر تجزیہ کے مطابق، GDF15 ٹرانسکرپشن عوامل CHOP (DDIT3) اور ATF3 (Figure 5E) [51,52] سے فعال ان پٹ حاصل کرتا ہے۔ Stx2-انجیکٹ شدہ مورین کا وزن 24 گھنٹے کے بعد کم ہونا یا نمکین کنٹرول سے ہٹنا شروع ہو گیا (فگر S3B)۔ 12 گھنٹے پر گردے میں GDF15 mRNA میں اضافے نے دماغی نظام کو خوراک کی مقدار کو کم کرنے کے لیے متاثر کیا ہو سکتا ہے، جو کہ وزن میں کمی کے طور پر ظاہر ہوا (اعداد و شمار 5E اور S3B)۔ چونکہ 24 گھنٹے کے بعد GDF15 اظہار کی سطح بلند ہوتی رہی، چوہوں نے اپنا وزن کم کرنا جاری رکھا (اعداد و شمار 5E اور S3B)۔

ER-تناؤ پر، PERK Grp78 (Bip) سے جاری ہوتا ہے اور فاسفوریلیٹ میں oligomerizes اور eIF2 کو روکتا ہے جس کے نتیجے میں عالمی ترجمہ کے جبر کا باعث بنتا ہے، سوائے چند UPR- جوابی پروٹین جیسے کہ ATF4، CHOP، اور Grp78 کے۔ GADD34 (پروٹین فاسفیٹیس 1 ریگولیٹری سبونائٹ 15A (PPP1R15A)) فاسفوریلیٹڈ eIF2 (eIF2 (P)) سے وابستہ انحبیشن کے تحت بڑھے ہوئے پروٹینوں میں سے ایک ہے اور ہمارے ڈیٹاسیٹ (شکل 5D، G) میں اپ ریگولیٹڈ ہے۔ GADD34 ایک پروٹین فاسفیٹیز ہے-1 جو EIF2 (P) کو منفی طور پر UPR کی حوصلہ افزائی پروٹین کی ترکیب کی روک تھام کو منظم کرنے کے لیے dephosphorylates کرتا ہے [53]۔ GADD34 (PPP1R15A) اظہار ہمارے ڈیٹاسیٹ میں Stx2 کے 12 h کے بعد 1 سے بڑی تبدیلی log2-بن جاتا ہے اور 24 گھنٹے تک بڑھتا رہتا ہے جب یہ سطح مرتفع ہوتا ہے (لاگ2-فولڈ تبدیلی 2.1 کے برابر ہوتی ہے) اور اسے برقرار رکھتی ہے۔ آخر تک سطح (شکل 5D، جی)۔ اس سے پتہ چلتا ہے کہ Stx2-کی حوصلہ افزائی UPR کو 12 گھنٹے کے بعد منفی رائے ملی۔ CHOP (DDIT3, GADD153) کا بڑھتا ہوا ٹرانسکرپشن اور ترجمہ ER- تناؤ کی پہچان ہے اور تفریق اظہار کا نمونہ GADD34 سے ملتا جلتا ہے سوائے 1 سے بڑا لاگ 2 24 گھنٹے کے بعد ہوتا ہے اور اس کے بعد آہستہ آہستہ سطح مرتفع ہوتا ہے (log2 1.3 کے برابر ہوتا ہے) (شکل 5D)۔ نیز، CEBPB، جو CHOP کا سب سے بڑا dimerizing پارٹنر ہے، کو ہمارے ڈیٹاسیٹ (شکل 5D، G) میں الگ کر دیا گیا ہے۔ یہ نتائج بتاتے ہیں کہ جب کہ Stx2-حوصلہ افزائی ER تناؤ وقت کے کورس میں بہت ابتدائی طور پر شروع ہوتا ہے، یہ اثر کو 24 گھنٹے تک بڑھاتا ہے اور ER تناؤ کی اس سطح کو آخر تک برقرار رکھتا ہے جبکہ منفی تاثرات کا بازو بھی بیک وقت خود کو متوازن رکھتا ہے۔

3.2.3 سرگرمی (III)، رائبوزوم غیر فعال کرنے والی پروٹین (RIP) سرگرمی

rRNA سے ایڈنائن کو صاف کرکے، Stxs ڈی نوو پروٹین کی ترکیب کو روکتا ہے۔ Depurinated rRNA رائبوسومل مورفولوجی کی تبدیلی پر اثر انداز ہوتا ہے، جو سگنل کی نقل و حرکت کو چالو کرتا ہے [11] جسے رائبوٹوکسک اسٹریس رسپانس (RSR) کہا جاتا ہے، جس کی وجہ سے خصوصیت جین ایکٹیویشن ہوتی ہے (اگلا پیراگراف دیکھیں)۔

