Nephrotoxin Ochratoxin A کا انسانی گردوں کے خلیوں پر اثر جس کا مطالعہ ایک ناول کو-کلچر ماڈل کے ذریعے کیا گیا ہے وہ فائبرو بلاسٹس کی موجودگی سے متاثر ہوتا ہے۔
Mar 01, 2022
خلاصہ:دیگردہبہت سے ممکنہ زہریلے مادوں سے خطرہ ہے۔ نیفروٹوکسین اوکراٹوکسین اے (OTA) کے اثر و رسوخ کا مطالعہ کرنے کے لیے ہم نے ایک سیل کو کلچر ماڈل قائم کیا جس میں انسانگردوں proximal tubule خلیات اور fibroblasts. ہم نے سیل کی بقا پر OTA کے اثر، سیل کی موت سے متعلق جین اور/یا پروٹین کے اظہار، ایکسٹرا سیلولر میٹرکس اور انرجی ہومیوسٹاسس کا مطالعہ کیا۔ OTA حوصلہ افزائی نیکروسس کو دونوں سیل اقسام میں متعلقہ دیگر سیل قسم کی موجودگی میں بڑھایا گیا تھا، جبکہ OTA-حوصلہ افزائی اپوپٹوس اس سے آزاد تھا۔ فائبرو بلاسٹس میں، لیکن نلی خلیوں میں نہیں، سیل سائیکل سے متعلق پروٹین p21 کے اظہار کے بارے میں ایک شریک ثقافت کا اثر نظر آتا ہے۔ اپکلا سے mesenchymal منتقلی کی نشاندہی کرنے والے پروٹین ویمنٹن کا اظہار ثقافت کی حالت سے آزاد تھا۔ OTA کی حوصلہ افزائی lncRNA WISP1-AS1 کے اظہار کو شریک ثقافت میں بڑھایا گیا تھا۔ OTA کی نمائش نے گلوکوز کو متحرک کرنے والے اثر اور مائٹوکونڈریل پروٹین کے کم اظہار کے ساتھ توانائی کے تحول سے متعلق جینوں کے اظہار میں ردوبدل کا باعث بنا۔ ہم ایک ساتھ مل کر یہ ظاہر کرتے ہیں کہ خلیوں کی موجودگی میں خلیات کا رد عمل مختلف ہو سکتا ہے جو قدرتی طور پر قریب ہوتے ہیں، اس طرح سیلولر کراس ٹاک کو قابل بناتا ہے۔ لہٰذا، کسی مادے کی زہریلے پن کا اندازہ لگانے کے لیے، مونو کلچر کے بجائے شریک ثقافتوں کے استعمال پر غور کرنا فائدہ مند ہوگا۔
مطلوبہ الفاظ:اوکراٹوکسین اے؛ سیل ثقافت؛ توانائی میٹابولزم؛ apoptosis-necrosis توازن؛ مائٹوکونڈریا؛ گردہ؛ گردوں
CISTANCHE گردے/ گردوں کی خرابی کو بہتر کرے گا۔
تعارف
اس کے اخراج کے کام کی وجہ سے،گردہمختلف قسم کے نقصان دہ مادّوں سے خطرہ ہے جیسے کہ دوائیں یا کھانے کی آلودگی، جیسے مائکوٹوکسنز شدید یا اس سے بھی بدتر- دائمیگردے کی بیماریوںتقریباً 10 فیصد [1,2] کے پھیلاؤ کے ساتھ۔ نیفروٹوکسک عمل کے طریقہ کار کو سمجھنے کے لیے ان نقصان دہ منظرناموں کو ختم کرنے کے لیے حکمت عملی تلاش کرنا مددگار ہے اور اس سوال کو حل کرنے کے لیے بہت سے مطالعات کیے گئے ہیں کہ کیوں اور کیسےگردےخطرے سے دوچار ہیں [3-5]۔ کسی جاندار پر کسی مادہ کے اثرات کا مطالعہ کرنے کے لیے، اخلاقی خدشات اور تنظیمی، مہنگی اور وسیع شرائط کی وجہ سے اکثر پورے جانوروں کو استعمال کرنا مشکل ہوتا ہے۔ مزید برآں، انسانی حالات میں علم کی منتقلی غیر یقینی صورتحال سے وابستہ ہے۔ اس لیے، سیل کلچر کے ماڈلز قائم کیے گئے ہیں اور بڑے پیمانے پر استعمال کیے جاتے ہیں، اور ان کا فائدہ یہ ہے کہ سیل کی مخصوص قسم اور کسی مادہ یا علاج کے لیے اس کے ردعمل کا کنٹرول حالات میں مطالعہ کیا جا سکتا ہے۔ اگرچہ اس نقطہ نظر کو استعمال کرتے ہوئے بہت سے اور اہم نتائج حاصل کیے گئے ہیں، کچھ نقصانات موروثی ہیں: سیل لائن کے خلیات اکثر mutagenesis یا دیگر - بعض اوقات سخت - طریقوں کے ذریعہ امر ہوجاتے ہیں [6]۔ یہ آسان ہینڈلنگ اور طویل استعمال کی اجازت دیتا ہے لیکن اس خطرے کے ساتھ کہ ایک مخصوص ماڈل سسٹم میں پائے جانے والے نتائج پورے عضو یا جاندار کی صورت حال میں منتقلی کے قابل نہیں ہوسکتے ہیں۔ اس نقصان کو دور کرنے کے لیے، لافانی سیل لائنوں کے بجائے، بنیادی خلیات استعمال کیے جا سکتے ہیں، لیکن بنیادی خلیوں کی تخلیق اکثر بہت مشکل ہوتی ہے اور اس کے لیے جدید تکنیکی مہارتوں کی ضرورت ہوتی ہے۔ مزید برآں، بنیادی خلیات اکثر طویل عرصے تک زندہ نہیں رہتے ہیں اور انہیں خصوصی ثقافتی حالات کی ضرورت ہوتی ہے۔ لیکن بنیادی خلیے قدرتی حالات کے قریب ایک قدم ہوتے ہیں اور کم از کم بعض اوقات یہ معلوم ہوتا ہے کہ وہ زہریلے محرکات کے لیے زیادہ حساس ہوتے ہیں، جیسے کہ سیل لائنز [7] ہیں، یعنی سیل لائنز زیادہ مضبوط ہو سکتی ہیں۔ ایک اور نقصان یہ ہے کہ خلیات کو اکثر monoculture میں رکھا جاتا ہے، یعنی، خلیات کی دیگر اقسام کے اثرات کے بغیر، جو کہ ان کے گھریلو عضو میں عموماً قریب ہوتے ہیں۔ لہٰذا، یہ ایک زیادہ حقیقت پسندانہ صورت حال کی طرف ایک قدم ہو سکتا ہے کہ کسی مادے یا علاج کے لیے خلیے کی قسم کے ردعمل کا مطالعہ ان خلیات کی موجودگی میں کیا جائے، جو مقامی اعضاء میں قریب سے ہیں۔
میںگردہ, proximal tubule خلیات fifibroblasts سے گھرے ہوئے ہیں اور ایک - ممکنہ طور پر باہمی - اثر و رسوخ فرض کیا جا سکتا ہے۔ میں بھی ایسا ہی ہے۔گردے کو نقصان پہنچانے والاایسے منظرنامے جو زیادہ تر معاملات میں ٹیوبلو انٹرسٹیشل سوزش اور فبروسس کا باعث بنتے ہیں [8,9]، اور اس کے زوال کے لیے فیصلہ کن ہوتے ہیں۔گردہفنکشن ان کی نقل و حمل اور انزیمیٹک صلاحیتوں کی وجہ سے،گردوںproximal tubule خلیات مختلف قسم کے ممکنہ زہریلے مادوں جیسے کہ منشیات یا ان کی باقیات یا mycotoxins سے خطرے میں پڑ جاتے ہیں۔ آس پاس کے فائبرو بلاسٹس کا ایک کردار کولیجنز اور دیگر میٹرکس اجزاء کے اخراج کے ذریعے ایکسٹرا سیلولر میٹرکس کو پیش کرنا ہے اور اس وجہ سے ٹشو کی سالمیت میں حصہ لینا ہے [10]۔ لیکن وہ بھی ہیں - ایک ساتھ مل کر اپکلا خلیوں کے ساتھ - سوزش کے عمل میں یا فائبروٹک میں شامل ہیں۔گردے کی بیماریوں[11] ترقی کے خطرے کے ساتھگردے خراب.
