سرکیڈین کلاک مورین گردے میں ردھمک ایریتھروپائٹین اظہار کو منظم کرتی ہے

مزید معلومات کے لیے:ali.ma@wecistanche.com

Lina K. Sciesielsk et al

Cistanche tubulosa گردے کی بیماری سے بچاتا ہے، حاصل کرنے کے لیے یہاں کلک کریں۔مصنوعات اور Cistanches

سرکیڈین تالوں کی تخلیق سیل خود مختار ہے اور ٹرانسکرپشن/ترجمے کے فیڈ بیک لوپ پر انحصار کرتی ہے جسے سرکیڈین کلاک ٹرانسکرپشن فیکٹر ایکٹیویٹرز کے خاندان کے ذریعے کنٹرول کیا جاتا ہے جس میں CLOCK، BMAL1، اور دبانے والے CRY1 اور CRY2 شامل ہیں۔ موجودہ مطالعے کا مقصد سالماتی میکانزم اور سرکیڈین اریتھروپائٹین اظہار کے ہیموپوائٹک مضمرات دونوں کی جانچ کرنا تھا۔ کور سرکیڈین کلاک جینز کرپٹو کروم 1 اور 2 (کرائی-نول) کے ہوموزائگس ڈیلیٹ کے ساتھ اتپریورتی چوہوں کو سرکیڈین اریتھروپائٹین ریگولیشن کو واضح کرنے کے لئے استعمال کیا گیا تھا۔ جنگلی قسم کے کنٹرول والے چوہوں میں نمایاں فرق ظاہر ہوا۔گردہسرکیڈین اوقات 06 اور 18 کے درمیان erythropoietin mRNA اظہار۔گردہ(byRNAscope ) اور گردش کرنے والے erythropoietin پروٹین کی نمایاں طور پر اعلیٰ سطحوں (ELISA کے ذریعے) سرکیڈین ٹائم 18 کا پتہ چلا۔ اس طرح کی تبدیلیوں کو کرائی-نل چوہوں میں ختم کر دیا گیا تھا اور یہ آکسیجن تناؤ، آکسیجن سنترپتی، یا ہائپوکسیا-انڈیکیبل عنصر 2alpha کے اظہار سے آزاد تھے۔ کہ circadian erythropoietin ایکسپریشن کو CRY1 اور CRY2 کے ذریعے نقلی طور پر ریگولیٹ کیا جاتا ہے۔ رپورٹر جین اسسیس نے ظاہر کیا کہ CLOCK/BMAL1 ہیٹروڈیمر 5' اریتھروپائٹین پروموٹر میں ایک ای باکس عنصر کو متحرک کرتا ہے۔ سیٹو ہائبرڈائزیشن میں آر این اےسکوپ نے اریتھروپائیٹین پیدا کرنے والے خلیوں میں Bmal1 کی موجودگی کی تصدیق کی۔گردہ. Cry-null چوہوں میں، reticulocytes کی نمایاں طور پر کم تعداد پائی گئی جبکہ erythrocyte نمبر اور hematocrit میں کوئی تبدیلی نہیں ہوئی۔ اس طرح، نارموکسک بالغ مورین میں سرکیڈین اریتھروپائیٹین ریگولیشنگردہعبوری طور پر ماسٹر سرکیڈین ایکٹیویٹر CLOCK/BMAL1، اور دبانے والے CRY1/CRY2 کے ذریعے کنٹرول کیا جاتا ہے۔ اس تلاش کے مضمرات ہو سکتے ہیں۔گردے کی فزیالوجیاور بیماری، لیبارٹری تشخیص، اور خون کی کمی کا علاج۔

مطلوبہ الفاظ:chronobiology; سرکیڈین تال؛ گھڑی کرپٹو کروم؛ erythropoietin؛ hematopoiesis؛ ہائپوکسیا سے متاثر ہونے والا عنصر

ترجمہی بیان تقریباً تمام سیل اقسام میں سالماتی گھڑیاں بافتوں سے متعلق عوامل کے ساتھ مل کر جین کی نقل کو چلاتی ہیں۔ اب تک، میں سرکیڈین دوغلی میکانزمگردہerythropoietin (Epo) کی حیاتیات سے منسلک نہیں ہیں۔ اس کے ساتھ، یہ واضح کیا گیا ہے کہ سرکیڈین ایپو اظہار کو ماسٹر کلاک پروٹین (کرپٹو کروم 1 اور 2، کلاک، اور Bmal1) کے ذریعے منظم کیا جاتا ہے۔ چونکہ EPO erythropoiesis کے پیچیدہ ریگولیٹری نیٹ ورک کے اندر مخصوص طور پر کام کرتا ہے، مریضوں میں Recombinant human Epo کا زیادہ سے زیادہ استعمالگردہناکافی میں آدھی رات کے قریب اس کے جسمانی سرکیڈین زیادہ سے زیادہ سے پہلے اس کا اطلاق شامل ہوسکتا ہے۔

نیفروولوجی میں سرکیڈین تال بڑی حد تک غیر دریافت ہیں لیکن انتہائی متعلقہ ہیں کیونکہ شفٹ کام، طرز زندگی کے انتخاب، اور سنسنی سے ان کی رکاوٹ مختلف بیماریوں کے بڑھتے ہوئے خطرے سے منسلک ہے، بشمول قلبی عوارض۔^1–4پریشان سرکیڈین گھڑیوں کے جانوروں کے ماڈل ہیماٹوپوائٹک نظام پر سرکیڈین ڈیسریگولیشن کے منفی اثرات کا پہلا ثبوت فراہم کرتے ہیں (مثال کے طور پر، عمر رسیدہ اریتھروسائٹس کی بڑھتی ہوئی تعداد سے)۔^5,6

