دو سورگم بائی کلر لائنوں کے درمیان جین کے اظہار میں تغیر جو پیدائشی قوت مدافعت کے ردعمل میں مختلف ہے

خلاصہ:

مائیکروب سے وابستہ مالیکیولر پیٹرن (MAMPs) ٹریگرڈ امیونٹی (MTI) مائکروبیل کی شناخت کے لیے پودوں کے فطری مدافعتی ردعمل کا ایک اہم جز ہے۔ تاہم، MTI کے بارے میں ہمارا زیادہ تر علم ماڈل پلانٹس (یعنی Arabidopsis thaliana) سے آتا ہے جس میں فصل کے پودوں کا استعمال کرتے ہوئے نسبتاً کم کام کیا جاتا ہے۔ اس کام میں، ہم نے MAMP-triggered oxidative burst (ROS) اور دو Sorghum bicolor genotypes، BTx623 اور SC155-14E میں نقلی ردعمل کا مطالعہ کیا۔ SC155-14E ایک لائن ہے جو اعلی اینتھراکنوز مزاحمت کو ظاہر کرتی ہے اور BTx623 لائن اینتھراکنوز کے لیے حساس ہے۔ ہمارے نتائج نے دونوں لائنوں کے درمیان فلیجیلن (flg22) یا chitin elecitation کے جواب میں جین کے اظہار اور ROS میں واضح فرق کا انکشاف کیا۔ جب کہ ہر MAMP اور ہر لائن میں نقل کا ردعمل منفرد تھا، کافی حد تک اوورلیپ تھا، اور ہم جوارم MAMP ٹرانسکرپشن ردعمل سے وابستہ جینوں کے بنیادی سیٹ کی وضاحت کرنے کے قابل تھے۔ GO ٹرم اور KEGG پاتھ وے کی افزودگی کے تجزیے نے MAMP سے علاج شدہ SC155-14E نمونوں میں BTx623 کے مقابلے میں زیادہ استثنیٰ اور پیتھوجن مزاحمت سے متعلق DEGs دریافت کیے ہیں۔ نتائج مستقبل کے مطالعے کے لیے جوار میں فطری قوت مدافعت کے راستوں کی تحقیقات کے لیے ایک بنیاد فراہم کرتے ہیں، بشمول بیماریوں کے خلاف مزاحمت کو بڑھانے کی کوششیں۔

ایک خریدنے کے لیے کلک کریں۔بہتر مدافعتی مصنوعات

    For more information:1950477648nn@gmail.com

مطلوبہ الفاظ:

جوار کا دو رنگ؛ ROS; فطری قوت مدافعت؛ MAMPs؛ آر این اے سیک؛ جین اظہار

1. تعارف

پودوں کو قدرتی طور پر متعدد قسم کے دباؤ کا سامنا کرنا پڑتا ہے، بشمول متعدد بیکٹیریل، فنگل اور وائرل پیتھوجینز [1]۔ پودے پہلے سے بنائے گئے ڈھانچے اور کیمیکلز کا استعمال کرتے ہوئے پیتھوجینز سے خود کو بچاتے ہیں، اور مدافعتی نظام کے انفیکشن سے متاثرہ ردعمل۔ پودوں کا مدافعتی نظام ایک دو ٹائرڈ پرسیپشن سسٹم کو استعمال کرتا ہے جس میں ریسیپٹرز کی دو باہم جڑی ہوئی پرتیں ہیں۔

