RNA M6 A ریڈر YTHDF2 NK سیل اینٹی ٹیومر اور اینٹی وائرل امیونٹی کو کنٹرول کرتا ہے حصہ 3

YTHDF2 IL–15–ثالثی NK سیل کی بقا، پھیلاؤ، اور اثر کرنے والے افعال کے لیے درکار ہے۔

IL-15 ان میں سے ایک ہے، اگر NK خلیوں کے pleiotropic افعال کے لیے سب سے اہم سائٹوکائن نہیں ہے۔ ہم اور دوسروں نے پہلے دریافت کیا تھا کہ IL-15 NK سیل ہومیوسٹاسس، بقا، اور اثر کرنے والے افعال کو منظم کرنے میں کلیدی کردار ادا کرتا ہے (Becknell and Caligiuri, 2005; Carsonet al., 1997; Carson et al., 1994; Wang et al., 2019b؛ Yu et al., 2013)۔

خلیات کی Pleiotropy مختلف ماحول میں مختلف افعال انجام دینے کی ان کی صلاحیت سے مراد ہے۔ سیل پیلیوٹروپی کا استثنیٰ سے گہرا تعلق ہے کیونکہ مدافعتی نظام میں بہت سے خلیے مختلف قسم کے مختلف کردار ادا کر سکتے ہیں۔

مدافعتی نظام میں، T خلیات ایک بہت ہی اہم قسم کے خلیات ہیں۔ وہ پیتھوجینز کو پہچانتے اور ان پر حملہ کرتے ہیں، جبکہ دوسرے مدافعتی خلیوں کی سرگرمی کو بھی منظم کرتے ہیں۔ T خلیات کی pleiotropy بہت اہم ہے کیونکہ جب مدافعتی نظام کو کسی نئے روگجن کا سامنا ہوتا ہے تو T خلیات کو مؤثر طریقے سے جواب دینے کے لیے مختصر مدت میں مختلف کردار ادا کرنے کی ضرورت ہوتی ہے۔ مثال کے طور پر، جب مدافعتی نظام کو بیکٹیریل انفیکشن کا سامنا ہوتا ہے، تو T خلیات کو بیکٹیریا کو مارنے کا کردار ادا کرنے کی ضرورت ہوتی ہے، اور جب مدافعتی نظام کو وائرل انفیکشن کا سامنا ہوتا ہے، تو T خلیات کو دوسرے مدافعتی خلیوں کو منظم کرنے کا کردار ادا کرنے کی ضرورت ہوتی ہے۔

مزید برآں، مدافعتی نظام میں، میکروفیجز کہلانے والے خلیوں کی ایک کلاس کے بھی پیلیوٹروپک اثرات ہوتے ہیں۔ وہ phagocytose کر سکتے ہیں اور غیر ملکی پیتھوجینز کو توڑ سکتے ہیں، اور پیتھوجینز پر حملہ کرنے کے لیے دوسرے مدافعتی خلیوں کو بھی چالو کر سکتے ہیں۔ میکروفیجز کی پیلیوٹروپی اہم ہے کیونکہ انہیں مختلف ماحول میں مختلف کردار ادا کرنے کی ضرورت ہے۔ مثال کے طور پر، وائرل انفیکشن میں، میکروفیجز کو وائرس سے لڑنے کے لیے کچھ مادوں کو خارج کرنے کی ضرورت ہوتی ہے، جب کہ بیکٹیریل انفیکشن میں، میکروفیجز کو جراثیم کو صاف کرنے کے لیے بیکٹیریا کو گھیرنے اور ہضم کرنے کی ضرورت ہوتی ہے۔