erythropoiesis کے بارے میں، نہ صرف سیلولر اثرات بلکہ اس کے بنیادی ریگولیٹر، erythropoietin (Epo) کی تال بھی خاص دلچسپی کا باعث ہے کیونکہ کھلاڑیوں پر بار بار یہ الزام لگایا جاتا رہا ہے کہ وہ ریکومبیننٹ ہیومن Epo (جو) کے ساتھ خون کے ڈوپنگ کا الزام لگاتے رہے ہیں کیونکہ وہ دن کے وقت پر منحصر اختلافات کی وجہ سے گردش کرنے والی Epo ارتکاز اور hematological پیرامیٹرز۔ 7,8 انسانی سیرم Epo (S-Epo) کی سطحوں میں روزانہ تغیرات پہلی بار 1981 میں پھیپھڑوں اور کوئلہ ورکرز کی سانس کی دائمی بیماری کے مریضوں میں بیان کیے گئے تھے،⁹اور اس کے بعد صحت مند مضامین میں۔^10,11آج تک، کئی رپورٹیں رات میں S-Epo کی اعلی سطح (8 PM سے 4 AM) اور صبح سویرے (4 AM سے 8 AM) میں کم S-Epo کی سطح کی نشاندہی کرتی ہیں۔ S-Epo oscillations کا مرحلہ اور طول و عرض، اگر بالکل موجود ہے، انسانی افراد کے درمیان متغیر ہیں۔^9,10,12,13اوسطا، S-Epo کی سطح تقریباً 1۔^14–22یہ روزانہ کی تال عمر بڑھنے، 20 تربیت، 16، یا اونچائی کی نمائش سے متاثر نہیں ہوتی۔ 17 اس کے برعکس، S-Epo کی روزانہ کی دوائی ان مریضوں میں ختم کردی جاتی ہے جو دن کے وقت ہائپوکسیمیا کی وجہ سے پیچیدہ دائمی رکاوٹ پلمونری بیماری کے ساتھ ہوتے ہیں، گردے کی خرابی کے ساتھ مائیلوما میں۔ ، اور myelodysplasia میں.^15,21,23

2009 میں، ہم نے گھڑی پر قابو پانے والے جینوں کے فروغ دینے والوں کے بڑے پیمانے پر تجزیے میں مورین کڈنی میں سرکیڈین Epo mRNA اظہار بیان کیا لیکن EPO جین میں کسی الگ جینیاتی عنصر یا سرکیڈین دولن کے لیے ذمہ دار ٹرانس ایکٹیوٹنگ عنصر کی شناخت کرنے سے قاصر تھے۔ 24 ابھی حال ہی میں، ہیمرجک جھٹکے کے چوہے کے ماڈل نے متوازی اظہار کے نمونوں کے مطابق تجویز کیا کہ ہائپوکسیا/اسکیمیا کے دوران ای پی او کے اخراج کے ریگولیشن میں کلاک جینز (Bmal1 اور Per2) شامل تھے۔²⁵

سرکیڈین تال کی تخلیق سیل خود مختار ہے اور ٹرانسکرپشن-ترجمے کے فیڈ بیک لوپ پر انحصار کرتی ہے جسے سرکیڈین کلاک ٹرانسکرپشن عوامل کے خاندان کے ذریعے کنٹرول کیا جاتا ہے، بشمول CLOCK، BMAL1، PER1، PER2، CRY1، اور CRY2.26 CLOCK/BMAL1 ہیٹر کو ایکٹیویٹ کرتا ہے۔ سرکیڈین کلاک جینز PER1/2 اور CRY1/2 ان کے پروموٹرز میں E باکس عناصر کے ساتھ بائنڈنگ کے ذریعے۔ PER اور CRY پروٹین، تاہم، CLOCK/BMAL1 کی سرگرمی کو روک کر منفی رائے فراہم کرتے ہیں، اس طرح ان کے اپنے اظہار کو کم کرتے ہیں۔ خالص نتائج سرکیڈین جین اظہار کے دوغلی نمونوں اور سیلولر اور آرگن فزیالوجی میں تال کی تبدیلیوں کا باعث بنتے ہیں۔²⁷

حیاتیاتی گھڑی کے مضمرات کو سمجھنے کے لیے، اب تک مختلف قسم کے اتپریورتی چوہوں کا مطالعہ کیا جا چکا ہے جن میں خلل شدہ یا ختم شدہ سنگل کور کلاک ٹرانسکرپشن عوامل ہیں۔ چوہے (Cry-null)، جن میں endogenous circadian تال کا اظہار کرنے کی صلاحیت نہیں ہے۔^26,30ویوو اور ان وٹرو ڈیٹا میں مل کر یہ ظاہر کرتا ہے کہ Cry1/2 CLOCK/BMAL1-حوصلہ افزائی ٹرانسکرپشن کے ذریعے نارموکسک گردے میں سرکیڈین ایپو اظہار کو منظم کرتا ہے۔

طریقے

جانوروں کے تجربات

Homozygous Cry1–/– /Cry2–/– جانور (Cry-null؛ نر اور مادہ؛ C57BL/6J-based) 31 اور جنگلی قسم کے (WT) کنٹرولوں کی افزائش کی گئی (For-schungseinrichtungen für Experimentelle Medizin Charité) اور 5 تک پرورش کی گئی۔ 7 ماہ تک. WT چوہوں کی افزائش Cry-null کالونی سے ہوئی۔

پولیمریز چین ری ایکشن (ضمنی جدول S1) کے ذریعہ کرائی-نول جین ٹائپ کی تصدیق ہوئی۔ داخلے کے لیے، چوہوں کو گروپ میں رکھا گیا تھا اور 14 دنوں کے لیے ایک 12-گھنٹہ:12-گھنٹہ روشنی/تاریک چکر میں خوراک اور پانی کی اشد ضرورت تھی۔ مسلسل اندھیرے میں رہائی کے بعد 2 دن، جانوروں کو سرکیڈین ٹائم (CT) 06 یا 18 (ہر گروپ اور ٹائم پوائنٹ کے لیے n ¼ 13–15) پر قربان کیا گیا۔ ٹشوز (جگر اور گردے) کو فوری طور پر حاصل کیا گیا اور مائع نائٹروجن میں اسنیپ فریز کیا گیا۔ نر اور مادہ WT اور Cry-null جانوروں کے ذیلی گروپ کا جسمانی وزن اور تفریق ہیموگرام کے لیے تفصیل سے تجزیہ کیا گیا۔