پہلے درجے کو سطحی لوکلائزڈ پیٹرن ریکگنیشن ریسیپٹرز (PRRs) کے ذریعے چالو کیا جاتا ہے، جو محفوظ ساختی شکلوں کی کھوج کے ذریعے حملہ آور پیتھوجین کو پہچان کر سیل کے باہر مالیکیولز کو محسوس کرتے ہیں، جسے Microbe-Associated Molecular Patterns (MAMPs) کہا جاتا ہے، جو ایک اعتدال پسند، لیکن وسیع، دفاعی ردعمل [2]۔ فلیجیلن، چٹن، لیپوپولیساکرائڈز، پیپٹائڈوگلائیکنز (PGNs)، اور ایلوگیشن فیکٹر Tu اچھی طرح سے زیر مطالعہ MAMPs [3–5] کی مثالیں ہیں۔ اس دفاعی ردعمل کو MAMPtrigged immunity (MTI) کہا جاتا ہے [6]۔ دفاع کا دوسرا درجہ جسے Efector-Triggered Immunity (ETI) کے نام سے جانا جاتا ہے، مخصوص پیتھوجین سے ماخوذ انفیکٹر پروٹینز کے جواب میں ہوتا ہے جو پودے کے ذریعے مزاحمتی پروٹین کے عمل سے پہچانا جاتا ہے، جس کے نتیجے میں ایک مضبوط، لیکن انتہائی مخصوص مدافعتی ردعمل ہوتا ہے۔ ای ٹی آئی کو اکثر مقامی سیل کی موت کی شمولیت سے پہچانا جا سکتا ہے جسے انتہائی حساس ردعمل (HR) کہا جاتا ہے [7]۔ ایم ٹی آئی اور ای ٹی آئی دونوں نظام پیتھوجینز کو محسوس کرتے ہیں اور متاثرہ سیل اور پڑوسی خلیوں میں اینٹی مائکروبیل ڈیفنس کو چالو کرکے جواب دیتے ہیں [3,8]۔ پودوں میں مدافعتی ریسیپٹرز بھی ہوتے ہیں جو انتہائی متغیر پیتھوجین اثر کرنے والوں کو پہچانتے ہیں، ان میں پروٹینز کی NBS-LRR کلاس شامل ہیں [9]۔

اس کے علاوہ، سیسٹیمیٹک ایکوائرڈ ریزسٹنس (SAR) ایک "پورے پلانٹ" کا مزاحمتی ردعمل ہے جو کہ روگزن کے پہلے مقامی نمائش کے بعد ہوتا ہے۔ SAR جینز کی ایک وسیع رینج (پیتھوجینس سے متعلق جینز) کی شمولیت سے وابستہ ہے، اور SAR کو فعال کرنے کے لیے endogenous salicylic acid (SA) کے جمع ہونے کی ضرورت ہوتی ہے [10]۔

بنیادی طور پر Arabidopsis کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ MTI مختلف قسم کے ردعمل کا سبب بن سکتا ہے جس میں رد عمل آکسیجن پرجاتیوں کی پیداوار (ROS)، رد عمل والی نائٹروجن پرجاتیوں کی پیداوار جیسے نائٹرک آکسائڈ (NO)، کالوز جمع، انٹرا سیلولر کیلشیم کی سطح، پلازما میں آئن فلوکس شامل ہیں۔ جھلی، کئی پودوں کے دفاع سے متعلق جینوں کے اظہار کی شمولیت یا جبر، پودوں کے خلیے کی دیوار میں ردوبدل، antimicrobial مرکبات کی شمولیت اور روگجنن سے متعلق (PR) پروٹین کی ترکیب [3,11]۔

اگرچہ ان میں سے کئی MTI ردعمل کو پودوں کے عمومی ردعمل سمجھا جا سکتا ہے، لیکن ان کی وسعت پودوں کے لیے مخصوص اور یہاں تک کہ کاشت کاری کے لیے مخصوص ہو سکتی ہے [12–17]۔ پلانٹ کے MTI ردعمل کی مقدار درست کرنے کے طریقے تیار کیے گئے ہیں۔ ان طریقوں میں ROS یا NO کی پیداوار کی پیمائش، mitogen-activated protein kinase phosphorylation، مخصوص MAMPinduced gene expression، seedling growth inhibition، lignin اور cell wall-band phenols، اور MAMP کی حوصلہ افزائی بیکٹیریل اور فنگل پیتھوجینز کے خلاف مزاحمت شامل ہیں۔

Sorghum bicolor (L.) Moench ایک کلیدی، عالمی اناج کی فصل ہے جسے مختلف رہائش گاہوں کے مطابق ڈھال لیا گیا ہے اور متنوع مقاصد کے لیے افزائش کی گئی ہے [21]۔ خوراک اور بایوماس کی پیداوار کے لیے ایک بڑی فصل کے طور پر دنیا بھر میں جوار کی کاشت میں خاطر خواہ اضافہ متوقع ہے [22]۔