3.2.4 سرگرمی (IV)، Ribotoxic Stress Response (RSR) سرگرمی

ZAK (ایک MAPKKK) RSR میں جانا جاتا کناز ہے اور JUN N ٹرمینل kinase (JNK) اور p38 MAPK کے راستوں کو چالو کرتا ہے [12,15]۔ Stx1 انسانی آنتوں کے اپکلا خلیوں میں JUN اور FOS mRNA اظہار کی حوصلہ افزائی کرتا ہے اور اس واقعہ کو RIP سرگرمی-مثبت Stx1 کی ضرورت ہوتی ہے جس کے بارے میں خیال کیا جاتا ہے کہ یہ RSR کنٹرول میں ہے [15]۔ ایک اور آر ایس آر ڈاون اسٹریم مالیکیول، پی 38 ایم اے پی کے، ابتدائی ردعمل کے جینز جیسے کہ جون، ایف او ایس، ای جی آر 1، ایم اے ایف ایف، ڈی ڈی آئی ٹی 3 اور اے ٹی ایف3 [54] کو دلانے کے لیے جانا جاتا ہے، ان سبھی کا ہمارے ڈیٹاسیٹ میں مختلف انداز میں اظہار کیا گیا تھا۔ JNK اور p38 MAPK کے راستے بھی UPR (اعداد و شمار 4B,D اور 5B,E,F) [47] کے تحت Ire-1 کے بہاو کے واقعات کو چالو کرنے کے لئے جانا جاتا ہے۔ اس کی وجہ سے، Stxs RSR اور/یا UPR کے ذریعے ان دو راستوں کو فعال کر سکتا ہے۔ ایکسٹرا سیلولر سگنل ریگولیٹڈ کناز (ERK) 1/2 پاتھ وے کو بھی RSR [55] کے بہاو میں دکھایا گیا ہے اور DUSP1 (MKP1) جین کو ERK1/2 پاتھ وے [56] سے متاثر کیا جاتا ہے۔ Stx1 اور anisomycin (ایک اور پروٹین کی ترکیب روکنے والا) Caco-2 خلیوں میں DUSP1 اظہار دلانے کی صلاحیت رکھتے ہیں [57]۔ ہمارے ڈیٹاسیٹ میں، DUSP1 اظہار کی حوصلہ افزائی کی گئی تھی اور یہ ERK1/2 ایکٹیویشن (شکل 4B، D) کی نشاندہی کر سکتا ہے۔

3.2.5 سرگرمی (V)، خاص جین ٹرانسکرپشن سائٹوکائن کی طرف لے جاتی ہے۔

Secretion IL-8 secretion in Stxs-treated cells, human intestinal cells in particular, has been reported extensively as a downstream factor of RSR [12,58]. Cytokines and chemokines in animal models revealed CXCL1 and CXCL10 expression within Stx2-treated mouse kidneys [37,59]. IL-8 (CXCL8) and CXCL1 are both neutrophil chemoattractants that utilize CXCR2 as their receptor. IL-8 is expressed in humans but not in mice. In our dataset, human RPTEC showed an increase in IL-8 expression by log2 equals 4.6-fold maximum (log2 values were 4.6, 3.52 and 4.48 at 6, 13, and 19 h after Stx2, respectively). As we extracted common DEGs from mouse kidney and human proximal tubular cells IL-8 was not included in the final dataset. Instead, the molecule with similar function as IL-8, CXCL1 showed a significant increase as a common DEG (Figure 5L). A downstream pathway of UPR is the NF-κB signaling pathway. NFKBIA (IκBα) is an inhibitory factor of the classical (canonical) NF-κB pathway that binds with NF-κB subunits RelA (p65) and p50. Upon phosphorylation by an upstream kinase, NF-kappa B kinase (IKK), NFKBIA (IκBα) is degraded, thus NF-κB can translocate to the nucleus and induce transcription of inflammatory factors. RelB proto-oncogene nuclear factor-kappa B subunit (RelB) is involved in the alternative (non-canonical) NF-κB pathway and induces inflammatory factor expression. RelB-p50 or -p52 dimers act as a transcription factor (NF-κB) when phosphorylation of p100 of RelB-p50-p100 or RelB-p100 complexes is done by IKKα homodimers and this step does not involve IκBα. In our dataset, both NFKBIA and RelB were differentially expressed reaching to log2-fold change >بالترتیب 24 اور 48 گھنٹے کے بعد 1 (شکل 5F)۔ اس سے پتہ چلتا ہے کہ NF-κB دونوں راستوں کے تحت ہیٹ جینز، IκB (کلاسیکی) اور RelB (متبادل) کی حوصلہ افزائی کی جاتی ہے۔ چونکہ CHOP (DDIT3) تفریق اظہار 24 گھنٹے کے بعد 1 سے زیادہ لاگ 2 سے زیادہ ہو جاتا ہے، ماؤس کا گردہ UPR سے گزرتا ہے، اس طرح NFKBIA [60] کے ترجمے کو روکنے کے لیے PERK فاسفوریلیٹس یوکرائیوٹک ٹرانسلیشن انیشیشن فیکٹر 2 سبونائٹ الفا (eIF2) کو چالو کیا جاتا ہے۔ اس وجہ سے، NFKBIA mRNA میں اضافہ NF-κB کے زیادہ تر راستے کو روک نہیں سکتا، اس طرح سوزش کے عوامل کی نقل کی اجازت ہے (شکل 5L)۔