خون کی گیس کے تجزیے کے لیے، جانوروں کو بے ہوشی کی گئی (فینٹینیل، {{0}}.075 ملی گرام/کلوگرام، مڈازولم، 1.5 ملی گرام/کلوگرام، اور میڈیٹومائڈائن، 0.75 ملی گرام/کلوگرام)، ٹریچیوٹومائزڈ، انٹیوبیٹڈ، اور ہوادار (ساحلی) حجم، 9 ملی لیٹر/کلوگرام؛ سانس کی شرح، 160 منٹ- 1؛ مثبت اختتامی دباؤ، 2 سینٹی میٹر H2O)، جیسا کہ بیان کیا گیا ہے۔ استحکام کے 5 منٹ کے بعد، کیروٹیڈ کیتھیٹر کے ذریعے تیزی سے اخراج کے ذریعے تجربہ ختم کر دیا گیا، خون کی گیسوں کا تجزیہ کیا گیا (ABL-800؛ ریڈیو میٹر؛ درجہ حرارت کو کنٹرول کیا گیا)، اور پوسٹ ہاک تجزیوں کے لیے گردوں کو نکال دیا گیا۔

تمام طریقہ کار مقامی اینیمل کیئر کمیٹی (T0307/08؛ G0100/17 جنوری 2021 سے ایک ضمیمہ کے ساتھ) کے ذریعہ اختیار کیے گئے تھے اور جرمن جانوروں کے تحفظ کے قانون کے رہنما خطوط اور ضوابط کے مطابق انجام دیے گئے تھے۔

آر این اے اور مقداری پولیمریز چین ری ایکشن تجزیہ کی تیاری

کل RNA نکالا گیا جیسا کہ بیان کیا گیا ہے۔ 33 کل 1000 ng کل RNA کو سپر اسکرپٹ III ریورس ٹرانسکرپٹیس (تھرمو فشر؛ نمبر 18080085) اور رینڈم ہیکسامرز (تھرمو فشر؛ نمبر SO142) کے ساتھ ریورس ٹرانسکرائب کیا گیا تھا، مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق۔ مقداری پولیمریز چین کے رد عمل ایک StepOnePlus cycler (Life Technologies) پر انٹرن اسپیننگ پرائمر یا TaqMan Assays (ضمنی جدول S2) کے ساتھ چلائے گئے تھے۔ پولیمریز چین ری ایکشن ٹیمپلیٹ کے سیریل ڈائیوشنز سے معیاری وکر کے مقابلے میں مطلق mRNA کی مقدار کو حاصل کیا گیا تھا۔

RNAscope تکنیک کے ذریعے گردے میں Epo mRNA اظہار کا پتہ لگانا

RNAscope پرکھ کارخانہ دار کے پروٹوکول (ACD؛ تکنیکی نوٹ 320536) کے مطابق انجام دیا گیا تھا۔ ڈی اے پی بی (منفی کنٹرول؛ ACD؛ نمبر 310043) یا Epo (ACD؛ نمبر 315501) کے خلاف C1 تحقیقات کے ساتھ 10-ملی میٹر کے درمیانی گردے کے ٹرانسورس کرائی سیکشنز کو داغ دیا گیا تھا۔ Amp 4-6 کا استعمال کرتے ہوئے ہائبرڈائزیشن کے مراحل اور ریڈ سگنلز کا پتہ لگانا چھوڑ دیا گیا تھا۔ دو آزاد، نابینا محققین نے Axioplan 2 امیجنگ سسٹم (Zeiss) میں 3 سے 8 cryosectionsper جانور پر 200 اصل میگنیفیکیشن پر Epo مثبت خلیوں کی گنتی کی۔

مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق نمائندہ ایپو کوانٹیفیکیشن امیجز اور ڈبل فلورسنٹ سٹیننگ RNAscope Multiplex FluorescentDetection Reagent V2 Kit (ACD؛ نمبر 323110) کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی۔ 15-mm مڈ کڈنی ٹرانسورس پیرا سیکشنز Bmal1 (ACD; No.438741) کے خلاف C1 تحقیقات اور Epo (ACD; نمبر 315501-C2) کے خلاف C2 تحقیقات کے ساتھ داغے ہوئے تھے۔ Opaleye 520 (Akoya BioSciences؛ No. FP1487001KT) کو theC1 تحقیقات کے ساتھ استعمال کیا گیا تھا، اور opal dye 650 (Akoya BioSciences؛ نمبر FP1496001KT) C2 تحقیقات کے ساتھ استعمال کیا گیا تھا۔ - 400 اصل میگنیفیکیشن پر، Epo مثبت خلیات کو Eclipse Ti2imaging سسٹم (Nikon) میں Bmal1 کے اجتماعی طور پر امیج کیا گیا تھا۔ 40،6-diamidino-2-phenylindole کو انسداد داغ کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔

ای پی او سیرم کی تعداد

خون کے نمونوں کو کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹہ تک جمنے کی اجازت دی گئی تھی اس سے پہلے کہ 20 منٹ کے لیے 2000 - g سیرم کو ہٹا دیا گیا تھا اور فوری طور پر –80 C پر منجمد کر دیا گیا تھا یہاں تک کہ Epo (Quantikine؛ R&D Systems؛ No. MEP006) کے لیے انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ کو غیر منقطع نمونوں کے ساتھ انجام دیا جائے۔ جاذبیت کو 450 nm پر iMARK مائیکرو پلیٹ ایبسوربینس ریڈر (Bio-Rad) کے ساتھ پڑھا گیا، 570 nm پر طول موج کی اصلاح اور ایک 4-پیرامیٹر فٹ معیاری وکر کے ساتھ، جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے۔³³

خون کے خلیوں کی گنتی

EDTA-anticoagulated خون سے کل اور مختلف خلیوں کی گنتی Synlab کے ذریعہ ماپا گیا۔ ADVIA2120i (Siemens) خودکار سیل کاؤنٹر کے ساتھ مرین خون کے لیے ڈاکٹر برلن۔