جیسے جیسے جوار کی کاشت کے طریقوں اور جغرافیائی علاقوں میں اضافہ ہوتا ہے، یہ ناگزیر ہے کہ بیماری کا دباؤ بڑھے گا۔ جوار دیگر اناج کے درمیان اس کی غیر معمولی طور پر وسیع بیماریوں کی وجہ سے ممتاز ہے، جو اس کی پیداوار میں سب سے اہم رکاوٹوں میں سے ایک ہے۔ عالمی سطح پر، بڑے پیمانے پر پھپھوندی کی بیماریاں جوار کی سب سے تباہ کن بیماریاں ہیں جن کے نتیجے میں اناج کی مقدار اور معیار دونوں لحاظ سے پیداوار میں بہت زیادہ نقصان ہوتا ہے [23]۔ اینتھراکنوز جوار کے اناج کی پیداوار اور بائیو ماس کی پیداوار کو متاثر کرنے والی سب سے شدید کوکیی بیماریوں میں سے ایک ہے۔ اس روگجن کی وجہ سے پیداوار کا نقصان حساس کاشتوں میں 50 سے 70 فیصد ہو سکتا ہے [24,25]۔ پودوں نے روگزن کے حملے کے خلاف لڑنے کے لیے مختلف دفاعی حکمت عملی تیار کی ہے۔ سورغم میں، ان حکمت عملیوں میں PR پروٹینز کو چالو کرنا [26]، ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ کا جمع ہونا [27]، اور flavonoid phytoalexins [28] کی بایو سنتھیسز شامل ہیں۔ جوار کے مزاحمتی ردعمل کا مطالعہ کرنے، دفاعی مرکبات کی شناخت، اور اینتھراکنوز کے خلاف جسمانی رکاوٹوں کی نشاندہی کرنے کے لیے مختلف طریقے استعمال کیے گئے ہیں (جائزہ کے لیے حوالہ [29,30] دیکھیں)۔ جین ایکسپریشن اسٹڈیز کو پودوں میں امیدواروں کے مزاحمتی جینوں کی شناخت کرنے کے لیے وسیع پیمانے پر استعمال کیا گیا تھا جس کی بنیاد مزاحم اور حساس کاشتوں یا غیر انوکولیٹڈ اور پیتھوجین ٹیکہ والے پودوں کے درمیان امتیازی اظہار کی بنیاد پر کیا گیا تھا (مثال کے طور پر، حوالہ جات [31–37])۔ Wang et al.، [37] نے sorghum cultivar BTx623 کے C. subline-ola کے ردعمل کا مطالعہ کرنے کے لیے ٹرانسکرپٹومک تجزیہ کیا۔ انہوں نے اطلاع دی کہ فینیلپروپینائڈ میٹابولزم میں شامل جینز، اور ثانوی میٹابولائٹس کے بایو سنتھیسز کی شناخت غیر انوکولیڈ کنٹرول پلانٹس کی نسبت پیتھوجین کے انفیکشن کے ردعمل میں مختلف طور پر ظاہر کی گئی تھی۔

تاہم، یہ تجربات حساس کاشت BTx623 کے بیجوں کے ساتھ کیے گئے تھے۔ حساس اور مزاحم جوار کی کاشت میں جین کے اظہار کے ردعمل کا موازنہ کرنے کے لیے اضافی ٹرانسکرپٹومک اسٹڈیز قابل قدر ہوں گی۔ لہٰذا، جوار کی بنیادی بیماری کی مزاحمت کو کنٹرول کرنے والے جینیاتی فن تعمیر اور مقداری بیماری کے خلاف مزاحمت سے اس کے تعلق کو سمجھنا ضروری ہے۔

اس سمت میں ایک ابتدائی قدم کے طور پر، ہم نے حال ہی میں flg22 اور chitin elicitation کے ردعمل کے ساتھ ساتھ فنگل بیماری کے خلاف مزاحمت [38] کے لیے مختلف جوار کے جراثیم کے ایک سیٹ کی اسکریننگ کی۔ اس معاملے میں، ایم ٹی آئی کو ایم اے ایم پی ایلیٹیشن پر آر او ایس کی پیداوار کی پیمائش کرکے مقدار درست کردی گئی۔ اس پہلے کے مطالعے کے نتائج میں، جوار کے جین ٹائپس کی شناخت بھی تھی جس نے MAMP کے اخراج کے لیے مضبوط یا کمزور ردعمل ظاہر کیا۔