خلاصہ یہ کہ سیلولر پیلیوٹروپی اور قوت مدافعت کے درمیان گہرا تعلق ہے۔ Pleiotropic خلیات مختلف پیتھوجینز سے متاثرہ ماحول میں مختلف کردار ادا کر سکتے ہیں، اس طرح مدافعتی نظام کی ردعمل کرنے کی صلاحیت کو بڑھاتے ہیں اور مختلف پیتھوجینز کے خلاف جسم کی قوت مدافعت کو بہتر بناتے ہیں۔ اس لیے ہمیں خلیات کی پیلیوٹروپی پر توجہ دینی چاہیے اور انسانی صحت کو برقرار رکھنے کے لیے قوت مدافعت کی کاشت کو بھی مضبوط کرنا چاہیے۔ یہ دیکھا جا سکتا ہے کہ ہمیں یادداشت کو بہتر بنانے کی ضرورت ہے، اور Cistanche deserticola نمایاں طور پر یادداشت کو بہتر بنا سکتا ہے، کیونکہ Cistanche deserticola نیورو ٹرانسمیٹر کے توازن کو بھی کنٹرول کر سکتا ہے، جیسے کہ acetylcholine کی سطح میں اضافہ اور ترقی کے عوامل۔ یہ مادے یادداشت اور سیکھنے کے لیے بہت اہم ہیں۔ اس کے علاوہ، Cistanche deserticola خون کے بہاؤ کو بھی بہتر بنا سکتا ہے اور آکسیجن کی ترسیل کو فروغ دے سکتا ہے، جو اس بات کو یقینی بنا سکتا ہے کہ دماغ کو کافی غذائی اجزاء اور توانائی ملے، اس طرح دماغی قوت اور برداشت کو بہتر بنایا جا سکتا ہے۔

اپنی یادداشت کو بہتر بنانے کے طریقے جانیں پر کلک کریں۔

موجودہ مطالعہ میں، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ NK خلیات میں IL-15 upregulatedmRNA اور YTHDF2 کی پروٹین کی سطح (تصویر 6 A؛ اور تصویر 1، D–F)۔ لہذا، ہم نے قیاس کیا کہ YTHDF2 IL–15 – ثالثی بقا اور NK خلیوں کے اثر کرنے والے افعال کے لیے درکار ہے۔

ہم نے سب سے پہلے IL-15 سگنلنگ کے ممکنہ ٹرانسکرپشن عوامل کی نشاندہی کرنے کی کوشش کی جو براہ راست YTHDF2expression کو منظم کرتے ہیں۔ ہم نے یونیورسٹی آف کیلیفورنیا، سانتا کروز، جینوم براؤزر ڈیٹا بیس (https://genome.ucsc.edu) کا استعمال کرتے ہوئے ڈی این اے عناصر کے انسائیکلوپیڈیا کا تجزیہ کیا، جو JASPAR (http://jaspar.genereg) کے ساتھ مل کر پورے جینوم میں بائنڈنگ سائٹس کی پیشین گوئیاں فراہم کرتا ہے۔ نیٹ)۔

ہم نے پایا کہ STAT5، جو NK سیلز میں IL-15 کا ایک کلیدی بہاو عنصر ہے، Ythdf2 کی ٹرانسکرپشن اسٹارٹ سائٹ (TSS) کے 2 kb کے اندر چار بائنڈنگ سائٹس رکھتا ہے، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ IL-15 مثبت طور پر ہو سکتا ہے۔ STAT5 کے ذریعے ماؤس NK سیلز میں Ythdf2 ٹرانسکرپشن کو منظم کریں۔

STAT5 inhibitor STAT5-IN-1 (Müller et al., 2008) کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے ظاہر کیا کہ STAT5 کی روک تھام کے نتیجے میں mRNA اور پروٹین کی سطح دونوں میں Ythdf2 کی کمی واقع ہوئی ہے مورائن NK سیلز (تصویر S4، A) اور B) مزید تصدیق کرنے کے لیے کہ YTHDF2 STAT5 کے ذریعے ریگولیٹ کیا جانے والا ایک بہاو والا عنصر ہے، ہم نے Stat5fl/fl Ncr1-iCre چوہوں کا استعمال کیا (اس کے بعد اسے Stat5ΔNK چوہوں کے نام سے جانا جاتا ہے)، جہاں STAT5 کو خاص طور پر ماؤس NK سیلز کو حذف کر دیا جاتا ہے (Wiedemann et al.، 2020)۔

ہم نے IL-15 کے ساتھ Stat5WT اور Stat5ΔNK چوہوں کے splenicNK خلیوں کا علاج کیا۔ ہم نے پایا کہ YTHDF2 Stat5ΔNKmice سے NK خلیوں میں Stat5WT چوہوں کے NK خلیوں کے مقابلے میں RNA اور پروٹین کی سطح دونوں پر کافی حد تک کمی آئی ہے (تصویر 6، B اور C؛ اور تصویر S4، C اورD)۔