رپورٹر جین پرکھ

انسانی برانن گردے کے 293 خلیات (DSMZ؛ نمبر ACC305؛ گزرنے کے نمبر 3–10؛ مائکوپلاسما منفی) Dulbecco کے ترمیم شدہ Eagle's Medium/Ham F12 (Biochrom؛ No. FG4815) میں بڑھے گئے تھے اور اس کی تکمیل bockrom 10 فیصد کے ساتھ کی گئی تھی۔ F7524)۔ سیل ٹرانسفیکشن 12-کنویں پلیٹوں میں انجام دیا گیا تھا جس میں 1{10}} سیل/کنواں شامل تھے۔ ہر کنویں کو 333 این جی پلاسمڈ ڈی این اے (جن میں سے 10 میں سے ونیلا کنسٹرکٹ تھا) اور 1 ملی لیٹر فیوجین 6 ٹرانسفیکشن ریجنٹ (پرومیگا؛ نمبر E2691) سے منتقل کیا گیا جیسا کہ بیان کیا گیا ہے۔ 34 استعمال شدہ تمام تعمیرات ضمنی جدول S3 میں درج ہیں۔ Passive Lysis buffer (Promega؛ No. E1941) کے ساتھ منتقلی کے 48 گھنٹے بعد سیلز لیس کیے گئے۔ لوسیفریز سرگرمی کا تعین بیٹل جوس اور رینیلا جوس کٹس (دونوں pjk GmbH؛ نمبر 102511/102531، بالترتیب) کے ساتھ Lumat LB9501 luminometer پر کیا گیا تھا۔ ہر تجربہ تکنیکی نقول میں کیا گیا تھا، اور حساب کے لیے اوسط اقدار کا استعمال کیا گیا تھا۔

شماریاتی تجزیہ

In all animals, the circadian gene expression was analyzed; 2 animals were excluded as they showed outlier values (>1۔ ڈیٹا کا تجزیہ IBM SPSS شماریات 27 کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا اور اسے میڈین کے ساتھ انفرادی نقطوں کے طور پر یا وسط اور SD کے ساتھ بار کے طور پر پیش کیا گیا تھا۔ مان-وٹنی یو ٹیسٹ یا کرسکل-والس بونفرونی کے ساتھ بطور پوسٹ ہاک ٹیسٹ کیا گیا تھا۔

نتائج

Cry-null چوہوں میں circadian Epo اظہار کا خاتمہ

سرکیڈین ایپو ریگولیشن کے مالیکیولر میکانزم کو واضح کرنے کے لیے، ہم نے WT اور Cry-null mutant چوہوں میں Epo mRNA اور پروٹین ایکسپریشن کا تجزیہ کیا۔ ڈبلیو ٹی کڈنی میں، کینونیکل کلاک جینز نے دن کے وقت پر منحصر اظہار دکھایا، جبکہ اسے کرائی-نول چوہوں میں ختم کر دیا گیا، جیسا کہ توقع کی گئی تھی (ضمنی اعداد و شمار S1)۔ ہم نے پہلے بالغ WT murine گردوں کے لیے Epo mRNA اظہار کے 24 گھنٹے کے دوران سرکیڈین دولن کی اطلاع دی۔ ) اور CT18 (سرگرمی کا مرحلہ؛ متوقع زیادہ سے زیادہ؛ شکل 1a)۔ Cry-null چوہوں کے گردوں میں، تاہم، گردے کے Epo mRNA اظہار میں کوئی خاص فرق نہیں پایا گیا۔ خاص طور پر، Cry-null چوہوں میں، دونوں وقتوں میں کڈنی Epo ٹرانسکرپٹ لیولز کی مطلق مقدار CT06 اور CT18 (شکل 1a) میں میڈین WT Epo mRNA لیول کے درمیان تھی۔ متعلقہ جگروں میں EPO mRNA پتہ لگانے کی حد سے نیچے تھا (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا)۔

Epo سیرم کی تعداد میں روزانہ تبدیلیاں

گردش کرنے والے Epo پروٹین میں سرکیڈین Epo mRNA اظہار کے ترجمہ کا اندازہ لگانے کے لیے، ہم نے انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ کے ذریعے سیرم کے نمونوں کا تجزیہ کیا۔ اعضاء کے نمونوں سے پہلے خون کے نمونے لیے گئے۔ WT چوہوں میں CT06 اور CT18 کے درمیان سیرم Epo نے w2 میں اضافہ کیا۔ خاص طور پر، وقت کے ساتھ اوسطاً اوسط S-Epo ارتکاز (CT06 اور CT18) WT اور Cry-null چوہوں (22 mU/ml [range, 3–59 mU/ml] بمقابلہ 21 mU/ml [رینج، 7 -50 mU/ml])۔

شریان خون کے گیس کے پیرامیٹرز اور نبض کی آکسیمیٹری کے سلسلے میں سرکیڈین ایپو اظہار

یہ جانچنے کے لیے کہ آیا خون اور بافتوں کی آکسیجن کی سطح میں ممکنہ روزمرہ کی تبدیلیاں Epo اظہار کے سرکیڈین دولن کا سبب بن سکتی ہیں، شریانوں کے خون کے نمونے حاصل کیے گئے اور خون کے گیس کے تجزیے اینستھیٹائزڈ، ٹریچیوٹومائزڈ، اور میکانکی طور پر ہوادار کرائی-نول اور ڈبلیو ٹی چوہوں میں کیے گئے یا CT108، جو بالترتیب سب سے کم اور سب سے زیادہ سرکیڈین Epo mRNA کی سطح سے مطابقت رکھتا ہے (شکل 1a)۔ ہمیں نہ تو آرٹیریل pH، CO2 کے جزوی دباؤ، یا O2 کے جزوی دباؤ میں اور نہ ہی CT06 اور CT18 یا WT اور Cry-null چوہوں کے درمیان معیاری بیس اضافی یا lactate ارتکاز (شکل 2a–e) میں کوئی اہم فرق نہیں ملا۔ آکسیجن سنترپتی کی سطح، پلس آکسیمیٹری کے ذریعہ ماپا جاتا ہے، نے بھی کوئی فرق نہیں دکھایا (شکل 2f)۔ EPO ماسٹر ریگولیٹر ہائپوکسیا-انڈیکیبل فیکٹر (HIF) 2a کا جین ایکسپریشن CT06 اور CT18 کے درمیان مختلف نہیں تھا، WT یا Cry-null چوہوں (شکل 3) میں۔ اس طرح، نارموکسک حالات میں، سرکیڈین ایپو ریگولیشن آکسیجن تناؤ میں تبدیلی کی وجہ سے نہیں ہوتا ہے۔