اگلی نسل کی ہائی تھرو پٹ ترتیب اور ٹرانسکرپٹوم کا مطالعہ پودوں میں فنگل انفیکشن کے ردعمل کو واضح کرنے اور میزبان ردعمل کے بارے میں سمجھ میں اضافہ کرنے میں مدد کر سکتا ہے۔ ٹرانسکرپٹوم کے تجزیے بڑے پیمانے پر پودوں کی فصلوں بشمول اناج کی فصلوں (مثلاً حوالہ جات [31–37]) میں فنگل انفیکشن کے بارے میں پودوں کے ردعمل کا مطالعہ کرنے کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔

تاہم، اناج کی فصلوں کے تقابلی ٹرانسکرپٹوم تجزیہ پر شائع شدہ ڈیٹا نے بنیادی طور پر مختلف پیتھوجینز کے ردعمل پر توجہ مرکوز کی ہے۔ سورغم میں، متعدد اشاعتوں میں مختلف پیتھوجینز کے ساتھ علاج کیے جانے والے پودوں کے ٹرانسکرپٹوم موازنہ پر توجہ مرکوز کی گئی، بشمول اینتھراکنوز [35,37]۔ کچھ پچھلی اشاعتوں نے تجویز کیا کہ MAMPs اور فنگل بیماری کے ردعمل کے درمیان کوئی خاص تعلق نہیں ہے۔ مثال کے طور پر، Zhang et al. [17] نے مکئی کی نقشہ سازی کی آبادی میں دو MAMPs flg22 اور chitin کے ردعمل کے درمیان ایک مضبوط ارتباط کی اطلاع دی لیکن کوکیی بیماری کے ردعمل سے کوئی مطابقت نہیں ہے۔ کمبال وغیرہ۔ [38] نے BTx623/SC155-14E آبادی سمیت دو جوارم RIL آبادیوں میں flg22-حوصلہ افزائی ROS رسپانس اسکورز اور ٹارگٹ لیف اسپاٹ ریزسٹنٹ اسکورز کے درمیان کم ارتباط کی بھی اطلاع دی۔ لہذا، اعداد و شمار کی کمی کو دیکھتے ہوئے، ہم نے محسوس کیا کہ MAMP کے علاج کے لیے جوار کے ردعمل کو نقلی طور پر پروفائل کرنا ضروری ہے۔

اس موجودہ رپورٹ میں، ہم MAMP ایلیٹیشن کے لیے عالمی نقلی ردعمل کی پیمائش کرکے اپنے پہلے کے تجزیے کو بڑھاتے ہیں۔ ہم نے سورگم جین ٹائپس BTx623 اور SC155-14E میں flg22 یا chitin ٹریٹمنٹ کے جواب میں ٹرانسکرپشنی تبدیلیوں کا سروے کرنے کے لیے Illumina پر مبنی RNA سیکوینسنگ تجزیہ کا استعمال کیا، جسے ہم نے پہلے بالترتیب کمزور اور مضبوط MTI جواب دہندگان کے طور پر نمایاں کیا تھا۔ BTx623 Sorghum bicolor genome reference line [22] اور SC155-14E ایک لائن ہے جو بلند اینتھراکنوز مزاحمت کو ظاہر کرتی ہے [39]۔ پاٹل وغیرہ۔ [39] نے اطلاع دی ہے کہ SC155-14E نے ٹیسٹ کیے گئے تمام ماحول میں اینتھراکنوز بیماری کے خلاف اعلی سطح کی مستحکم مزاحمت (تقریبا بیماری سے پاک) ظاہر کی ہے جبکہ BTx623 اس فنگل بیماری کے لیے حساس ہے۔ ہمارے RNA-seq تجزیہ نے BTx623 میں 5252 اور 8085 مختلف ظاہر شدہ جینز (DEGs) کی نشاندہی کی جن کا علاج flg22 اور chitin کے ساتھ کیا گیا، اور flg22 میں 3849 اور 5786 DEGs اور chitin کا ​​علاج SC155-14 کے مقابلے میں غیر متعلقہ کنٹرول، ان دو جین ٹائپز میں سے۔