Sobbe et al. [61] نے ظاہر کیا کہ کلاسیکی (RelA-p50) اور متبادل (RelB-p52) NF-κB دونوں راستے Stx انجیکشن والے چوہوں میں سرگرم تھے جو RelA-ٹارگٹ سائٹوکائنز CCL20، CXCL1 اور CXCL10 کے اپ گریجولیشن کا پتہ لگاتے تھے جن کا ہمارے میں بھی مختلف اظہار کیا گیا تھا۔ ڈیٹاسیٹ (شکل 5L)۔

3.2.6 سرگرمی (VI)، Stxs-Induced Apoptosis

کلیویڈ کیسپیس 3 Stxs سے وابستہ سیل موت [13,15,62] میں پایا گیا ہے۔ یہ دکھایا گیا ہے کہ کیسپیس-3 کو چالو کرنا یا Stxs کے ذریعے apoptosis کی شمولیت RSR اور UPR کے تناظر میں ہوتی ہے۔ Stxs کی حوصلہ افزائی RSR میں، p38 MAPK اور JNK دونوں راستے شامل ہیں [15] نیز ERK ایکٹیویشن کی اطلاع دی گئی ہے [55]۔ دوسری طرف UPR NF-κB، JNK اور p38 MAPK راستوں کو دلانے کے لیے جانا جاتا ہے۔ یو پی آر کے تحت CHOP (DDIT3) کو apoptosis [63] میں ملوث دکھایا گیا ہے اور یہ Stxs سے وابستہ apoptosis [13] میں بھی دکھایا گیا ہے۔ UPR-حوصلہ افزائی apoptosis میں JNK کی شمولیت کی بھی اطلاع دی گئی ہے [64]۔ ہمارے ڈیٹاسیٹ میں، کئی DEGs جیسے CHOP (DDIT3)، NFKBIA، FOS، JUN، اور JUNB RSR اور UPR (شکل 5B، F) میں شامل ہیں۔

3.3 Stx2 کے ذریعہ سرکیڈین ڈیس ریگولیشن

سیرم اینڈوتھیلین میں اضافہ-1 (ET-1, EDN1) STEC-HUS کے مریضوں میں ہوتا ہے [65]۔ اس کے علاوہ، تجرباتی طور پر، Stx2 MAPKs [66] پر مشتمل سگنل کی نقل و حمل کے جھرنوں کو چالو کرکے EDN1 اظہار کی حوصلہ افزائی کرتا ہے، جبکہ UPR EDN1 ٹرانسکرپشن [67] کو دلانے کے لیے جانا جاتا ہے۔ ہمارے ڈیٹاسیٹ میں، ماؤس گردے اور انسانی قربت والے نلی نما خلیات (شکل 5G) دونوں میں Stx2 علاج سے متاثر EDN1 اظہار۔ چونکہ EDN1 جین کا اظہار ماؤس کے گردے اور انسانی قربت والے نلی نما اپکلا خلیات کا ایک عام فرق تھا، اس سے پتہ چلتا ہے کہ EDN1 کا اظہار کم از کم جزوی طور پر، اینڈوتھیلیل خلیوں کے علاوہ vivo میں proximal tubular epithelial خلیات میں ہوتا ہے۔ نیز، سیکریٹڈ ET-1 MAPK ایکٹیویشن [68] کے ذریعے EGR1 اظہار کی حوصلہ افزائی کرتا ہے۔ ہمارا ڈیٹا EGR1 کے وقت میں اپ گریجولیشن کی تصدیق کرتا ہے جب EDN1 کو اپ گریڈ کیا جاتا ہے (شکل 5H)۔ EGR1 سرکیڈین تال کلیدی عنصر PER1 اظہار [69] کی حوصلہ افزائی کرتا ہے، اس طرح، دوسرے سرکیڈین عوامل (شکل 5H) کے طول و عرض کو ایڈجسٹ کرتا ہے۔