گردوں کے Epo پیدا کرنے والے خلیوں میں Epo اظہار کا سرکیڈین آن آف سوئچ

اس بات کا مطالعہ کرنے کے لیے کہ آیا سرکیڈین Epo mRNA اظہار اضافی رینل Epo-producing خلیات (REPCs) پر سوئچ کرکے یا صرف فی سیل Epo اظہار میں اضافہ کرکے ثالثی کرتا ہے، RNAscope in Situ Hybridization کا استعمال گردے کے درمیانی ٹرانسورس سیکشنز پر کیا گیا تھا (مثال کے طور پر ضمنی اعداد و شمار S2 میں)۔ WT چوہوں میں، REPCs کی تعداد CT06 (میڈین، 5؛ رینج، 0–25) اور CT18 (میڈین، 22؛ رینج، 5–82؛ 4 کے درمیان نمایاں طور پر بڑھی۔ 11} فولڈ؛ P ¼ 0.010)۔ اس کے برعکس، Cry-null گردوں نے CT06 (میڈین، 18؛ رینج، 2–33) اور CT18 (میڈین، 15؛ ​​رینج، 4–87؛ اہم نہیں؛ شکل 1c) پر اسی طرح کی REPCs کی تعداد ظاہر کی۔ ہم نے غور کیا کہ Cry-null چوہوں میں انسولین نما گروتھ فیکٹر 1 (IGF1) کے خراب سگنلنگ کی وجہ سے نشوونما کی پابندی کی نمائش ہوتی ہے، جس کے نتیجے میں Cry-null اور WT چوہوں کے درمیان جسمانی وزن اور اعضاء کے سائز میں مسلسل اضافہ ہوتا ہے۔ 30 جیسا کہ ہم استعمال کرتے ہیں۔ نسبتاً کم عمر جانوروں میں، کرائی-نول چوہوں کا مطلق گردے کا وزن WT چوہوں کے مقابلے میں صرف تھوڑا کم تھا (-12 فیصد Cry-null چوہوں میں)، لیکن رشتہ دار گردے سے جسمانی وزن کا تناسب مختلف نہیں تھا (ضمنی اعداد و شمار S3) . اس طرح، Epo mRNA اظہار میں سرکیڈین اضافہ اضافی REPCs کے آن سوئچ کے ذریعے ریگولیٹ ہوتا ہے۔

CLOCK/BMAL1 کے ذریعے کم سے کم EPO پروموٹر کو چالو کرنا

سرکیڈین ایپو ایکسپریشن (شکل 4a) کے ذمہ دار ریگولیٹری سلسلے کی نشاندہی کرنے کے لیے، انسانی برانن گردے کے 293 خلیوں میں لوسیفریز رپورٹر جین اسسیس کیے گئے۔ انسانی ایمبریونک کڈنی 293 سیل لائن کا انتخاب اس کے گردے کی اصل کے لیے نہیں بلکہ اس میں اینڈوجینس سرکیڈین کلاک کی کمی کے لیے کیا گیا تھا۔ اس طرح، CLOCK/BMAL1 کے محرک اثر کو کم، نانوسیلیٹنگ CLOCK/BMAL1 پس منظر میں جانچا جا سکتا ہے۔ CLOCK/BMAL1 کے اوور ایکسپریشن نے کم سے کم انسانی EPO پروموٹر کی سرگرمی کو نمایاں طور پر متحرک کیا (شکل 4b، I بمقابلہ II)۔ اگر E-box motif (-36 سے -31 bp ٹرانسکرپشنل سٹارٹ سائٹ کے نسبت) کو تبدیل کیا جاتا ہے، 35 یہ اثر ختم ہو جاتا ہے (شکل 4b، III)۔

اس بات کا مطالعہ کرنے کے لیے کہ آیا مشاہدہ شدہ سرکیڈین ریگولیشن سیل کی قسم پر منحصر تھا، ہم نے ایک لوسیفریز رپورٹر کے Bmal1 پروموٹر ثالثی دولن کی نگرانی کرکے اینڈوجینس کلاک کی سرگرمی کے لیے کئی EPO- اظہار کرنے والی سیل لائنوں کی اسکریننگ کی۔ اینڈوجینس تال کے حامل افراد میں انسانی ہیپاٹوما سے ماخوذ HEP3B خلیے، انسانی نیوروبلاسٹوما سے حاصل کردہ KELLY خلیات، اور PDGFRbþ ماؤس کڈنی سیل (سابقہ ​​EPO ماؤس سیل لائن FAIK1-10 کا اظہار کرتا تھا) شامل تھے۔36,37 3 سیل لائنوں میں سے، صرف کیلی سیلز نے EPO پروموٹر سے چلنے والے لوسیفریز دوسلن (ضمنی اعداد و شمار S4A) کی نمائش کی۔ اگرچہ PDGFRbþ خلیوں نے Bmal1 پروموٹر کی سرگرمی کی ایک مضبوط سرکیڈین تال کی نمائش کی، ہم نے EPO پروموٹر کی ثالثی دولن کا پتہ نہیں لگایا، جو EPO پروموٹر سے چلنے والے رپورٹر کی تعمیر (ضمنی اعداد و شمار S4B) کے کم طول و عرض کی تجویز کرتا ہے۔

Cry-null بمقابلہ WT چوہوں کے گردوں میں Bmal1 اور Epo کا اجتماعی عمل

مزید واضح کرنے کے لئے (i) گردوں کے Epo پیدا کرنے والے خلیوں کی بھرتی کرکے گردے کے Epo کی پیداوار کے سرکیڈین ریگولیشن اور (ii) Bmal1 اور Epo اظہار کے اجتماعی عمل کو، ہم نے سیٹو ہائبرڈائزیشن میں RNAscope انجام دیا۔ Epo اور Bmal1 کو اکٹھا کیا گیا، اور کم میگنیفیکیشن پر مائیکروسکوپی REPCs (شکل 5) کی بھرتی میں فرق کی نمائندگی کرتی ہے، جیسا کہ شکل 1c میں مقدار بیان کی گئی ہے۔