مزید برآں، دو مختلف بائیو انفارمیٹک پائپ لائنوں کا استعمال کرتے ہوئے منتخب کردہ ڈی ای جیز کے مقابلے نے بہت ملتے جلتے نتائج دکھائے۔ امتیازی طور پر ظاہر کیے گئے جینز، جین آنٹولوجی (GO) افزودگی تجزیہ، اور KEGG پاتھ وے افزودگی کے تجزیے کے ایکسپریشن پروفائلز نے MTI سے متعلق جین کے اظہار میں واضح جین ٹائپ پر مبنی تغیر ظاہر کیا۔ GO ٹرم اور KEGG پاتھ وے افزودگی کے نتائج نے مزید استثنیٰ اور روگزنق مزاحمت سے متعلق DEGs (PR جینز، chitin کے لیے جینز کا ردعمل، سیلیسیلک ایسڈ کے لیے جینز کا ردعمل، تناؤ کے لیے جینز کا ردعمل، وغیرہ) کا انکشاف کیا ہے جو MAMP کے زیر علاج SC{{4} میں پیش کیے گئے ہیں۔ }ایم اے ایم پی سے علاج شدہ BTx623 سے متعلق ای نمونے۔

2. نتائج اور بحث

2.1 مختلف جوار کے پتوں میں آکسیڈیٹیو برسٹ کا تغیر

متنوع جوار کے جین ٹائپس کے MTI ردعمل کے ہمارے پچھلے تجزیے نے BTx623 اور SC155-14E [38] کے درمیان MAMP سے محرک آکسیڈیٹیو برسٹ میں نمایاں تبدیلی کا انکشاف کیا۔ مزید برآں، SC155-14E ایک لائن ہے جو اعلی اینتھراکنوز مزاحمت کو ظاہر کرتی ہے، جبکہ لائن BTx623 اینتھراکنوز کے لیے حساس ہے [39]۔ یہ ان وجوہات کی بناء پر تھا، کہ RNA-seq کا استعمال کرتے ہوئے موازنہ کے لیے ان دو جین ٹائپس کا انتخاب کیا گیا تھا۔

ROS کی ابتدائی پیمائش کے دوران، ہمیں ایک ہی پلانٹ کے اندر بھی اہم تغیرات ملا، جس کی وجہ سے ہمیں اس تغیر کے ماخذ کی زیادہ احتیاط سے تفتیش کرنا پڑی۔ خاص طور پر، ہم نے پتوں کے تین سیٹوں کا استعمال کرتے ہوئے ROS کی پیداوار کا تجربہ کیا، پندرہ دن پرانے BTx623 اور SC155-14E پودوں کے نیچے سے اوپر تک جا کر۔ پتوں کو #1، #2، اور #3 کے طور پر نشان زد کیا گیا تھا، نیچے سے اوپر جیسا کہ شکل 1A میں دکھایا گیا ہے۔ ROS پرکھ کے نتائج (شکل 1B) نے انکشاف کیا کہ: (1) ROS کی پیداوار کی سطح پرانے پتے (پتہ نمبر 1) میں کم تھی، جب کہ flg22 یا chitin کے جواب میں ROS کی پیداوار کی بلند ترین سطح سب سے کم عمر پتوں سے تھی ( پتی نمبر 3)۔ (2) MAMP سے علاج شدہ اور علاج نہ کیے جانے والے BTx623 2دونوں سب سے کم عمر پتے (پتہ نمبر 2) نے نسبتاً کم ROS کی پیداوار پیدا کی۔