Luciferase رپورٹر پرکھ سے پتہ چلتا ہے کہ STAT5a اور STAT5b دونوں نے براہ راست Ythdf2 جین ٹرانسکرپشن کو چالو کیا (تصویر 6، D، اور E)۔ Chromatin immunoprecipitation (ChIP)-qPCR کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ STAT5 میں عام IgG کنٹرول پر چار سائٹس پر نمایاں افزودگی ہے، جو ماؤس NKcells (تصویر 6 F) میں براہ راست پابند ہونے کی نشاندہی کرتی ہے۔ ایک ساتھ، ہمارے نتائج یہ ظاہر کرتے ہیں کہ YTHDF2expression NK سیلز میں سگنلنگ IL-15 کے STAT5 بہاو کے ذریعے ریگولیٹ کیا جاتا ہے۔

پھر ہم نے سوچا کہ آیا Ythdf2-کی کمی والے NK سیلز IL-15 کے جواب میں خراب تھے۔ ہم نے Ythdf2ΔNK چوہوں اور Ythdf2WT چوہوں سے splenic NK خلیات کو الگ تھلگ کیا اور IL-15 کی موجودگی میں تھیمن وٹرو کو کلچر کیا۔ ہم نے پایا کہ Ythdf2ΔNK چوہوں میں Ythdf2WT چوہوں (تصویر 6 جی) کے مقابلے NK سیل کی نشوونما میں نمایاں کمی واقع ہوئی ہے۔ سیل ٹریس وائلٹ (سی ٹی وی) لیبلنگ نے یہ ظاہر کیا کہ NK خلیوں کے پھیلاؤ کو Ythdf2deficiency (تصویر 6 H) سے نقصان پہنچا ہے۔

 سیل سائیکل کی تقسیم کے تجزیے سے پتہ چلتا ہے کہ Ythdf2ΔNK چوہوں سے G0/G1 مرحلے میں NK سیلز کا نمایاں طور پر اضافہ ہوا ہے لیکن S مرحلے میں Ythdf2ΔNK چوہوں سے NKcells کا نمایاں طور پر کم ہوا حصہ (تصویر 6 I)، تجویز کرتا ہے کہ Ythdf2 کی کمی کے نتائج NK خلیوں میں G0/G1 مرحلے کی گرفتاری میں۔

اس کے علاوہ، Ythdf2WT چوہوں (تصویر 6 J) کے مقابلے میں Ythdf2ΔNK چوہوں سے apoptotic (annexin V+Sytox-Blue+/−) NK خلیات میں دو سے تین گنا اضافہ ہوا، جو کہ نقصان کے بعد NK خلیات کی خراب بقا کی نشاندہی کرتا ہے۔ Ythdf2. یہ نتائج بتاتے ہیں کہ YTHDF2 وٹرو میں IL-15 کے لیے NKcells کی ردعمل کو منظم کرتا ہے۔ چونکہ IL-15 کا ایک مستحکم حالت میں vivo میں ناقص ترجمہ اور خفیہ ہوتا ہے (Corbel et al., 1996; Fehniger et al., 2001)، یہ جاننے کے لیے کہ آیا Ythdf2-کی کمی والے NK سیل ان کے ردعمل میں خراب ہیں Vivo میں IL-15 تک، ہم نے IL-15 سے چوہوں کا علاج کیا۔

ہم نے پایا کہ Ythdf2-کی کمی بمقابلہ WT NK خلیات نے سیل کے پھیلاؤ کو نمایاں طور پر کم کیا اور سیل اپوپٹوسس میں اضافہ دکھایا جب چوہوں کا علاج IL-15 (تصویر 6 K؛ اور Fig. S4, E–J) سے کیا گیا تھا۔ یہ ڈیٹا تجویز کرتا ہے کہ YTHDF2 IL-15 کے لیے NK سیلز کی ردعمل کو منظم کرتا ہے، خاص طور پر IL-15 کے اعلی درجے کے ساتھ کچھ حالات میں۔ ہم نے یہ بھی پایا کہ IL-15 (تصویر 6، L–N) کے جواب میں Ythdf2ΔNK NK خلیوں کے مقابلے IFN-، گرینزائم B، اور پرفورین کے mRNA اور پروٹین کی سطح میں نمایاں طور پر کمی واقع ہوئی ہے۔ وٹرو میں IL-15–ثالثی NK سیل انفیکٹر فنکشنز میں بھی حصہ ڈالتا ہے۔