Cry1/Cry2 کی کمی میں ہیماٹولوجک نتائج (i) سرکیڈین Epo اظہار کی کمی کے hematopoietic اثرات اور (ii) فعال گھڑی کے بغیر چوہوں میں ممکنہ دیگر ہیماتولوجک اسامانیتاوں کا جائزہ لینے کے لیے، خون کے خلیوں کی گنتی کا تجزیہ کیا گیا۔ Epo mRNA اظہار اور S-Epo ارتکاز کے وقت کے فرق کو WT چوہوں میں CT06 بمقابلہ CT18 پر پیریفرل ریٹیکولوسائٹ شمار میں نمایاں فرق سے منعکس نہیں کیا گیا تھا۔ Reticulocyte شمار، تاہم، WT چوہوں (شکل 6a) کے مقابلے Cry-null جانوروں میں CT06 اور CT18 دونوں میں نمایاں طور پر کم تھے۔ WT بمقابلہ Cry-null چوہوں میں erythrocyte نمبرز یا hematocrit اقدار میں کوئی خاص فرق نہیں تھا۔ تاہم، دونوں پیرامیٹرز CT06 اور CT18 کے درمیان دونوں تناؤ (شکل 6b اور c) میں مختلف نہیں تھے اور Cry-null چوہوں (شکل 6a) میں نچلے پیریفرل ریٹیکولوسائٹ نمبر سے مطابقت نہیں رکھتے تھے۔ یہ جانچنے کے لیے کہ آیا خراب IGF1 سگنلنگ کی وجہ سے غذائیت کی کمی (مثال کے طور پر، آئرن اور فولیٹ) کم ریٹیکولوسائٹ کے فرق میں ملوث ہیں لیکن کرائی-نل چوہوں میں عام اریتھروسائٹ نمبر، سرخ خون کے خلیے کے سائز اور شکل کا تجزیہ کیا گیا لیکن کوئی خاص فرق نہیں دکھایا گیا۔ Cry-null اور WT چوہوں کے درمیان (ضمنی شکل S5)۔

خاص طور پر، Cry-null چوہوں میں میڈین پلیٹلیٹ کا شمار WT چوہوں کے مقابلے میں زیادہ ہوتا ہے، لیکن پلیٹلیٹ کی تعداد CT06 اور CT18 کے درمیان دونوں تناؤ میں نمایاں طور پر مختلف نہیں تھی (شکل 6d)۔ اس کے برعکس، سفید خون کے خلیے (WBC) کی تعداد WT میں CT06 اور CT18 کے درمیان نمایاں طور پر مختلف تھی لیکن Cry-null چوہوں میں نہیں۔ Cry-null چوہوں میں میڈین WBC نمبر اسی طرح زیادہ تھا، جیسا کہ CT06 (شکل 6e) میں WT چوہوں میں تھا۔

بحث

اس کے ساتھ، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ سرکیڈین ایپو اظہار کو نقل کی سطح پر منظم کیا جاتا ہے۔ اریتھمک کرائی 1 اور کرائی 2 کی کمی والے چوہوں میں Epo mRNA اور S-Epo ارتکاز کے تجزیے نے "Epo کی گھڑی" کے لیے ہماری تلاش کو ان کے بہاو والے ٹارگٹ ٹرانسکرپشن عوامل CLOCK اور BMAL1 کی طرف موڑ دیا، جو CRY1 اور CRY2.26 Cry1/Cry2 لیڈ کے خاتمے کے ذریعے دبائے جاتے ہیں۔ CLOCK/BMAL1 کے ردھمک جبر کا نقصان، جس کے نتیجے میں Epo ٹرانسکرپٹ کی مستقل سطحیں جو WT چوہوں میں CT06 اور CT18 کے درمیانی سطح کے درمیان تھیں (شکل 1a)۔ RNAscope کے ذریعہ سیٹو ہائبرڈائزیشن میں اشارہ کرتا ہے کہ سرکیڈین دولن بیچوالا خلیات (شکل 1c) میں Epo mRNA اظہار کو سوئچ کرکے حاصل کیا جاتا ہے، اور RNAscope کے ذریعہ سیٹو ہائبرڈائزیشن میں بھی REPCs میں Bmal1 کا اظہار ظاہر ہوتا ہے (شکل 5)۔

زیادہ اہم، CT18 میں نمایاں طور پر اعلی S-Epo کی سطح اس بات کی تصدیق کرتی ہے کہ سرکیڈین، ٹرانسکرپشنل Epo ریگولیشن نارموکسک حالات (شکل 1b) کے تحت گردش کرنے والے Epo پروٹین کے سرکیڈین دولن میں ترجمہ کرتا ہے۔ حقیقی زیادہ سے زیادہ S-Epo کی سطح CT18 کے مقابلے میں تھوڑی دیر بعد متوقع ہے کیونکہ EPO پروٹین کی ڈی نوو ترکیب کے لیے w80 سے 120 منٹ، 38 اور سرکیڈین اوقات کا انتخاب زیادہ سے زیادہ Epo mRNA کی سطح کی بنیاد پر کیا گیا تھا۔ 24 ہم نے پایا کہ CLOCK/BMAL1 (شکل 4 اور ضمنی شکل S4) کے ذریعہ 5' EPO پروموٹر میں E-box motif کے ٹرانسکرپشنی ایکٹیویشن کے ذریعہ سرکیڈین Epo ریگولیشن ممکنہ طور پر ثالثی ہے، جو BMAL1 پروٹین اور کے درمیان بیان کردہ مثبت ارتباط کے مطابق ہے۔ شدید نکسیر کے چوہے کے ماڈل میں S-Epo کی سطح۔²⁵