انسانی صحت کے لئے مطابقت کے ساتھ ایک گہرائی سے مطالعہ کیا گیا مائکوٹوکسین ہے اوکراٹوکسین اے (OTA) [12,13]۔ یہ مختلف قسم کے کھانے پینے کی چیزوں میں پایا جا سکتا ہے [12,14] اور اس کی نمائش سے بچنا تقریباً ناممکن ہے [9,15]۔ یہ اس مشاہدے کی طرف جاتا ہے کہ OTA انسانی خون میں کم نانومولر ارتکاز میں اکثر پایا جاتا ہے [16]۔ بے نقاب جانوروں میں، OTA کی طرف جاتا ہےگردے خراباور fifibrotic تبدیلیاں [17,18]۔ OTA کی نمائش کو انسان میں ملوث سمجھا جاتا ہے۔گردے کی بیماریوں[19]۔ انسانی پرائمری پروکسیمل ٹیوبول سیلز میں، OTA کا زہریلا اثر دکھایا گیا ہے، جو کہ انسانی پرائمری فائبرو بلاسٹس میں بھی قابل مشاہدہ ہے، حالانکہ یہ اتنا نمایاں نہیں ہے جتنا کہ proximal tubule سیلز میں [7]۔ OTA کے زہریلے عمل کے پیچھے میکانزم ابھی تک پوری طرح سے سمجھ میں نہیں آئے ہیں اور بہت سے جاری مطالعات کا موضوع ہیں۔ مختلف افعال کے ساتھ ہمسایہ خلیات کس حد تک مداخلت کرتے ہیں اور اس طرح سیل کے فنکشن کو تبدیل کرتے ہیں تقریبا معلوم نہیں ہے لیکن یہ متوقع ہے۔ پچھلے مطالعے میں چوہے پر مشتمل کو-کلچر ماڈل کا استعمال کرتے ہوئےگردہproximal tubule اور fifibroblast خلیات، یہ پتہ چلا کہ دونوں قسم کے خلیوں کے درمیان ایک قسم کا کراسسٹالک ہوتا ہے، جس سے یہ مشاہدہ ہوتا ہے کہ OTA کے اثرات بطور اپیتھیلیل سے mesenchymal ٹرانزیشن (EMT) صرف شریک ثقافت کے حالات میں واقع ہوئے ہیں [20]۔ اس مطالعے اور دیگر سے نکالا جانے والا ایک اور نتیجہ یہ تھا کہ چوہوں کے خلیے او ٹی اے کو برداشت کرنے کے حوالے سے انسانی قربت والے نلی خلیوں [7,20] کے مقابلے میں زیادہ مضبوط ہوتے ہیں اور اس لیے انسانی حالات کا قریب سے جائزہ لینے کے لیے انسانی خلیوں پر مبنی ایک ماڈل سسٹم کی ضرورت ہوتی ہے۔ OTA کی نمائش کا خطرہ۔
لہذا، موجودہ مطالعہ میں، ہم خلیے کی بقا پر OTA کے اثرات کا مطالعہ کرنے کے لیے انسانی قربت والے ٹیوبول خلیات (HK2 خلیات) اور انسانی فائبروبلاسٹ (CCD-1092SK خلیات) پر مشتمل ایک جدید سیل کو کلچر ماڈل قائم کرتے ہیں۔ , necrosis) اور سیل سائیکل، سیل کی موت، ایکسٹرا سیلولر میٹرکس، اور میٹابولزم سے متعلق کچھ مثالی طور پر منتخب جینوں کا اظہار۔ چوہوں کے خلیوں کا استعمال کرتے ہوئے پچھلے مطالعات کی طرح [20]، انسانی قربت والے نلی خلیوں کو فلٹر ڈیوائسز پر رکھا گیا تھا اور فلٹرز کو پیٹری ڈش کے نچلے حصے میں فبرو بلاسٹس کی ایک تہہ کے اوپر رکھا گیا تھا تاکہ اپکلا خلیات کے بیسولیٹرل سائیڈ کا رخ ہو فائبرو بلاسٹس، دونوں قسم کے خلیوں کے درمیان ایک قسم کی گفتگو کو چالو کرتے ہیں۔
نتائج
پروٹین، لییکٹیٹ ڈیہائیڈروجنیز ریلیز اور کیسپیس-3 سرگرمیخود ثقافتی حالات کے ممکنہ اثرات کے ساتھ ساتھ OTA کی حوصلہ افزائی کی تبدیلیوں پر اثرات کے بارے میں پہلا تاثر حاصل کرنے کے لیے، ہم نے کیسپیس-3 سرگرمی کا موازنہ یک کلچر میں اگائے جانے والے خلیوں کے اپوپٹوسس کی پیمائش کے ساتھ ساتھ - کلچر 100 nM OTA کے ساتھ یا اس کے بغیر وقت کے دو پوائنٹس، 24 اور 48 گھنٹے کے لیے انکیوبیٹڈ۔ اس کے علاوہ، لییکٹیٹ ڈیہائیڈروجنیز (LDH) کی رہائی کو نیکروسس کے لیے ایک پیمائش کے ساتھ ساتھ پروٹین کے مواد کا تعین کیا گیا تھا تاکہ سیل کی حیثیت پر مجموعی تاثر دیا جا سکے۔ لہذا، خلیات کی مساوی مقدار کو یا تو کنویں کے نیچے (فائبروبلاسٹ) میں رکھا گیا تھا یا فِفلٹر (قریبی ٹیوبول سیل) پر رکھا گیا تھا۔ سنگم تک پہنچنے کے بعد، فائی فلٹرز کو کنوؤں میں رکھ دیا گیا جس میں فائبرو بلاسٹس موجود تھے (تصویراتی خلاصہ دیکھیں)۔ جیسا کہ شکل 1A میں دکھایا گیا ہے، 24 یا 48 گھنٹے کے بعد دونوں قسم کے خلیوں میں پروٹین کے مواد پر کلچر کی حالت پر منحصر تقریباً کوئی اثر نہیں دیکھا جا سکتا ہے (ضمنی فائل S1 بھی دیکھیں)۔ fifibroblasts میں، OTA کی نمائش پروٹین کے مواد میں ایک چھوٹا سا اضافہ کا باعث بنتی ہے جب کہ نلی خلیوں میں OTA پروٹین کے مواد میں معمولی کمی کا باعث بنتا ہے جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ OTA کا نلی خلیوں پر منفی اثر پڑ سکتا ہے۔ یہ اثرات دونوں سیل اقسام میں کلچر کی حالت سے تقریباً آزاد تھے۔