سرکیڈین ریگولیشن میں، CLOCK-BAML1 (ARNTL) کا heterodimer PER1 اور CRY1 کو اپ گریڈ کرتا ہے۔ بدلے میں، PER1-CRY1 heterodimer CLOCK-BAML1 (ARNTL) سے منسلک ہوتا ہے تاکہ ان کی اپنی مزید نقل کو دبایا جا سکے، اس لیے سرکیڈین تال کا ایک منفی لوپ بناتا ہے۔ اس طرح، مثبت ریگولیٹر جینز (CLOCK اور BAML1 (ARNTL)) اور منفی ریگولیٹر جینز (PER1 اور CRY1) کے اظہار کی چوٹیاں ایک متبادل گھنٹے میں ہوتی ہیں جب CLOCK اور BAML1 (ARNTL) کے اظہار میں اضافہ ہوتا ہے، PER1 اور CRY1 میں کمی واقع ہوتی ہے، اور پیٹرن اگلے گھنٹوں میں بدل جاتا ہے۔ جب ہم نے گراف (شکل 5J) میں CLOCK اور BAML1 (ARNTL) کی لاگ2-فولڈ تبدیلی کی قدریں شامل کیں، پہلے وقت کے پوائنٹس کے دوران، PER1 اور BAML1 (ARNTL) نے تیز/تنگ چوٹیوں کے ساتھ ایک مخالف تال کا نمونہ دکھایا، تاہم، 24 گھنٹے کے بعد چوٹیاں مدھم ہونا شروع ہو جاتی ہیں اور بغیر تال کے مسلسل بڑھ جاتی ہیں۔ اس کا مطلب یہ ہے کہ Stx2 نے گردے کی سرکیڈین تال کو متاثر کیا جس میں قربت والی نلیاں بھی شامل ہیں۔ اگرچہ مزید تصدیقی تجربے کی ضرورت ہے، ہمارے اعداد و شمار شائع شدہ لٹریچر کے ساتھ مل کر جو محرکات [70,71] پر رینل سرکیڈین ریگولیشن پر PER1 اثر کو بیان کرتا ہے، سرکیڈین تال کی خرابی میں ممکنہ Stx2 کی شمولیت اور رینل کلاک جینز کو کم کرکے قربت والے نلی نما افعال پر اثرات تجویز کرتا ہے۔ ریگولیٹڈ عوامل جیسے SGLT1 (SLC5A1) (شکل 5K)۔ درحقیقت، ہم نے Stx2-انجیکٹڈ چوہوں میں گلوکوزوریا کا مشاہدہ کیا جو Stx1-انجیکٹڈ چوہوں [21] کے ساتھ ایک اور تحقیق میں دوبارہ پیدا ہوتا ہے جو کہ قربت والے ٹیوبلز (ٹیبل 3) میں SGLT1 (SLC5A1) کی خرابی کی نشاندہی کرتا ہے۔ ہمارے بہترین معلومات کے مطابق، یہ پہلی رپورٹ ہے جو گردوں کے سرکیڈین تال میں خلل میں Stx2 کے ملوث ہونے کی نشاندہی کرتی ہے۔

4. نتائج

ہم نے قریبی نلیاں سے وابستہ تاثرات سے متعلق اہم جینوں کا تعین کیا جو Stx2 کے ذریعہ تبدیل کیا گیا تھا۔ ان جینوں کا امتیازی اظہار Stx2 سرگرمیوں جیسے UPR انڈکشن، rRNA depurination سے وابستہ RSR، اور پلازما میمبرین ریسیپٹر Gb3 بائنڈنگ کے ذریعہ سگنل کی نقل و حمل کا نتیجہ سمجھا جاتا ہے۔ سب سے زیادہ ظاہر شدہ جین، GDF15، Stx2 کی وجہ سے ہونے والے وزن میں کمی کو متاثر کر سکتا ہے جو کہ دماغی خلیہ پر پابندی والے رسیپٹرز کے ذریعے خوراک کی مقدار کو کم کر کے۔ ایکسٹرا سیلولر میٹرکس اور سیل آسنجن PDK4، NHERF1 (SLC9A3R1)، CYR61، اور CTGF سے متاثر ہو سکتے ہیں جو Stx2-مخصوص ہسٹوپیتھولوجی، اور sloughing کا سبب بنتے ہیں۔ مزید برآں، Stx2 کے ذریعے گردوں کے سرکیڈین تال میں خلل پڑنے کے نتیجے میں گلوکوز ری ایبسورپشن جیسے قریبی نلی نما فنکشنل نقائص پیدا ہو سکتے ہیں۔

5. مواد اور طریقے

5.1 جانور چوہے ۔

(C57BL/6، مرد، 19–22 جی، مخصوص پیتھوجین فری) چارلس ریور لیبارٹریز جاپان، انکارپوریٹڈ (یوکوہاما، جاپان) سے خریدا گیا تھا۔ خوراک اور پانی کو اشتہا دی گئی۔ چوہوں کو معیاری 12 گھنٹے کے ساتھ برقرار رکھا گیا تھا: 12 گھنٹے ہلکے تاریک سائیکل جس میں روشنی صبح 7 بجے اور شام 7 بجے بند ہوتی ہے جانوروں کے کمرے کا درجہ حرارت 24 ◦C کے ارد گرد رکھا گیا تھا۔ تمام طریقہ کار کو یونیورسٹی کے جانوروں کی دیکھ بھال کی کمیٹی نے منظور کیا تھا۔