CLOCK/BMAL1 اور HIF راستوں کے درمیان براہ راست پروٹین-پروٹین کے تعامل کے ذریعے دو طرفہ ضابطے کے ثبوت موجود ہیں۔^39,40HIF2a کی اپ گریجشن، EPO پروموٹر کے بڑے ایکٹیویٹر، 41,42 کے نتیجے میں انسانی ہیپاٹوما خلیوں میں کلاک جینز کے اظہار کی سطح میں تبدیلی آئی۔^44,45,اور HIF سرگرمی کے سرکیڈین کلاک کنٹرول کو ٹشو کے مخصوص طریقے سے منظم کیا جاتا ہے۔ 39 چوہوں میں، شدید ہائپوکسیا (4 گھنٹے پر 6 فیصد بمقابلہ 21 فیصد O2)، EPO mRNA ضرورت سے زیادہ بڑھ گیا تھا لیکن اب اس میں سرکیڈین اختلافات ظاہر نہیں ہوئے۔ .46 اس طرح، سرکیڈین ایپو ریگولیشن کے مالیکیولر میکانزم کو الگ کرنے کے لیے نارموکسک حالات شاید سب سے زیادہ موزوں ہیں۔ چوہوں میں، تاہم، خون اور بافتوں کی آکسیجن کی سطح میں روزانہ کی تبدیلیوں کی اطلاع دی گئی ہے۔ 39,47 چوہوں میں، گردے کی آکسیجن میں zD3 فیصد کی تال میل والی روزانہ تبدیلیوں کی حد کم ہوتی ہے، اندھیرے میں چوٹی (چوہا کی سرگرمی) .47 ہمارے تجربات میں اس طرح کے فرق کا پتہ نہیں چل سکا، جس میں جانوروں کی ریگولیٹری وجوہات کی بنا پر صرف اینستھیٹائزڈ، ٹریچیوٹومائزڈ، اور میکانکی طور پر ہوادار چوہوں کا مطالعہ کیا جا سکتا ہے۔ تاہم، آرٹیریل پی ایچ، CO2 کا جزوی دباؤ، اور O2 کا جزوی دباؤ، معیاری بیس اضافی یا لییکٹیٹ کے ساتھ ساتھ آکسیجن سیچوریشن کا تجزیہ WT اور Cry-null چوہوں کے درمیان دونوں CTs میں بڑے فرق کی نشاندہی نہیں کرتا ہے (شکل 2)۔ مزید برآں، گردے میں Hif2a ٹرانسکرپٹ کی سطح بھی تمام حالات میں یکساں تھی (شکل 3)۔ اس طرح، نارموکسک حالات میں، سرکیڈین ایپو ریگولیشن آکسیجن تناؤ میں روزانہ کی تبدیلیوں سے آزاد معلوم ہوتا ہے۔ تاہم، یہ سوال کہ کس حد تک اونچائی یا ہائپوکسیا (کم pO2) Epo کی پیداوار کے سرکیڈین دولن کو متاثر کرتا ہے مزید توجہ کا مستحق ہے۔ انسانی S-Epo کی سطح عام طور پر اونچائی پر زیادہ ہوتی ہے، جب کہ مرحلہ اور طول و عرض میں کوئی تبدیلی نہیں ہوتی، 17,22 اور صحت مند رضاکاروں میں جو نارموبارک ہائپوکسیا کا شکار ہوتے ہیں، S-Epo کی ارتکاز واضح طور پر دولن دکھاتا ہے۔⁴⁸

سرکیڈین ایپو ریگولیشن شاید کلینیکل نیفروولوجی اور ہیماتولوجی کے لئے سب سے زیادہ متعلقہ ہے، لیکن لیبارٹری تشخیص کے حوالے سے بھی، جیسے erythropoiesis-stimulating agents کے ساتھ ڈوپنگ کے لیے خون کی جانچ۔ ڈوپنگ کے تجزیوں میں گردش کرنے والی Epo کی حراستی کی تشخیص کے لیے، خون کے جمع کرنے کے وقت دن کے وقت (بیرونی وقت) اور شخص کی تاریخ (اندرونی وقت) پر غور کیا جانا چاہیے۔ 49,50

erythropoiesis میں، پھٹنے والی اکائیاں – erythroid پہلے نسب سے مخصوص خلیات ہیں، اس کے بعد کالونی بنانے والی اکائیاں – erythroid، جو Epo ریسیپٹر کا وافر اظہار ظاہر کرتی ہیں۔ Epo کے ساتھ ثقافت میں 2 دن کے بعد، مورین کالونی بنانے والی اکائیاں – erythroid erythroblast کالونیاں پیدا کرتی ہیں۔ ایک بار جب آرتھو کرومیٹک اریتھروبلاسٹس کا مرحلہ 7 دن کے بعد پہنچ جاتا ہے تو، خلیے اپنے نیوکلی کو نکال کر ریٹیکولوسائٹس بن جاتے ہیں جس میں Epo ریسیپٹر اظہار کی کمی ہوتی ہے۔ 51 کالونی بنانے والی اکائیوں – erythroid کو reticulocytes یا یہاں تک کہ مکمل طور پر پختہ ہونے میں جو وقت لگتا ہے، اس کو مدنظر رکھتے ہوئے، یہ شاید حیرت کی بات نہیں ہے کہ WT چوہوں (شکل 6a – c) میں CT06 اور CT18 کے درمیان کوئی فرق نہیں دیکھا گیا۔ خاص طور پر، WT میں مجموعی طور پر reticulocyte کی تعداد Cry-null چوہوں (شکل 6a) کے مقابلے میں نمایاں طور پر زیادہ تھی، جس سے پتہ چلتا ہے کہ کرائی-نل چوہوں میں ریٹیکولوسائٹس میں فرق خراب ہے۔ پچھلے اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ ابتدائی erythroid progenitor خلیات بھی DNA کی ترکیب کے سرکیڈین پیٹرن کی نمائش کرتے ہیں۔ rhEpo کی vivo انتظامیہ میں erythroid کالونی نمبروں کی سرکیڈین تال میں اضافہ ہوتا ہے۔ 52 لوئر ریٹیکولوسائٹ نمبرز، کرائی-نل چوہوں میں نسبتاً زیادہ مجموعی S-Epo ارتکاز کے باوجود، ایریتھرایڈ پروجن کی سطح پر سرکیڈین ڈی این اے کی ترکیب کو ختم کرنے کے نتیجے میں ہو سکتا ہے۔ اعلی S-Epo اور کم erythropoiesis کا اس طرح کا نکشتر چوہوں میں پائنل میلاٹونن کی پیداوار کے جینیاتی خاتمے کے ساتھ دیکھا گیا ہے (C3H/HeN چوہوں جن میں شرح کو محدود کرنے والے N-acetyl transferase کی کمی ہے)، 53 erythroid progenitor cell پر اندرونی سرکیڈین سرگرمیوں کی دلیل ہے۔ سطح

خاص طور پر، Cry-null چوہے IGF1 کی سطح میں تقریباً 80 فیصد کمی کو ظاہر کرتے ہیں، جس کے نتیجے میں IGF1 سگنلنگ میں کمی اور WT کے مقابلے جسمانی وزن اور اعضاء کے سائز میں 30 فیصد کمی واقع ہوتی ہے، یہ ایک ایسا اثر ہے جو زندگی بھر میں بڑھ جاتا ہے۔ تجربات نسبتاً کم عمر تھے (درمیانی عمر،^21–29 ہفتوں)، انہوں نے کرائی-نل چوہوں میں کل جسم اور گردے کے مطلق وزن پر اعتدال پسند اثر ظاہر کیا، لیکن گردے سے جسمانی وزن کا تناسب نارمل تھا (ضمنی اعداد و شمار S3)۔ مؤخر الذکر حقیقت ایپو پروٹین کی ترکیب (شکل 1b) کی صلاحیت کے لئے متعلقہ ہوسکتی ہے۔