تصویر 1. پروٹین کے مواد (A)، کیسپیس-3 سرگرمی (B)، اور لییکٹیٹ ڈیہائیڈروجنسیس (LDH) ریلیز (C) پر اوکراٹوکسین A (OTA) اور/یا ثقافت کے حالات کے اثرات۔ خلیوں کی کاشت یا تو مونو- یا کو-کلچر میں کی گئی تھی اور 24 یا 48 گھنٹے کے لیے 100 nM OTA کے سامنے آئے تھے۔ N=3–6، n=14–18 (پروٹین، LDH) یا 8–9 (کیسپیس-3)۔ * AP <0.05 کو="" غیر="" ota="" سے="" ظاہر="" ہونے="" والے="" خلیوں="" کی="" طرف="" اشارہ="" کرتا="" ہے="" (ota="" اثرات="" کا="" موازنہ="" کرنا،="" resp.="" بائیں="" طرف)="" یا="" mono-culture="" میں="" خلیات="" (ثقافت="" کے="" اثرات="" کا="" موازنہ،="" resp.="" دائیں="" طرف)۔="" پروٹین="" کے="" مواد="" پر="" اثر="" کی="" مزید="" وضاحت="" کرنے="" کے="" لیے،="" ہم="" نے="" اپوپٹوسس="" اور="" نیکروسس="" کا="" مطالعہ="" کیا۔="" fifibroblasts="" کے="" مقابلے="" میں،="" ota="" کا="" تقریباً="" 2="" کے="" ساتھ="" 24="" گھنٹے="" کے="" ایکسپوژر="" کے="" بعد="" ٹیوبول="" سیلز="" میں="" apoptosis="" پر="" واضح="" اثر="" پڑا۔{21}}سرگرمی="" میں="" گنا="" اضافہ="" (شکل="" 1b)۔="" 48="" گھنٹے="" کی="" نمائش="" کے="" بعد="" بھی="" اضافہ="" قابل="" مشاہدہ="" تھا="" لیکن="" اتنا="" مخصوص="" نہیں="" جتنا="" 24="" گھنٹے="" کے="" بعد۔="" تاہم،="" یہ="" اضافہ="" کلچر="" کے="" حالات="" سے="" تقریباً="" آزاد="" تھا="" سوائے="" اس="" کے="" کہ="" fifibroblasts="" کی="" موجودگی="" میں="" 48="" گھنٹے="" کے="" بعد="" tubule="" خلیات="" میں="" کیسپیس="" کی="" سرگرمی="" قدرے="" کم="" ہو="" گئی="" تھی،="" جو="" شریک="" ثقافت="" کے="" ایک="" معمولی="" حفاظتی="" اثر="" کی="" نشاندہی="" کرتی="" ہے۔="" تاہم،="" شریک="" ثقافت="" کا="" ایک="" حفاظتی="" اثر="" fifibroblasts="" کے="" لیے="" قابل="" مشاہدہ="" تھا،="" خاص="" طور="" پر="" ota="" کی="" موجودگی="" میں۔="" شریک="" ثقافت="" میں،="" ldh="" کی="" رہائی="" کو="" واضح="" طور="" پر="" fifibroblasts="" اور="" tubule="" خلیوں="" میں="" بڑھایا="" گیا="" تھا="" جب="" ota="" (شکل="" 1c)="" کی="" موجودگی="" سے="" آزاد="" مونو="" کلچر="" کے="" حالات="" کے="" مقابلے="" میں۔="" ٹیوبیل="" خلیوں="" میں،="" ota="" نے="" خاص="" طور="" پر="" 48="" گھنٹے="" کی="" نمائش="" کے="" بعد="" میڈیا="" میں="" جاری="" ہونے="" والے="" ldh="" میں="" اضافہ="" کیا،="" جو="" فبرو="" بلوسٹس="" میں="" واضح="" نہیں="" تھا۔="" ایک="" ساتھ="" مل="" کر،="" متعلقہ="" دیگر="" سیل="" قسم="" کی="" موجودگی="" نے="" نیکروسس="" کو="" بڑھایا="" لیکن="" اپوپٹوسس="" کو="" کم="" کیا="" تاکہ="" مجموعی="" طور="" پر="" پروٹین="" کے="" مواد="" کو="" نمایاں="" طور="" پر="" تبدیل="" نہ="" کیا="" جاسکے۔="" اپوپٹوسس="" اور="" نیکروسس="" پر="" او="" ٹی="" اے="" کے="" اثرات="" بھی="" زیادہ="" تر="" سیل="" کی="" دوسری="" قسم="" کی="" موجودگی="" یا="" عدم="" موجودگی="" سے="" آزاد="">
ویسٹرن بلاٹ اور ایم آر این اے ایکسپریشن
CDKN1A/p21سیل سائیکل کو OTA سے متاثر دکھایا گیا تھا اور یہ دکھایا جا سکتا ہے کہ p21 پروٹین جو سیل سائیکل میں شامل ہے OTA کے ذریعے ٹیوبول سیلز [21] میں اپ گریڈ کیا گیا تھا۔ یہ جاننے کے لیے کہ پروٹین، نیز p21 کے لیے mRNA کوڈنگ کا اظہار، fibroblasts کی موجودگی سے کس حد تک متاثر ہوتا ہے، ہم نے ویسٹرن بلاٹس اور RT-PCR کا مظاہرہ کیا۔ جیسا کہ اعداد و شمار 2A، B اور 3 میں دکھایا گیا ہے، 100 nM OTA کے 48 گھنٹے کی نمائش نے مونو میں p21 پروٹین کی مقدار میں اضافہ کیا بلکہ ٹیوبیل خلیوں میں کو-کلچر کنڈ آئیشنز میں بھی۔ شریک ثقافت کی حالتوں کے تحت فبسوبلاسٹس میں، OTA کا p21-پروٹین کے اظہار پر کوئی اثر نہیں ہوا حالانکہ mRNA اظہار کو OTA نے دوسرے سیل قسم کی موجودگی سے آزاد بڑھایا تھا۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ شریک ثقافت کے حالات میں، OTA کی نمائش نے p21 پروٹین کے اظہار میں مزید اضافہ نہیں کیا۔ نلی خلیوں میں، ان کے آر این اے اظہار کو فائبرو بلاسٹس کی موجودگی سے تبدیل نہیں کیا گیا تھا لیکن شریک ثقافت میں فائبرو بلاسٹس میں، ZlmRNA ایکسپریشن کو نہ صرف OTA سے بے نقاب کیا گیا تھا بلکہ پہلے سے OTA کے سامنے نہ آنے والے خلیوں میں بھی (ضمنی فائل S1 بھی دیکھیں)۔ اس سے پتہ چلتا ہے کہ دوسرے سیل قسم کے p ریسینی کا p21 پروٹین کے اظہار پر اثر ہوتا ہے، خاص طور پر فائبرو بلاسٹس میں۔