5.2 انسانی گردے کے ٹشو

اس تحقیق میں بغیر کسی ذاتی شناخت کے کیڈیور ٹشو کا استعمال کیا گیا تھا، اور اسے یونیورسٹی کے انسانی تحقیقاتی رہنما خطوط سے مستثنیٰ سمجھا جاتا ہے۔

5.3 سیل کلچر

ہیومن رینل پروکسیمل ٹیوبلر اپیتھیلیل سیل (RPTEC) پرائمری کلچر کلونیٹکس (Walkersville, MD, USA) سے خریدا گیا تھا اور اسے 37 ◦C، 5% CO2 ماحول پر برقرار رکھا گیا تھا۔ خلیوں کو رینل اپیٹیلیل سیل گروتھ میڈیم میں کلچر کیا گیا تھا جس میں انسانی ایپیڈرمل گروتھ فیکٹر، ہائیڈروکارٹیسون، ایپی نیفرین، انسولین، ٹرائی آئوڈوتھیرون، ٹرانسفرن، GA-1000، اور FBS شامل ہیں۔

5.4 LPS-Free Stx2 کی Purification Stx2 سے LPS ہٹانے کا کام انجام دیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [72]۔ مختصراً، اینٹی Stx2 11E10 اینٹی باڈی کنجوگیٹڈ کالم کو Stx2 فریکشن حاصل کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا، اور اس فریکشن کو بعد میں Detoxi-gel (تھرمو فشر سائنٹیفک، راک فورڈ، IL، USA) سے گزارا گیا تھا۔ ایل پی ایس کو ہٹانے کے لئے۔ Stx2 فریکشن کو 0.2 µm فلٹر کے ساتھ فلٹر کیا گیا تھا اور LPS لیول کا تجربہ Limulus amebocyte lysate assay (Pyrotell, Associates of Cape Cod Incorporated, East Falmouth, MA, USA) کے ساتھ کیا گیا تھا۔ Stx2 فریکشن کا تعین 0.03 اینڈوٹوکسین یونٹ (EU)/mL سے کم ہونے کے طور پر کیا گیا تھا۔ Stx2 مختلف قسم کی Stx2a تھی۔

5.5 چوہوں کے لیے Stx2 ایڈمنسٹریشن A 2LD50 خوراک (5 ng Stx2/20 g جسمانی وزن)، جو چوہوں کو چار دن کے اندر مار دیتی ہے (Figure S3A)، چوہوں کو 0.1 ملی لیٹر کے حجم میں LPS فری نمکین میں انجکشن لگایا گیا تھا۔ (اوٹسوکا فارماسیوٹیکل، جاپان)۔ ٹاکسن انجیکشن صبح 7 سے 9 بجے کے درمیان لگایا گیا تھا، جس میں طویل مدتی کورس کے چوہوں کو صبح 7 بجے Stx2 موصول ہوا اور اس کے بعد صبح 7 بجے 24، 48 اور 72 گھنٹے کے نمونے لیے گئے۔

5.6 پیشاب جمع کرنا اور پیشاب میں گلوکوز کی پیمائش 2، 6، 8، 12، 24، 36، 48، 60، اور 84 گھنٹے Stx2 انجیکشن کے بعد، پیشاب لیا گیا اور 10 µL کو Fuji ڈرائی کیم سلائیڈ GLU- پر چھوڑ دیا گیا۔ P III (FUJIFILM, Kanagawa, Japan) اور پیشاب میں گلوکوز کی پیمائش Fuji Dry Chem 7000 V (FUJIFILM) کے ذریعے کی گئی سہولت میں کی گئی۔ پری Stx2 انجیکشن سے پیشاب 0 h نمونے کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ پیشاب جمع کرنے کا کام دو چوہوں کے ساتھ کیا گیا تھا۔

5.7 ٹشو پروسیسنگ Stx2 انجیکشن کے 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، اور 72 گھنٹے کے بعد، فی ٹائم پوائنٹ پر تین چوہوں کو CO2 کے ذریعے ایتھانائز کیا گیا، اور گردے جمع کیے گئے۔ ایک گردے کے نصف حصے کو 4 ◦C پر 7 دن کے لیے 4% paraformaldehyde/phosphate-buffered saline کے ساتھ طے کیا گیا اور پیرافین سیکشن کے لیے پروسیس کیا گیا۔ گردے کا ایک اور آدھا حصہ مائیکرو رے تجزیہ کے لیے RNA نکالنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ بغیر کسی علاج کے تین چوہوں کو معمول کے کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا۔ تین چوہوں کو پی بی ایس (گاڑی) کے ساتھ انجکشن لگایا گیا اور 72 گھنٹے پر قربانی دی گئی اور گاڑیوں کے کنٹرول کے طور پر کام کیا گیا تاکہ یہ ظاہر کیا جا سکے کہ عام کنٹرول کے مقابلے جین کے اظہار میں نہ ہونے کے برابر تبدیلیاں ہیں۔