اجتماعی طور پر، ہمارا ڈیٹا یہ ظاہر کرتا ہے کہ YTHDF2 IL–15–ثالثی والے NK سیل کی بقا، پھیلاؤ، اور مؤثر افعال کے لیے درکار ہے۔ اگلا، ہم نے بہاو کے طریقہ کار کی چھان بین کی جس کے ذریعے YTHDF2 IL–15–ثالثی NK کی بقا، پھیلاؤ، اور اثر کرنے والے فنکشن کو منظم کرتا ہے۔ ہم نے پایا کہ Ythdf2ΔNKmice اور Ythdf2WT چوہوں کے NK خلیوں میں IL-15 ریسیپٹرز CD122 (IL-15R ) اور CD132 (IL-15R c; Fig. S4 K) کی سطح ایک جیسی تھی۔ IL-15 سگنلنگ کی ثالثی کم از کم تین نیچے کی طرف اشارہ کرنے والے راستوں سے ہوتی ہے جو این کے سیلز میں ہوتی ہے: Ras–Raf–MEK–ERK، PI3K–AKT–mTOR، اور JAK1/3–STAT3/5 (Mishra et al.، 2014)۔

یہ جانچنے کے لیے کہ NK سیلز میں YTHDF2 کے ذریعے کون سا سگنلنگ پاتھ ریگولیٹ ہوتا ہے، ہم نے IL-15 کے ساتھ محرک کے بعد Ythdf2ΔNK چوہوں یا Ythdf2WT چوہوں سے ERK، AKT، S6، STAT3، اور STAT5 inNK سیلز کے فاسفوریلیشن لیولز کی جانچ کی۔

نتائج سے ظاہر ہوا کہ Ythdf2 کی کمی نے IL-15محرک (تصویر S4، L اور M) پر ERK، AKT، S6، اور STAT3 فاسفوریلیشن کو متاثر نہیں کیا لیکن STAT5 ایکٹیویشن کو نمایاں طور پر روکا، جیسا کہ STAT5{ Ythdf5 میں فاسفوریلیشن کی سطح میں کمی سے ظاہر ہوتا ہے۔ 7}}Ythdf2WT چوہوں (تصویر 6 O) کے NK سیلز کے مقابلے میں NK سیلز کی کمی، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ چالو NK سیلز میں IL-15/STAT5 سگنلنگ کے لیے YTHDF2 کی ضرورت ہے۔

چونکہ ہم نے دکھایا کہ IL کا فاسفوریلیٹڈ STAT5 بہاو-15 Ythdf2 (تصویر 6، D–F) کے پروموٹر سے منسلک ہے، اور یہاں ہم نے یہ ظاہر کیا کہ YTHDF2 زیادہ سے زیادہ STAT5 فاسفوریلیشن کے لیے ضروری ہے، ہمارا ڈیٹا STAT5–YTHDF2 مثبت فیڈ بیک ڈاون اسٹریم تجویز کرتا ہے۔ IL-15 جو کہ NK خلیات کی بقا، پھیلاؤ، اور اثر کرنے والے افعال کو کنٹرول کر سکتا ہے۔

ٹرانسکرپٹوم وسیع تجزیہ NK سیلوں میں Tardbp کو YTHDF2 ہدف کے طور پر شناخت کرتا ہے۔

مالیکیولر میکانزم کو حل کرنے کے لیے جس کے ذریعے YTHDF2 NK خلیوں کو منظم کرتا ہے، ہم نے پہلے RNA کی ترتیب (seq) inIL-2–توسیع شدہ Ythdf2WT اور Ythdf2ΔNK NK خلیات کو انجام دیا۔ NK خلیات میں Ythdf2 کو حذف کرنے کے نتیجے میں 617 مختلف جینز ظاہر ہوئے، جن میں 252 اپریگولیٹڈ جینز اور 365 نیچے ریگولیٹڈ جینز (تصویر S5 A) شامل ہیں۔