Cyclooxygenase 2 (COX2)یہ دکھایا گیا ہے کہ cyclooxygenase 2 (COX2) پروٹین کے ساتھ ساتھ mRNA کی سطح میں اضافہ ہوتا ہے۔گردے خراب[22]۔ جیسا کہ اعداد و شمار 2C، D اور 3 میں دکھایا گیا ہے، صرف fifibroblasts میں OTA کی نمائش سے پروٹین کے اظہار میں اضافہ ہوا ہے۔ اس کے علاوہ، ٹیوبول سیلز کی موجودگی میں، COX2 پروٹین ایکسپریشن کو علاج نہ کیے جانے کے ساتھ ساتھ OTA سے ظاہر ہونے والے خلیوں میں بھی بڑھایا گیا تھا، جس سے tubule خلیوں کے واضح اثر کو ظاہر کیا گیا تھا۔ mRNA اظہار، تاہم، OTA سے متاثر نہیں ہوا تھا اور OTA کی نمائش سے شریک ثقافت کا بہت معمولی اثر ہوا ہے۔ اس کے برعکس، نلی خلیوں میں، COX2 کا mRNA اور پروٹین کا اظہار OTA یا fifibroblasts کی موجودگی سے مکمل طور پر آزاد تھا۔ اس سے پتہ چلتا ہے کہ COX2 ٹیوبول خلیات سے متعلق فائبرو بلاسٹس کو متاثر کر سکتے ہیں لیکن فائبروبلاسٹ کا ٹیوبیل خلیوں پر کوئی اثر نہیں ہوتا ہے۔
فائبرونیکٹینگردے خراباکثر fifibrosis کے ساتھ ہے. فائبروسس کے دوران، ایکسٹرا سیلولر میٹرکس کا جمع ہوتا ہے اور دوسرے مشاہدے کے علاوہ فائبرونیکٹین پروٹین کی مقدار میں اضافہ ہوتا ہے [23]۔ لہذا، fibronectincoding mRNA اور پروٹین کے اظہار کی OTA پر منحصر تبدیلی کا تعین مونو- یا شریک ثقافت کے حالات میں کیا گیا تھا۔ جیسا کہ اعداد و شمار 3 اور 4A,B میں دکھایا گیا ہے، 100 nM OTA میں ٹیوبول سیلز کی 48 گھنٹے کی نمائش مونو اور کو کلچر دونوں میں انٹرا سیلولر فائبرونیکٹین کی کمی کا باعث بنی۔ شریک ثقافت میں OTA کا اثر کم تھا۔ مزید یہ کہ ، فائبرونیکٹین کے لئے ایم آر این اے کوڈنگ کی مقدار کو ثقافت کے حالات سے آزادانہ طور پر او ٹی اے کی نمائش کے ذریعہ کم کیا گیا تھا اور فائبروبلاسٹ کی موجودگی نے کنٹرول اور او ٹی اے کے بے نقاب خلیوں میں ایم آر این اے اظہار کو کم کیا تھا۔ اس کے برعکس، fifibroblasts میں fifibronectin کے اظہار کو تقریباً نہ تو OTA کے ذریعے تبدیل کیا گیا اور نہ ہی ثقافتی حالات کی وجہ سے، خاص طور پر مغربی دھبوں میں۔ OTA حوصلہ افزائی اظہار کی طرف رجحان مونو کلچر میں نظر آسکتا ہے۔
ویمینٹنVimentin ایک پروٹین ہے جس کی کثرت اس وقت بڑھ جاتی ہے جب اپکلا سے mesenchymal منتقلی (EMT) ہوتی ہے اور EMT ترقی کا باعث بن سکتی ہے۔گردے خراب[23]۔ لہذا، ویمنٹن ایم آر این اے اور پروٹین ایکسپریشن کی او ٹی اے پر منحصر تبدیلی مونو- اور شریک ثقافت کے حالات میں طے کی گئی تھی۔ جیسا کہ اعداد و شمار 3 اور 4C,D میں دکھایا گیا ہے، 100 nM OTA میں ٹیوبول سیلز کی 48 گھنٹے کی نمائش نے مونو اور کو کلچر دونوں حالات میں ویمنٹن پروٹین کی کم کثرت کا باعث بنی۔ تاہم، fifibroblasts کی موجودگی میں vimentin پروٹین کا اظہار ثقافت کے حالات سے آزاد تھا۔ ویمنٹن کے لیے mRNA کوڈنگ کے اظہار کو تقریباً نہ تو OTA کے ذریعے تبدیل کیا گیا اور نہ ہی ثقافتی حالات کے ذریعے اس استثنا کے ساتھ کہ شریک ثقافت میں OTA کی نمائش میں معمولی اضافہ ہوا۔ fifibroblasts میں، vimentin پروٹین کا اظہار OTA کی نمائش کے ساتھ ساتھ tubule خلیوں کی موجودگی سے مکمل طور پر آزاد تھا۔ اس کے علاوہ، ویمنٹن کوڈنگ ایم آر این اے اظہار کو تقریباً تبدیل نہیں کیا گیا تھا۔
کچھ منتخب جینز کا اظہارمثالی طور پر مزید جانچنے کے لیے کہ ثقافتی حالات دوسرے RNAs کے اظہار کو بھی کس حد تک متاثر کر سکتے ہیں، ہم نے کچھ جینز کا انتخاب کیا، جو اپوپٹوس-نیکروسس، کینسر کی نشوونما، یا توانائی کے میٹابولزم میں کردار ادا کرتے ہیں (ضمنی فائل S1 بھی دیکھیں)۔
WISP1-AS1ایک لمبا نان کوڈنگ آر این اے (lncRNA) ہے جو OTA کے ذریعہ ٹرانسکرپ ٹینل ریگولیشن کو متاثر کرتا ہے اور apoptosis-necrosis کے توازن میں اور ممکنہ طور پر کینسر کی نشوونما میں کردار ادا کرتا ہے [24]۔ جیسا کہ شکل 5A میں دیکھا گیا ہے، 100 nM OTA کے 48 گھنٹے کی نمائش نے دونوں قسم کے خلیوں میں اس lncRNA کے اظہار میں واضح اضافہ کیا۔ OTA کے بغیر، متعلقہ دوسرے سیل قسم کی موجودگی کا اظہار پر تقریباً کوئی اثر نہیں تھا۔ تاہم، او ٹی اے کی موجودگی میں، مونو کلچر کے مقابلے شریک ثقافت میں اس کا اظہار زیادہ تھا۔