اس کے برعکس، SC155-14E کے MAMP کے زیر علاج دوسرے سب سے کم عمر پتے نمایاں طور پر (0.01 کی سطح پر) ROS کی پیداوار کی غیر علاج شدہ موک کے ساتھ ساتھ BTx کے علاج شدہ یا فرضی سطح پر پیدا ہوئے{ {5}} اور سب سے کم عمر پتے۔ (3) flg22 کی ایپلی کیشنز سے شروع ہونے والے آکسیڈیٹیو برسٹ، یا chitin دونوں جین ٹائپس کے سب سے کم عمر پتے (لیف #3) سے لیف ڈسکس میں پائے گئے، حالانکہ جیسا کہ پہلے مشاہدہ کیا گیا ہے، MAMP سے علاج شدہ SC میں ROS کی پیداوار کی سطح زیادہ تھی۔ 155-14BTx623 سے متعلق E۔ SC22-میں flg22-متحرک اور chitin-triggered ROS کی پیداوار کے ٹائم کورس نے SC155-14E 2nd سب سے کم عمر پتے سے انکشاف کیا کہ chitin-triggered ROS کی پیداوار flg22- نے ROS پروڈکشن کو متحرک کرنے سے پہلے واقع ہوئی تھی (شکل 1C )۔ اسی طرح کے نتائج ژانگ ایٹ ال کے ذریعہ رپورٹ کیے گئے تھے۔ [17] جہاں chitin-triggered ROS کی پیداوار flg22-سے پہلے ظاہر ہوئی flg22 اور chitin سے علاج شدہ مکئی کے بیجوں میں ROS کی پیداوار کو متحرک کیا۔ یہ اطلاع دی گئی [40] کہ flg22 کے جواب میں ROS کی پیداوار نے 12 منٹ کے ارد گرد ROS کی سب سے زیادہ پیداوار ظاہر کی، اور Arabidopsis میں سب سے کم 30 منٹ تھی۔ جوار میں ہمارے ROS پرکھ کے نتائج نے 13 منٹ کے لگ بھگ ROS کی سب سے زیادہ پیداوار ظاہر کی، اور flg22 کے علاج کے بعد سب سے کم 30 منٹ پر، جو عربیڈوپسس کے نتائج سے بہت ملتی جلتی ہے۔ چونکہ ہمارا مقصد دو جین ٹائپس کے MTI ردعمل کے مقابلے کے لیے بہترین حالات تلاش کرنا تھا، اس لیے ہم نے RNA نکالنے اور اس کے بعد ٹرانسکرپٹومک تجزیہ کے لیے 15- دن پرانے پودوں کے دوسرے سب سے چھوٹے پتے کا انتخاب کیا۔ واحد جوار کے پودوں کے پتوں میں فرق اس بات کی یاد دہانی ہے کہ نتائج کسی تجربے کے ماخذ، وقت اور دیگر خصوصیات کے لحاظ سے تجربات کے درمیان مختلف ہو سکتے ہیں اور اس لیے تجرباتی پیرامیٹرز کو احتیاط سے کنٹرول کرنے کی ضرورت ہے۔

آکسیڈیٹیو برسٹ، ایک تیز، عارضی، رد عمل آکسیجن پرجاتیوں (ROS) کی پیداوار، پودے کے دفاعی ردعمل کے ابتدائی مشاہداتی پہلوؤں میں سے ایک ہے [41]۔ اس بات پر غور کرتے ہوئے کہ ROS کا پھٹنا ایک فوری ردعمل ہے، MTI سے متعلق جینوں کا تھوڑا سا بعد میں نقلی ردعمل متوقع ہے۔ ہم نے RNA-Seq تجزیہ کے لیے MAMPs کے علاج کے 60 منٹ بعد نمونے حاصل کیے ہیں۔