5.8 پیریڈک ایسڈ-شِف (PAS) سٹین پیرافن سیکشنز کو ہائیڈریٹ کیا گیا تھا اور 0.5% پیریڈک ایسڈ محلول سے داغ دیا گیا تھا، اس کے بعد ڈسٹلڈ پانی سے دھویا گیا تھا۔ حصوں کو شِف ریجنٹ میں منتقل کر دیا گیا تھا۔ حصوں کو 0.6% سوڈیم بیسلفائٹ محلول سے اچھی طرح دھونے کے بعد، ان کا مقابلہ ہیماتوکسیلین سے کیا گیا۔

5.9 انسانی RPTEC RPTEC خلیات میں Stx2 کا علاج Stx2 کے 10 ng/mL کے ساتھ 37 ◦C، 5% CO2 کے تحت 6، 13 اور 19 گھنٹے کے لیے کیا گیا۔ Stx2 علاج کے بغیر RPTEC کو بطور کنٹرول استعمال کیا جاتا تھا۔ دو حیاتیاتی نقلیں فی ٹائم پوائنٹ پر کی گئیں۔ پی بی ایس سے دھونے کے بعد، خلیات کو آر این اے نکالنے کے لیے استعمال کیا جاتا تھا۔

5.10 فری فلوٹنگ امیونو فلوروسینس سٹیننگ فری فلوٹنگ سیکشن پروسیسنگ کے لیے، ایک نارمل ماؤس پرفیوزڈ فکسڈ تھا جیسا کہ Obata et al میں بیان کیا گیا ہے۔ [69]۔ اس کے بعد مورین کے گردے کاٹ کر 4 ◦C پر 3 H کے لیے 4% PFA/PBS میں ہلکی ہلکی حرکت کے ساتھ ڈبو دیا گیا۔ ٹشوز کو پی بی ایس سے دھویا جاتا تھا، اور 30% سوکروز/پی بی ایس کے ساتھ راتوں رات 4 ◦C پر یا نیچے تک ڈوبنے تک کریو پروٹیکٹ کیا جاتا تھا۔ موٹے منجمد حصوں (50 µm) کو منجمد ترتیبات کے ساتھ سلائیڈنگ مائکروٹوم کے ساتھ کاٹا گیا تھا۔ سیکشنز کو PBS (F104UN, American Qualex International, Inc., San Clemente, CA, USA) میں 1:50 بکری اینٹی چوہا IgM اینٹی باڈی کے ساتھ 1 گھنٹہ کے لیے بلاک کیا گیا تھا اور بلاکنگ میں اینٹی Gb3/CD77 اینٹی باڈی 1:100 کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ 4 ◦C پر رات بھر کے لیے بنیادی اینٹی باڈی کے طور پر مماثل ارتکاز میں حل یا آئسو ٹائپ کنٹرول (چوہا IgM)۔ دھونے کے بعد، حصوں کو سیکنڈری اینٹی باڈی (اینٹی چوہا IgM Alexa Fluor 488، PBS میں 1:2000 dilution) کے ساتھ 4 ◦C پر 2 گھنٹے کے لیے انکیوبیٹ کیا گیا۔ AQP1 (1:1000 dilution, Sigma-Aldrich Japan, Tokyo, Japan) اور CD31 (550274, 1:50 dilution, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) کے لیے ثانوی اینٹی باڈیز الیکسا جی اینٹی خرگوش کے ساتھ سیکشنز داغے گئے تھے۔ Fluor 546 (PBS میں 1:2000 dilution) اور anti-mouse IgG Alexa Fluor 647 (PBS میں 1:2000 dilution) بالترتیب۔ PBS سے دھونے کے بعد، 40 ,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI, D21490, Thermo Fisher) داغ کو 15 منٹ کے لیے 4 ◦C پر کیا گیا۔ ہر بار محلول کو تبدیل کرنے پر حصوں کو ایک چھوٹے سے پینٹنگ بلش کے ساتھ 96-کنویں پلیٹ (U-shaped) کے کنویں میں مائعات میں ڈبو دیا جاتا تھا۔ دھونے کا مرحلہ بڑے کنوؤں میں کیا جاتا تھا جیسے کہ 12- یا 6- کنویں کی پلیٹوں میں۔ آبی بڑھتے ہوئے میڈیا کو کور سلپ کرنے کے لئے استعمال کیا گیا تھا۔ انسانی ٹشو کی تیاری کے لیے، پوسٹ مارٹم کڈنی کو 2 ہفتوں کے لیے 20% فارملین میں طے کیا گیا تھا اور اس پر فری فلوٹنگ تیاری کے لیے کارروائی کی گئی تھی جیسا کہ ماؤس ٹشو کے لیے کیا جاتا ہے ایک استثناء کے ساتھ اینٹی ہیومن CD31 اینٹی باڈی (CBL468، 1:20 dilution، Merck KGaA، Darmstadt) ، جرمنی) استعمال کیا گیا تھا۔