جی ڈی ایف 15گروتھ ڈیفرینیشن فیکٹر 15 (GDF15) تبدیلی لانے والے گروتھ فیکٹر کا ایک رکن ہے جو انتہائی خاندانی طور پر تناؤ کا جواب دیتا ہے۔ اس پر بائیو مارکر کے طور پر بھی بحث کی جاتی ہے۔گردے کی بیماریوںیا کی بقا کے پیش گو کے طور پرگردہٹرانسپلانٹ مریض [25,26]۔ GDF15 کے لیے mRNA کوڈنگ کے اظہار کو OTA کی نمائش کے بعد سیل کی دونوں اقسام میں بڑھایا گیا جیسا کہ شکل 5B میں دکھایا گیا ہے۔ یہ OTA-حوصلہ افزائی اثر fifibroblasts میں پسند کیا گیا تھا جب tubule خلیات آس پاس میں تھے۔ تاہم، نلی خلیوں میں، اظہار fifibroblasts (شکل 5B) کی موجودگی سے آزاد تھا۔CDK2سائکلن پر منحصر کناز 2 (سی ڈی کے 2) کی شناخت وزنی ارتباطی نیٹ ورک تجزیہ کے ذریعہ او ٹی اے سے حوصلہ افزائی سیل سائیکل ڈیس ریگولیشن [21] کے ایک بڑے ریگولیٹر کے طور پر کی گئی تھی۔ monoculture میں fifibroblasts میں CDK2 کے لیے mRNA کوڈنگ کے اظہار کو OTA کے ذریعے تبدیل نہیں کیا گیا۔ مزید برآں، ٹیوبیل خلیوں کی موجودگی نے mRNA اظہار کو متاثر نہیں کیا۔ تاہم، ٹیوبول خلیوں میں، OTA نے صرف fifibroblasts (شکل 5C) کی موجودگی میں قدرے بہتر اظہار کا باعث بنا۔
گلائکوجن اور گلوکوز سے متعلقہ پروٹین: PYGM، GYS1 اور GLUT1 (SLC2A1)دیگردہگلوکوز ہومیوسٹاسس میں بھی شامل ہے اور جسم کو گلوکوز فراہم کر سکتا ہے یا تو گلوکوزیوجنیسیس کے ذریعے یا گلیکوجن اسٹورز کو متحرک کر کے [27]۔ گلائکوجن فاسفوریلیس (PYGM) گلائکوجن اسٹورز کے گلنے سڑنے میں کردار ادا کرتا ہے، اس طرح گلوکوز کو متحرک کرتا ہے [28]۔ جیسا کہ شکل 6A میں دیکھا گیا ہے، 100 nM OTA میں 48 گھنٹے کی نمائش نے گلائکوجن فاسفوریلیس کے لیے mRNA کوڈنگ کے اظہار میں واضح اضافہ کیا، خاص طور پر ٹیوبول سیلز میں۔ تاہم، نلی خلیوں میں یہ اضافہ کلچر کی حالت پر منحصر نہیں تھا جبکہ فائبرو بلاسٹس میں او ٹی اے کی حوصلہ افزائی کا اظہار نلی خلیوں کی موجودگی میں زیادہ تھا جیسا کہ نلی خلیوں کے بغیر حالت کے مقابلے میں، گلائکوجن سنتھیس 1 (G^YSl) مخالف ردعمل کو اتپریرک کرتا ہے۔ اور جہاں فاسفوریلیس کے اظہار کو اپریگولیٹ کیا گیا تھا، سنتھیس کے اظہار کو OTA کے ذریعے ٹیوبول سیلز اور کو-کلچر میں فبرو بلاسٹس میں ریگولیٹ کیا گیا تھا (شکل 6B)۔ یہ OTA کے گلوکوز کو متحرک کرنے والے اثر کی نشاندہی کرتا ہے، دلچسپ بات یہ ہے کہ گلوکوز ٹرانسپورٹر GLUTl (SLC2A1) کے mRNA اظہار کو OTA نے بھی اپ ریگولیٹ کیا تھا، (شکل 6C)، جو کہ OTA کی وجہ سے گلوکوز کی بڑھتی ہوئی طلب کے خیال کی نشاندہی کرتا ہے۔
مائٹوکونڈریا سے متعلقہ پروٹین: NDUFB10 اور MRPS16
ایسے اشارے ہیں کہ OTA کی نمائش میں مائٹوکونڈریل صلاحیت میں کمی کا باعث بن سکتی ہے۔گردہخلیات [24] ظاہر کرتے ہیں کہ مائٹوکونڈریل فنکشن OTA کی نمائش سے متاثر ہوسکتا ہے، جو اضافی طور پر فائبرو بلاسٹس کی موجودگی سے بھی متاثر ہوسکتا ہے۔ لہذا، مائٹوکونڈریل پروٹینز کے لیے دیگر RNA کوڈنگ کے نمائندے، ہم یہاں NDUFB10 اور MRPS16 کے لیے mRNAs کوڈنگ کا اظہار دکھاتے ہیں۔ مائٹوکونڈریل NADH کے لیے NDUFBt0 کوڈز: ubiquinone oxidoreductase subunit B10، جو کہ mitochondrial ریسپریٹری کمپلیکس I کا ایک حصہ ہے اور انتہائی دل اورگردہ(NCBI جین۔ آن لائن دستیاب ہے: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4716 (17 مارچ 2021 کو رسائی)۔ MRPS16 جین کوڈز مائٹوکونڈریل رائبوسومل پروٹین S16 کے لیے ہیں، جو مائٹوکونڈریل پروٹین کی ترکیب میں کردار ادا کرتا ہے۔ جیسا کہ شکل 7 میں دکھایا گیا ہے، 24 گھنٹے OTA کی نمائش دونوں سیل اقسام میں دونوں mRNAs کے اظہار میں کمی کا باعث بنی۔ ٹیوبول خلیوں میں، NDUFB10 جین کا کم ہوا اظہار فبرو بلوسٹس کی موجودگی سے متاثر نہیں ہوا تھا، جبکہ فائبرو بلاسٹس میں NDUFB10 اظہار کی OTA کی حوصلہ افزائی میں کمی کو ٹیوبول خلیوں کی موجودگی میں قدرے بچایا گیا تھا (شکل 7A)۔ نلی خلیوں میں، او ٹی اے کے ذریعہ مائٹوکونڈریل رائبوسومل سبونائٹ کے لیے جین کوڈنگ کا پہلے سے کم اظہار فائبرو بلاسٹس کی موجودگی میں بھی کم تھا، جب کہ فائبرو بلاسٹس میں ٹیوبیل خلیوں کی موجودگی MRPS16 mRNA (شکل 7B) کے قدرے زیادہ اظہار کا باعث بنی۔ اس سے ظاہر ہوتا ہے کہ مائٹوکونڈریل فنکشن OTA سے متاثر ہو سکتا ہے لیکن OTA اثر میں اس کے علاوہ تب تبدیلی کی جا سکتی ہے جب دو سیل اقسام ایک دوسرے کے قریب ہوں۔
بحث