جین آنٹولوجی (GO) کے تجزیے سے ظاہر ہوا ہے کہ امتیازی طور پر ظاہر کیے گئے جین سیل سائیکل، سیل ڈویژن، اور سیل ڈویژن سے متعلقہ عمل میں نمایاں طور پر افزودہ ہوئے ہیں، بشمول مائٹوٹک سائیٹوکینیسیس، کروموسوم سیگریگیشن، سپنڈل، نیوکلیوزوم، مڈ باڈی، اور کروموسوم (تصویر 7)۔ اے)۔

جین سیٹ کی افزودگی تجزیہ (GSEA) نے Ythdf2ΔNKNK خلیات (تصویر S5 B) میں E2F اہداف، G2/Mcheckpoint، اور mitotic سپنڈل ہال مارک جین سیٹوں کی نمایاں افزودگی کا مظاہرہ کیا۔ سیل سائیکل اور سیل ڈویژن سے متعلقہ جین، بشمول Aurka، Aurkb، Cdc20، Cdc25b، Cdc25c، Cdk1، E2f2، اور Plk1 (Bertoli et al.، 2013)، Ythdf2ΔFNK7 mice (Bertoli et al.، 2013) سے NK خلیوں میں نمایاں طور پر کم ہوئے )۔

سپنڈل اور کروموسوم سیگریگیشن جینز جیسے Anln, Aspm, Birc5, Bublb, Cenpe, Esco2, Ska1, Ska3, andTpx2 (Gorbsky, 2015) کو بھی Ythdf2ΔNK چوہوں سے NKcells میں نمایاں طور پر کم کیا گیا تھا۔

اس کے علاوہ، سیل کی بقا کے جین، بشمول Birc5 (Niu et al.، 2010)، Septin4 (Larisch et al.، 2000)، اور Rffl (Yanget al.، 2007)، Ythdf2ΔNK چوہوں سے NK خلیوں میں نمایاں طور پر کمی واقع ہوئی تھی۔ 7 ڈی)۔ NK سیل انفیکٹر فنکشن جین، بشمول Klrk1، Ncr1، CD226، اور Gzma (Bezman et al.، 2012)، Ythdf2ΔNK چوہوں (تصویر 7 D) سے NK خلیات میں بھی نمایاں طور پر کم ہو گئے تھے۔

یہ اعداد و شمار NK سیل کے پھیلاؤ، بقا، اور انفیکٹر کے افعال کو منظم کرنے والے YTHDF2in کے ہمارے خصوصی کرداروں کی حمایت کرتے ہیں۔ پھر ہم نے Ythdf2WT اور Ythdf2ΔNK چوہوں سے IL-2– توسیع شدہ NK سیلز میں m6A-seq انجام دیا۔ پرنسپل اجزاء کے تجزیے سے ظاہر ہوا کہ ہر جین ٹائپ کی تین حیاتیاتی نقلیں ایک ساتھ کلسٹرڈ ہیں (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا)، جو m6A-seq کے نمونوں کی اچھی تکرار کی تجویز کرتا ہے۔

motif enrichment (HOMER) کے تجزیے کی Hypergeometric optimization m6A اتفاق رائے (GGAC) کی نشاندہی کرتی ہے، جو m6A-موڈیفائیڈ ٹرانسکرپٹس (تصویر 7 E) کی کامیاب افزودگی کی نشاندہی کرتی ہے۔ m6A ترمیمات بنیادی طور پر پروٹین کوڈنگ ٹرانسکرپٹس میں موجود تھیں، اور چوٹیوں کو 59 غیر ترجمہ شدہ خطوں (UTR) اور 39UTR میں، خاص طور پر شروع اور سٹاپ کوڈنز (تصویر 7 F اور تصویر S5 C) کے ارد گرد افزودہ کیا گیا تھا۔

m6A چوٹیوں کے ساتھ جینوں کے GOenrichment کے تجزیے سے یہ بات سامنے آئی ہے کہ NK خلیات میں زیادہ ترm6A نشان زدہ نقلیں سیل سائیکل اور سیل کے پھیلاؤ (تصویر S5 D) میں شامل راستوں میں افزودہ تھیں۔

For more information:1950477648nn@gmail.com