5.11۔ مائیکرو رے تجزیہ

گردے کا آدھا حصہ 4 ◦C پر 2 mL RNALater (Ambion, Austin, TX, USA) میں ڈوبا جاتا ہے اور کل RNA Rneasy Midi کٹ (Qiagen, Santa Clarita, CA, USA) کے ساتھ نکالا جاتا ہے۔ ماؤس جینوم 430A 2۔{6}} ارے (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) استعمال کیے گئے تھے۔ CEL فائلوں کو مضبوط ملٹی چپ ایوریجنگ (RMA)، RNA کاپی نمبروں کا حساب کتاب، اور 0 h کے خلاف فولڈ تبدیلیاں R (v.3.60) کے ساتھ اس کے پیکیج کے ساتھ حاصل کی گئیں اور معمول پر لائی گئیں۔ affy [73] اور RankProd 2.0 [74]۔ ڈیٹا لاگ2-فولڈ تبدیلی کی اقدار میں دکھایا گیا ہے۔ ڈیٹاسیٹ کو جین ایکسپریشن اومنیبس (جی ای او) (ایکسیشن نمبر GSE172465) میں جمع کیا جاتا ہے۔ RPTEC خلیوں سے، کل RNA RNAgents ٹوٹل RNA آئسولیشن سسٹم (پرومیگا، ٹوکیو، جاپان) کے ساتھ نکالا گیا تھا۔ مکمل انسانی جینوم oligonucleotide microarray (44K oligonucleotide DNA microarray, Agilent Technologies, Tokyo, Japan) کو مائیکرو رے تجربات کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ کل RNA نمونے Cy5- اور Cy3- لیبل والے cDNA پروبس کی تیاری کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔ فلوروفور لیبل والے نمونوں کو ہر شیشے کی سلائیڈ پر ہائبرڈائز کیا گیا اور دھویا گیا، پھر ڈی این اے مائیکرو رے اسکینر (ماڈل G2505A؛ Agilent ٹیکنالوجیز) سے اسکین کیا گیا۔ فیچر ایکسٹریکشن اینڈ امیج اینالیسس سوفٹ ویئر (ایجیلنٹ ٹیکنالوجیز) کا استعمال صف میں موجود ہر جگہ کو تلاش کرنے اور ان کی وضاحت کرنے اور شدتوں کو مربوط کرنے کے لیے کیا گیا تھا، جنہیں پھر فلٹر کیا گیا تھا اور مقامی طور پر وزنی سکیٹر پلاٹ ہموار کرنے کا طریقہ استعمال کیا گیا تھا۔ مائکرو رے تجزیہ کی تولیدی صلاحیت کا اندازہ ہر تجربے میں ڈائی سویپ کی دو تکرار سے کیا گیا۔ کنٹرول اور Stx کے درمیان mRNA اظہار میں فرق کا موازنہ کیا گیا GeneSpring سافٹ ویئر کا TXT فارمیٹ ڈیٹا پروب ID سے جین کے ناموں کا تعین کرنے اور فولڈ تبدیلیوں کو لاگ2- فولڈ تبدیلیوں میں تبدیل کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ ڈیٹاسیٹ GEO (الحاق نمبر GSE172466) میں جمع کر دیا گیا ہے۔

5.12۔ مائیکرو رے ڈیٹا اور ویژولائزیشن کا بائیو انفارمیٹک تجزیہ ماؤس کڈنی اور RPTEC مائیکرو رے ڈیٹا دونوں میں، وہ جین جو دونوں میں مشترک ہیں اور جہاں اظہار میں تبدیلی 2-گنا کمی یا اضافہ (یا لاگ2-گنا تبدیلی سے زیادہ تھی۔ یا تو −1 سے چھوٹا ہے یا 1 سے بڑا) کسی بھی وقت R کے ذریعے منتخب کیا گیا تھا۔ مزید یہ کہ ماؤس کڈنی مائیکرو رے ڈیٹا میں۔ کیوبک منحنی خطوط پر فٹ ہونے والے جین کی تبدیلیوں کا انتخاب R پیکیج maSigPro [https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ maSigPro.html (آخری بار 4 جنوری 2022 کو ہوا)] [75] کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ کیوبک وکر ایک وقت کے دوران ان جینوں کے اضافے یا کمی کو ایڈجسٹ کرنے کے لیے موزوں ہے۔ ایک اعلی کثیر الثانی ڈگری جیسے کیوبک وکر ایک چوکور وکر سے بہتر ٹائم کورس کے دوران متعدد تبدیلیوں کے ساتھ جینز کو منتخب کرنے کی اجازت دیتا ہے۔ اسی طرح کی رفتار سے برتاؤ کرنے والے جینز کو کلسٹر کیا گیا تھا اور R پیکیج gplots [https://CRAN.R-project.org/package=gplots (آخری بار 4 جنوری کو رسائی حاصل کی گئی تھی 2022)] [76]۔ جین آنٹولوجی (GO) کو تفویض کیا گیا تھا اور عام جینوں میں GO کے افعال کو Metascape [http://metascape.org (آخری بار 4 جنوری 2022 کو حاصل کیا گیا تھا)] [77] کا استعمال کرتے ہوئے افزودہ کیا گیا تھا۔ STRING [https://string-db.org/ (آخری بار 4 جنوری 2022 کو رسائی حاصل کی گئی)] [78] کا استعمال کرتے ہوئے عام جینوں کے کنکشن/تعلق کا تجزیہ کیا گیا۔ STRING کے ٹیکسٹ مائننگ فنکشن کا استعمال کرتے ہوئے عام جینوں کے درمیان تعلق کو دستی طور پر تلاش کیا گیا۔