دیگردہشدید یا کرونائٹ کے خطرے کے ساتھ مختلف قسم کے نیفروٹوکسک مادوں سے خطرہ ہےگردے خراب[1]۔ مختلف خلیوں کی اقسام پر نیفروٹوکسک مادوں کے اثرات کے مطالعہ کے لیے اور جانوروں کی ہینڈلنگ کو کم کرنے کے لیے، سیل کلچر کو بڑے پیمانے پر لاگو کیا گیا ہے۔ ان سیل کلچرز کا اضافی فائدہ یہ ہے کہ تجرباتی حالات کو کنٹرول کیا جا سکتا ہے اور کسی مادے کے مخصوص اثرات کو ایک متعین سیل قسم کا استعمال کرتے ہوئے جانچا جا سکتا ہے۔ ان غیر متنازعہ فوائد کے علاوہ، کچھ تحفظات باقی ہیں: مثال کے طور پر، "گھریلو اعضاء" میں ایک خلیے کی قسم (مثال کے طور پر، قریبی نلیاں کے خلیےگردہ) مینی فولب باہمی انحصار کے ساتھ دیگر خلیوں کی اقسام (مثلاً، فائبرو بلاسٹس) سے گھرا ہوا ہے۔ لہذا، صرف ایک خلیے کی قسم کو استعمال کرتے وقت مشاہدہ کیا جانے والا مادہ کا ردعمل وہی نہیں ہو سکتا جیسا کہ اصل بافتوں میں خلیات کی موجودگی میں ہوتا ہے۔ دو مختلف چوہوں کے گردوں کے خلیوں کی اقسام پر مشتمل ایک ماڈل میں، یہ دکھایا گیا ہے کہ ٹیوبول اور فبروبلاسٹ خلیوں کے درمیان ایک کراس ٹاک موجود ہے، جس کے نتیجے میں رد عمل صرف اس وقت ظاہر ہوتا ہے جب دونوں خلیوں کی اقسام ایک دوسرے کے قریب ہوں [20]۔ تاہم، جب اس اسٹڈی کے نتائج کا انسانی گردوں کے نلکے کے خلیوں کے استعمال سے مشاہدہ کیے گئے نتائج سے موازنہ کیا جائے تو یہ بات سامنے آتی ہے کہ چوہوں کے خلیے اس سے کہیں زیادہ مضبوط ہوتے ہیں جو انسان ہر جگہ موجود نیفروٹوکسین، اوکرافوکسین اے (OTA) کے ساتھ علاج کے بارے میں اپنے ردعمل کو بتاتا ہے [7]۔ لہذا، انسانی خلیات پر مشتمل ایک مشترکہ ثقافت کا ماڈل ضروری ہے۔ ہم نے انسانی قربت والے ٹیوبول سیل لائن HK2 اور انسانی فائبرو بلاسٹس کا استعمال کرکے ایسا ماڈل قائم کیا۔ HK2 خلیے گیلے فلٹر داخل کرنے پر اگائے جاتے ہیں اور فائبرو بلاسٹس کے ساتھ اکٹھے ہوتے ہیں، جو کنویں کی پلیٹ کے نچلے حصے پر اگتے ہیں۔ apoptosis اور necrosis کے بطور بنیادی پیرامیٹرز کو ریکارڈ کرنے کے بعد، ہم نے سیل سائیکل، EMT، اور سیلولر میٹابولزم سے متعلق کچھ پروٹینز اور RNAs کے اخراج پر اوکراٹوکسین A کے اثر پر ابتدائی ڈیٹا حاصل کرنے کے لیے اس ماڈل کا استعمال کیا۔
سیل کی بقا پروٹین کے مواد کی بنیاد پر، ایسا لگتا ہے کہ نہ تو OTA اور نہ ہی ثقافتی حالت کا کوئی قابل ذکر اثر پڑا ہے۔ تاہم، اپوپٹوسس اور نیکروسس کے درمیان تعلقات کو دونوں قسم کے خلیوں میں نیکروسس کی طرف منتقل کر دیا گیا تھا جب خلیوں کو ایک ساتھ کلچر کیا گیا تھا۔ او ٹی اے ٹیوبول خلیوں میں اپوپٹوس کو دلانے کے لئے جانا جاتا ہے [29] اور فبرو بلوسٹس میں بھی کم توسیع کرتا ہے [7]۔ موجودہ نتائج میں بھی اس کی عکاسی ہوتی ہے۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ متعلقہ دیگر سیل قسم کی موجودگی نے دونوں سیل اقسام میں اپوپٹوسس کی شرح کو کم کیا لیکن ایل ڈی ایچ کی رہائی کو بڑھایا۔ یہ پہلا اشارہ ہے کہ پہلے سے ہی کسی دوسرے خلیے کی قسم کی موجودگی سیلولر فنکشن کو متاثر کر سکتی ہے اور یہ کہ کسی زہریلے مادے پر خلیات کا رد عمل مونو کلچر کے مقابلے شریک ثقافت میں مختلف ہو سکتا ہے۔
پروٹین اور آر این اے اظہار ہم نے اپنے مطالعے کو کچھ مثالی طور پر منتخب پروٹینوں کے پروٹین اور آر این اے اظہار اور ان کے لیے کوڈنگ والے آر این اے کے تعین کے ذریعے بڑھایا۔ جیسا کہ OTA کو سیل سائیکل [21,30] کو متاثر کرنے کے لیے دکھایا گیا تھا، CDKN1A/p21 کے اظہار کا مطالعہ کیا گیا۔ Dubourg et.al [21] کے نتائج کے مطابق، OTA کی وجہ سے نہ صرف CDKN1A mRNA بلکہ CDKN1A/p21 پروٹین کے ٹیوبول سیلز میں بھی اضافہ ہوا۔ ان خلیوں میں، فبرو بلوسٹس کی موجودگی نے CDKN1A mRNA اظہار کو متاثر نہیں کیا، جب کہ فبرو بلوسٹس میں ایک واضح شریک ثقافت کا اثر نظر آتا ہے جس میں بہتر mRNA کثرت صرف شریک ثقافت میں دکھائی دیتی ہے۔ تاہم، ایم آر این اے کی کثرت میں یہ اضافہ مکمل طور پر پروٹین کے اظہار کے ذریعہ عکس بند نہیں کیا گیا تھا، جو مزید ریگولیٹری میکانزم کی تجویز کرتا ہے۔ سیل سائیکل پر اثرات کے بارے میں مزید بصیرت حاصل کرنے کے لیے سیل سائیکل اسٹڈیز کو شامل کیا جا سکتا ہے۔ سائکلن پر منحصر کناز 2 (سی ڈی کے 2) کو سیل سائیکل [21] کے او ٹی اے کی حوصلہ افزائی کی خرابی میں کردار ادا کرنے کے لئے پایا گیا تھا۔ ٹیوبول خلیوں میں، اس کے ایم آر این اے اظہار کو شریک ثقافت میں او ٹی اے کے ذریعہ بڑھایا گیا تھا جبکہ فائبرو بلاسٹس ٹیوبول خلیوں سے متاثر نہیں ہوئے تھے۔ ایک ساتھ، نتائج بتاتے ہیں کہ نلی خلیوں میں سیل سائیکل فائبروبلاسٹ کی موجودگی سے متاثر ہوتا ہے۔