تاہم، خون کے سرخ خلیات کے سائز یا شکل (MCV, MCH, اور MCHC؛ ضمنی اعداد و شمار S5) کے تجزیے میں غذائیت کی کمی (مثال کے طور پر، آئرن اور فولیٹ) کو کرائی میں ریٹیکولوسائٹ اور نارمل اریتھروسائٹ شمار کے درمیان فرق کی وضاحت کے طور پر تجویز نہیں کیا گیا۔ null چوہے (شکل 6a اور b)۔ خاص طور پر، Epo اور IGF1 سگنلنگ GATA-1/GATA-1 ٹرانسکرپشن کمپلیکس کے دوست کے ساتھ تعامل کے ذریعے erythropoiesis کے دوران سیل کے پھیلاؤ اور تفریق کو ہم آہنگ کرتے ہیں۔ GATA-1 کی وابستگی، erythropoiesis کے بڑے ٹرانسکرپشن ریگولیٹر، GATA-1 کے اس کے کوفیکٹر دوست سے۔ تاہم، اگر IGF1 سگنلنگ کو ختم کر دیا جاتا ہے تو یہ طریقہ کار روک دیا جاتا ہے۔

ہیماٹوپوائسز پر مکمل سرکیڈین اریتھمیسیٹی کا عمومی اثر ہمارے پلیٹلیٹ اور ڈبلیو بی سی نمبروں کے تجزیہ سے مزید واضح ہوتا ہے۔ کلاک (ClockD19/D19) کی غالب-منفی شکل کا اظہار کرنے والے چوہوں کے پچھلے نتائج نے اشارہ کیا کہ تھرومبوپیٹین (میگاکاریوپوائسز کا بنیادی ریگولیٹر) اور اس کے رسیپٹر ایم پی ایل کے اظہار میں خلل کے نتیجے میں بالغ میرو میگاکاریوسائٹس اور گردش کرنے والی پلیٹلیٹ کی تعداد میں اضافہ ہوتا ہے۔ 55 WT چوہوں میں زیٹ جیبر ٹائم (ZT) 20 پر چوٹی پر پلیٹلیٹ نمبروں کی بیان کردہ اہم سرکیڈین دولن کے ساتھ ساتھ ClockD19/D19 چوہوں میں ZT08 پر زیادہ پلیٹلیٹ نمبر، 55 جس کے نتیجے میں پلیٹلیٹ نمبروں کی سرکیڈین دولن کی کمی نہیں ہو سکی، ہمارے ماؤس ماڈل میں تصدیق کی جائے (شکل 6d)۔ ایک اور اہم دریافت WT چوہوں (شکل 6e) کے برعکس Cry-null چوہوں میں گردش کرنے والے WBCs کے دن کے وقت کے فرق کا نقصان ہے، جو بالغ WBC پروڈکشن پر CLOCK/BMAL1 کی رپورٹ کردہ سرگرمی کے مطابق ہے۔^56,57

ہمارے اعداد و شمار کی تشریح کے لیے، چوہوں اور انسانوں میں دن رات کی سرگرمیوں میں فرق پر غور کرنے کی ضرورت ہے: انسانوں میں CT06 کا وقت تقریباً آدھی رات (سونے کے مرحلے) کے مساوی ہے، جب کہ CT18 تقریباً دوپہر (سرگرمی کا مرحلہ) سے مساوی ہے۔ رات کے چوہوں کے لیے اس کے برعکس سچ ہے، لیکن دونوں جاندار ایک ہی سرکیڈین ایپو ایکسپریشن پیٹرن دکھاتے ہیں (CT/ZT06 پر کم، CT/ZT18 پر زیادہ)۔ اس سے ظاہر ہوتا ہے کہ اضافی میکانزم (مثلاً میٹابولک عوامل) دونوں جانداروں میں Epo اظہار کی تال کو تبدیل کر سکتے ہیں۔ ابتدائی erythroid progenitors میں Epo چوٹی کی سطح اور Epo ریسیپٹر اظہار کے درمیان ہم آہنگی (پھٹنے والی اکائیاں – erythroid اور یہاں تک کہ کالونی بنانے والی اکائیاں – erythroid خلیات)⁵² تجویز کرتا ہے کہ rhEpo علاج حاصل کرنے والے مریض (مثلاً آخری مرحلے میں گردے کی انیمیا یا ہیماتولوجیکل عوارض میں) رات کے وقت ہائپو لگانے سے عام سرکیڈین فزیالوجی کی نقل کرنے سے فائدہ اٹھائیں گے۔ انسانوں میں CRY1 (آن لائن مینڈیلین وراثت *601933) یا CRY2 (آن لائن مینڈیلین وراثت ان مین *603732) کے افعال میں کمی کے تغیرات کے ساتھ ہیماٹوپوائٹک عوارض ابھی تک رپورٹ نہیں ہوئے ہیں۔ کلینیکل رپورٹس بنیادی طور پر توجہ کی کمی/ہائپر ایکٹیویٹی ڈس آرڈر کے ساتھ CRY1 کی مختلف حالتوں کو جوڑتی ہیں، اکثر بے خوابی، بے چینی، ڈپریشن، یا تاخیر سے نیند کے مرحلے کی خرابی کے ساتھ۔^58,59یہ مزید تحقیقات کا مستحق ہے کیونکہ اس طرح کی بیماریاں خون کی کمی یا ہیماٹوپوئٹک عوارض سے خراب ہو سکتی ہیں۔

آخر میں، یہ مطالعہ پہلا ثبوت فراہم کرتا ہے کہ نارموکسک بالغ مورین گردے میں سرکیڈین Epo اظہار کو 5'EPO پروموٹر میں CLOCK/BMAL1-ثالثی ای باکس عنصر کی ایکٹیویشن کے ذریعے نقل کی سطح پر منظم کیا جاتا ہے۔ چونکہ EPO erythropoiesis کے پیچیدہ ریگولیٹری نیٹ ورک کے اندر مخصوص طور پر کام کرتا ہے، گردوں کی کمی کے مریضوں میں ریپو کے زیادہ سے زیادہ استعمال میں رات کے وقت اس کے جسمانی سرکیڈین زیادہ سے زیادہ سے پہلے اس کا اطلاق شامل ہوسکتا ہے۔