حوالہ جات

1. Gianantonio, C.; Vitacco, M.; Mendilaharzu, F.; Rutty, A.; Mendilaharzu, J. ہیمولٹک-یوریمک سنڈروم۔جے پیڈیٹر۔1964, 64, 478–491. [کراس ریف] 

2. وِٹسکی، بی ایچ؛ سوزوکی، Y. سٹراس، ایل. چرگ، جے. دی ہیمولٹک-یوریمک سنڈروم: رینل پیتھولوجک تبدیلیوں کا مطالعہ۔ایم۔ جے پاتھول۔1969, 57, 627–647. 

3. تاکیدا، ٹی۔ دوہی، ایس. Igarashi, T.; یاماناکا، ٹی. یوشیا، کے. Kobayashi, N. نلی نما فنکشن کے ویروٹوکسن کی وجہ سے خرابی ہیمولٹک یوریمک سنڈروم میں نظر آنے والے گردوں کے نقصان میں معاون ہے۔J. انفیکٹ۔1993, 27, 339–341. [کراس ریف] 

4. کٹاگری، یو یو؛ موری، ٹی. ناکاجیما، ایچ۔ کٹاگری، سی. Taguchi, T.; تاکیدا، ٹی۔ کیوکاوا، این. Fujimoto, J. Src فیملی کناز کی ایکٹیویشن جی ہاں کم کثافت، صابن میں حل نہ ہونے والے مائیکرو ڈومینز میں گلوبوٹریاوسیل سیرامائیڈ (Gb3/CD77) کے ساتھ شگا ٹاکسن کے پابند ہونے کی وجہ سے۔J. Biol کیم1999, 274, 35278–35282. [کراس ریف] 

5. ٹیکنوچی، ایچ۔ کیوکاوا، این. Taguchi, T.; Matsui، J.؛ Katagiri, YU; اوکیتا، ایچ. Okuda, K.; Fujimoto, J. Shiga toxin globotriaosyl ceramide کا پابند ہونا انٹرا سیلولر سگنلز کو اکساتا ہے جو انسانی گردوں کے کارسنوما سے ماخوذ خلیوں میں cytoskeleton remodeling میں ثالثی کرتے ہیں۔جے سیل سائنس2004, 117, 3911–3922. [کراس ریف] [پب میڈ] 

6. Garred, O.; وین ڈیورس، بی؛ سینڈویگ، K. Furin-حوصلہ افزائی اور شیگا ٹاکسن کا فعال ہونا۔J. Biol کیم1995, 270, 10817–10821. [کراس ریف] 

7. مجول، I.؛ فیراری، ڈی۔ سولنگ، ایچ ڈی آکسائڈائزنگ ماحول میں پروٹین ڈسلفائیڈ بانڈز کی کمی۔ اینڈوپلاسمک ریٹیکولم میں ہیضے کے زہریلے A-subunit کا ڈسلفائیڈ پل کم ہو جاتا ہے۔FEBS Lett.1997, 401, 104–108. [کراس ریف] 

8. سپونر، RA؛ واٹسن، پی ڈی؛ مارسڈن، چیف جسٹس؛ سمتھ، ڈی سی؛ مور، KAH؛ کک، جے پی؛ لارڈ، جے ایم؛ رابرٹس، ایل ایم پروٹین ڈسلفائیڈ آئسومیریس اینڈوپلاسمک ریٹیکولم میں اس کی A اور B زنجیروں میں ricin کو کم کرتا ہے۔بائیو کیم۔ جے۔2004, 383, 285–293. [کراس ریف] 

9. یو، ایم؛ اسلام، ڈی بی شیگا ٹاکسن لومینل چیپیرون HEDJ/ERdj3 کے ساتھ تعامل کے بعد Endoplasmic Reticulum سے منتقل کیا جاتا ہے۔متاثر کرنا۔ امیون2005, 73, 2524–2532. [کراس ریف] 

10. Falguieres, T.; جوہانس، ایل شیگا ٹاکسن B-subunit چیپیرون BiP اور نیوکلیولر پروٹین B23 سے منسلک ہے۔بائول سیل2006, 98, 125–134. [کراس ریف]