فائبرو بلاسٹس میں COX2 کے اظہار کے لیے ایک اور شریک ثقافت کا اثر دیکھا گیا۔ فائبرو بلاسٹس کے لیے ٹیوبول سیلز کی موجودگی واضح طور پر پروٹین ایکسپریشن کا باعث بنی (چوہے کے خلیوں میں مشاہدہ کیے گئے نتائج کی طرح [20])، جو کہ ان ٹیوبیل خلیوں کے لیے نظر نہیں آتا تھا جو ثقافت پر انحصار نہیں دکھاتے تھے۔ یہ اشارہ کرتا ہے کہ سوزش میں فبرو بلوسٹس کا کردارگردے کی بیماریوںمونو کلچر میں فائبروبلاسٹ کا استعمال کرتے ہوئے مطالعے سے کم اندازہ لگایا گیا ہے۔ انٹرمیڈیٹ فلیمینٹ پروٹین ویمنٹن جزوی طور پر فبرو بلوسٹس میں ظاہر ہوتا ہے اور اپکلا خلیوں میں اپکلا سے mesenchymal منتقلی (EMT) کے دوران تیزی سے ظاہر ہوتا ہے [10]۔ اگرچہ یہ دکھایا گیا ہے کہ طویل عرصے تک OTA کی نمائش ٹیوبول خلیوں میں کولیجن III یا فائبرونیکٹین کے بہتر اظہار کا باعث بن سکتی ہے [7]، موجودہ مطالعے میں ٹیوبیل خلیوں میں EMT کی نشاندہی کرنے والے پروٹین ویمنٹن کا اظہار OTA کی نمائش کے بعد بھی کم تھا، آزاد۔ ثقافت کے حالات. اس کے علاوہ، fibronectin mRNA اور پروٹین کا اظہار کم تھا اور بڑھا نہیں تھا۔ مزید برآں، فبرو بلوسٹس میں، کوئی بدلا ہوا اظہار ظاہر نہیں کیا گیا تاکہ یہ نتائج OTA کے ذریعے حوصلہ افزائی شدہ EMT کے حق میں بحث نہ کریں، جیسا کہ دوسروں نے دکھایا ہے [31]۔
CISTANCHE کڈنی/رینل فنکشن کو بہتر کرے گا۔
مزید جانچ کرنے کے لیے کہ آیا شریک ثقافت OTA کے ذریعے پیدا ہونے والے تناؤ کے سیلولر جواب کو متاثر کر سکتی ہے، ہم نے apoptosis-necrosis، کینسر کی نشوونما اور توانائی کے تحول سے متعلق کچھ مثالی طور پر منتخب کردہ RNAs کے اظہار کا تعین کیا۔ لمبے نان کوڈنگ RNAs بہت سے سیلولر ریگولیٹری عملوں اور ان کے پٹری سے اترنے، اور رینل فبروسس یا کینسر میں بھی اہم کردار ادا کرتے ہیں [32]۔ WISP1-AS1 ایک طویل نان کوڈنگ آر این اے ہے جو OTA کے ذریعہ تیار کیا جاتا ہے اور گردوں کے ٹیومر کے خلیوں میں ظاہر ہوتا ہے [24]۔ ہم نے OTA کے ذریعہ اس کی اپ گریجشن کو دونوں سیل اقسام میں پایا اور شریک ثقافت نے اپ گریجشن کو بڑھایا۔ یہ WISP1-AS1 کے اثر کو apoptosis-necrosis کے توازن اور ممکنہ طور پر ٹیومر کی تشکیل پر بڑھانے کی اجازت دیتا ہے۔ شریک ثقافت میں مشاہدہ کردہ بہتر شدہ LDH ریلیز کی کم از کم جزوی طور پر WISP1-AS1 کے بہتر مواد سے وضاحت کی جا سکتی ہے، جسے OTA-حوصلہ افزائی نیکروسس [24] کے لیے ضروری دکھایا گیا تھا۔
WISP1-AS1میٹابولزم میں بھی کردار ادا کرنے کا شبہ تھا جس میں مائٹوکون ڈریا [24] بھی شامل ہے۔ گیسٹرک اپیتھیلیم خلیوں میں، او ٹی اے کو مائٹوکونڈریل dysfunction [33] کا سبب دکھایا گیا تھا۔ کے لیےگردہخلیات، اس بارے میں متنازعہ نتائج ہیں کہ آیا او ٹی اے کی نمائش کا مائٹوکونڈریل صلاحیت پر اثر ہے یا نہیں [21,24]۔ مائٹوکونڈریل کی کم صلاحیت خراب مائٹوکونڈریا کا نتیجہ ہو سکتی ہے یا مائٹوکونڈریل نقصان کو آگے بڑھا سکتی ہے۔ مائٹوکونڈریل پروٹینز کا کم اظہار عکس بندی کی خرابی کا باعث بن سکتا ہے یا اس کے بعد مائٹوکونڈریل صلاحیت تبدیل ہو سکتی ہے۔ خراب مائٹوکونڈریل فنکشن سیل کو توانائی کی فراہمی کو یقینی بنانے کے لیے متبادل راستے استعمال کرنے پر مجبور کرتا ہے۔ نامناسب مائٹوکونڈریل شراکت کے تحت توانائی کی فراہمی کو گلائکولیسس کے بڑھتے ہوئے استعمال سے برقرار رکھا جا سکتا ہے جس کی وجہ سے لییکٹیٹ کی پیداوار میں اضافہ ہوتا ہے۔ تاہم، HEK293 خلیوں میں، ایک انسانی براننگردہسیل لائن میں، یہ پایا گیا کہ OTA کی وجہ سے گلائکولائسز میں کمی واقع ہوئی اور گلوٹامین سے لییکٹیٹ کی پیداوار کی وجہ سے لییکٹیٹ کی بڑھتی ہوئی مقدار کا انحصار lncRNA WISP1-AS1 [24] کے اظہار پر تھا۔ اس کے برعکس، گیسٹرک اپیتھیلیا کے خلیوں میں، یہ دکھایا جا سکتا ہے کہ او ٹی اے کی نمائش گلوکوز میٹابولزم کو گلائکولیسس اور کم ٹرائی کاربوکسی ایسڈ سائیکل سرگرمی کی طرف دوبارہ پروگرام کرنے کا باعث بنتی ہے [34]۔ ہم یہاں دکھا سکتے ہیں کہ (1) او ٹی اے دو نمائندہ منتخب مائٹوکونڈریل پروٹینوں کے کم ایم آر این اے اظہار کا باعث بنتا ہے، جو مائٹوکونڈریل پروٹین کی ترکیب (MRPS16) اور توانائی کی پیداوار (NDUFB10) میں کردار ادا کرتے ہیں اور (2) کہ گلائکوجن ہینڈلنگ انزائمز کو منظم کیا گیا تھا۔ اس طرح کہ بڑھے ہوئے گلوکوز کو متحرک کیا جا سکتا ہے (GYS1 نیچے اور PYGM اوپر)۔ مزید برآں، ایسا لگتا ہے کہ ایک اعلی GLUT1 نقل و حمل کی صلاحیت کی حوصلہ افزائی کی گئی ہے۔ تاہم، یہ OTA کی حوصلہ افزائی کی تبدیلی ثقافت کے حالات سے تقریبا آزاد تھے.
آخر میں، ہم نے دکھایا ہے کہ شریک ثقافت کے حالات میں، خلیات کا رد عمل مونو کلچر میں مشاہدہ کیے جانے والے رد عمل سے مختلف ہو سکتا ہے، حالانکہ یہاں زیر مطالعہ تمام پیرامیٹرز ثقافت پر منحصر نہیں تھے۔ تاہم، یہاں پیش کردہ نتائج کی بنیاد پر، اگر ممکن ہو تو شریک ثقافت کے استعمال کو ترجیح دی جانی چاہیے، اس طرح جب صرف ایک خلیے کی قسم کا مطالعہ کیا جاتا ہے تو ان اثرات کی نگرانی کرنے کے امکان سے گریز کیا جاتا ہے۔ یہ سوال باقی ہے کہ خلیے ایک دوسرے کے درمیان کیسے بات چیت کرتے ہیں۔ چوہوں کے شریک کلچر ماڈل کے مطالعے سے COX2-انحصار میکانزم کا انکشاف ہوا [20] اور چوہوں میں، ریٹینوک ایسڈ سیلولر کراس ٹاک میں حصہ لیتا ہے۔گردہخلیات [35]۔ مزید برآں، سوال باقی ہے، اگر، کیوں اور کیسے OTA سیلولر انرجی میٹابولزم اور اس میں مائٹوکونڈریا کے کردار میں مداخلت کرتا ہے۔
ایل ڈی ایچ اور کیسپیس-3 سرگرمیوں اور پروٹین کے مواد کا تعینlysis کے لیے، خلیات کو برف کے ٹھنڈے PBS بفر میں دو بار دھویا گیا، MOPSTriton بفر (20 mM 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid، pH 7.4، 0 میں جمع کیا گیا اور لیس کیا گیا۔ 1 فیصد Triton X100)۔ سیل لیسٹس میں پروٹین کے مواد کا تعین بائینچونیک ایسڈ [36,37] کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ necrosis کے لئے ایک پیمائش کے طور پر میڈیا یا سیل lysates میں LDH سرگرمی کا تعین برگمیئر [38] کے مطابق کیا گیا تھا جیسا کہ [20] میں تفصیل سے بیان کیا گیا ہے۔ کیسپیس-3 سرگرمی کو اپوپٹوس کی پیمائش کے طور پر فلورجینک کیسپیس-3 سبسٹریٹ (DEVD-AFC) کا استعمال کرتے ہوئے طے کیا گیا جیسا کہ [39] میں بیان کیا گیا ہے۔ مختصراً، 60 µL سیل لیسیٹ 65 µL رد عمل بفر (20 mmol/L piperazine-1,4-bis(2ethanesulfonic acid (PIPES), 4 mmol/L EDTA، 0.2 فیصد {{26} [(3-cholaminopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfate (CHAPS), 10 mmol/L dithiotreitol (DTT), pH 7.4) جس میں 42 µmol/L DEVD-AFC (Aspglu-val-asp{{ 37 ◦C پر 36}}امینو-4-trifluoromethylcoumarin، end-concentration)۔ کلیویڈ پروڈکٹ (AFC) کا فلوروسینس 400 nm اتیجیت اور 505 nm اخراج پر ماپا گیا۔ کلیویڈ AFC کو ایک معلوم کیلیبریشن کا استعمال کرتے ہوئے منحنی خطوط طے کیا گیا تھا۔ ارتکاز
RT-PCR کل رائبونیوکلک ایسڈ (آر این اے) کی تنہائی کو ٹرائزول ریجنٹ (لائف ٹیکنالوجیز، ڈرمسٹڈٹ، جرمنی) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔ خلیوں کو دھویا گیا اور اس کے بعد ٹرائزول ری ایجنٹ کے ساتھ لیس کیا گیا اور ایک ری ایکشن ٹیوب میں منتقل کیا گیا۔ کلوروفارم اور سینٹرفیوگریشن (12,000× g) کے اضافے کے بعد، اوپری فیز کو اکٹھا کیا گیا اور آئس کولڈ آئسوپروپینول کے ساتھ ملایا گیا۔ سینٹرفیوگریشن (12,000× g) کے بعد سپرنٹنٹ کو ہٹا دیا گیا اور گولی کو 75 فیصد ایتھنول کے ساتھ دو بار دھویا گیا اور آخر کار پانی میں حل کر دیا گیا۔ ان کی ہدایات کے مطابق انویٹروجن (تھرمو فشر سائنٹیفک، والتھم، ایم اے، یو ایس اے) کی کمرشل کٹ کا استعمال کرتے ہوئے ریورس ٹرانسکرپشن کی گئی۔ ریئل ٹائم پی سی آر ایس وائی بی آر گرین ریجنٹ (انویٹروجن) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا تھا۔ پرائمر مائکرو سنتھ اے جی، بالگاچ، سوئٹزرلینڈ کے ذریعہ ترکیب کیے گئے تھے۔ پرائمر کی ترتیب جدول 1 میں دکھائی گئی ہے۔ EEF2 اور RPS17 کے اظہار کو حوالہ جات کے طور پر استعمال کرتے ہوئے 2∆∆Ct طریقہ سے جین ایکسپریشن کی فولڈ تبدیلی کا حساب لگایا گیا۔ ان دو جینوں کا اظہار آر این اے کی ترتیب کے اعداد و شمار میں کم تبدیل شدہ (اگر بالکل بھی) نکلا جب OTA کا علاج غیر علاج شدہ HK2 خلیات (غیر شائع شدہ نتائج) سے کیا جاتا ہے۔
مغربی دھبے sodiumdodecylsulfate-polyacrylamide جیل الیکٹروفورسس (SDS-PAGE) کے ذریعہ پروٹین کی علیحدگی کے بعد، پروٹین کو نائٹروسیلوز جھلی پر منتقل کیا گیا۔ اس کے بعد، TRIS-buffered saline (3 mM TRIS بیس، 140 mM NaCl، 0.17 mM Tris -HCl، pH 7.4) 0.1 فیصد Tween20 پر مشتمل ہے۔ TRIS نمکین پلس 5 فیصد بوائین سیرم البومین میں پتلی پہلی اینٹی باڈیز (TRIS-BSA، dilutions کے لیے جدول 2 دیکھیں) کو شامل کیا گیا اور جھلیوں کو راتوں رات انکیوبیٹ کیا گیا۔ دھونے کے بعد، TRIS-BSA میں فلوروسینس کے ساتھ مل کر سیکنڈری اینٹی باڈیز کو 90 منٹ کے لیے شامل کیا گیا۔ LICOR کا پتہ لگانے کے نظام کا استعمال کرتے ہوئے دوسری اینٹی باڈیز کی فلوروسینس ریکارڈ کی گئی۔
CISTANCHE گردے/ گردوں کے درد کو بہتر کرے گا۔