2.2 MAMP علاج کے جواب میں BTx623 اور SC155-14E کے مختلف جینز (DEGs)

ہر ایک نمونے کے لیے تشریح شدہ Sorghum bicolor پروٹین کوڈنگ جینز کے اظہار کی سطح کا اندازہ کرنے کے لیے، RNA-seq کے کلین ریڈز کی تعداد کا حساب لگایا گیا جو ہر ایک جین کے ساتھ میپ کیے گئے تھے اور پھر FPKM (ٹکڑے فی kb exon ماڈل فی ملین میپ شدہ ٹکڑے) میں نارمل کیے گئے تھے۔ فرضی (پانی) علاج کے مقابلے میں BTx623 اور SC155-14E کے MAMP سے علاج شدہ لیف ڈسکس میں ہر جین کے اظہار کی تبدیلیوں کی چھان بین کی گئی۔ کل ظاہر شدہ جین دونوں جین ٹائپس کے تمام علاج میں یکساں تھے: 27,171, 27,283, 27,161, 27,182, 27,512, اور 27,175 جین BTx623 کے مذاق میں ظاہر کیے گئے, flg22-علاج شدہ BTx, SC23 کے علاج {22}}E، flg22-علاج شدہ SC155-14E، اور chitin-treated SC155-14E، بالترتیب۔ ہم نے BTx623 حوالہ جینوم کو دونوں لائنوں میں پڑھنے کی نقشہ سازی کے لیے استعمال کیا کیونکہ SC155-14E کے لیے مخصوص حوالہ دستیاب نہیں ہے۔ مندرجہ بالا تمام شرائط کے ساتھ BTx623 اور SC{{30}E سے حاصل کردہ ظاہر شدہ جین نمبروں نے انکشاف کیا کہ دونوں لائنوں نے ظاہر شدہ جینوں کی ایک جیسی تعداد کا اشتراک کیا ہے۔ SC155- 14E فرضی (3 نقلیں) کے نمونوں کی مجموعی پڑھنے کی شرحیں , BTx623 فرضی (3 نقلیں)، BTx623 جس کا علاج flg22 کے ساتھ کیا گیا (3 نقلیں)، BTx623 کا علاج chitin کے ساتھ کیا گیا (3 نقلیں) یہ تھے: 93.6 فیصد، 93.9 فیصد، 93.9 فیصد، 93.8 فیصد، 93.96 فیصد، 93.96 فیصد، 93.93 فیصد، فیصد 93.933 فیصد 93.1 فیصد، 96.9 فیصد، 97۔{68}} فیصد، 97۔{74}} فیصد، 97.2 فیصد، 96.8 فیصد، 97۔ فیصد، 97.0 فیصد، بالترتیب۔ ان نتائج نے تجویز کیا کہ BTx623 اور SC155-14E کے ٹرانسکرپٹوم پر MAMPs کے علاج کے مختلف اثرات دو جین ٹائپس کے درمیان جینومک ترتیب کے فرق کی وجہ سے نہیں تھے۔

جین ایکسپریشن پی سی اے پلاٹ نمونوں کے درمیان تعلق کی بصیرت فراہم کرتا ہے۔ اپنے نمونوں کی مماثلت کو تلاش کرنے کے لیے، ہم نے PCA تجزیہ کیا۔ PC1 اور PC2 (شکل 2) پر نمونے کی منصوبہ بندی سے پتہ چلتا ہے کہ چار تجرباتی حالات (BTX623_flg22؛ SC155-14E_flg22 flg22؛ BTX623_chitin اور SC{ {10}E_chitin) کو بڑے پیمانے پر الگ کیا گیا تھا۔ اس کے برعکس، ہر جوارم لائن کی تین حیاتیاتی نقلیں اور ہر MAMP علاج کے ساتھ ساتھ فرضی علاج، بالترتیب ایک ساتھ مل کر کلسٹر کیے گئے تھے، جو حیاتیاتی نقلوں کے درمیان اچھی تولیدی صلاحیت کی نشاندہی کرتے ہیں (شکل 2)۔

شکل 3 میں آتش فشاں پلاٹ flg22 یا chitin کے ساتھ علاج کی گئی دو جوارم لائنوں میں جین کا اظہار دکھاتے ہیں۔ آتش فشاں پلاٹ ایک قسم کا سکیٹر پلاٹ ہے جو شماریاتی اہمیت (p-value) بمقابلہ تبدیلی کی شدت (فولڈ چینج) کو ظاہر کرتا ہے۔ یہ بڑی تبدیلیوں کے ساتھ جینوں کی فوری بصری شناخت کو قابل بناتا ہے جو شماریاتی طور پر بھی اہم ہیں۔ یہ حیاتیاتی لحاظ سے اہم ترین جین ہو سکتے ہیں۔ شکل 3 میں، −log10 (p-value) کے ساتھ 3 کے برابر یا اس سے زیادہ جینز کو DEGs سمجھا جاتا ہے۔ سرخ رنگ کے نقطے ڈی ای جی کی نمائندگی کرتے ہیں اور سیاہ رنگ کے نقطے غیر ڈی ای جی کی نمائندگی کرتے ہیں۔ ہر پلاٹ میں، 0 سے زیادہ لاگ 2 (فولڈ_تبدیلی) والے جین اوپر ریگولیٹڈ جین ہوتے ہیں، بصورت دیگر، نیچے ریگولیٹڈ جین۔ سب سے اوپر ریگولیٹڈ جینز دائیں طرف ہوتے ہیں، سب سے نیچے ریگولیٹڈ جین بائیں طرف ہوتے ہیں، اور سب سے زیادہ شماریاتی طور پر اہم جین اوپر کی طرف ہوتے ہیں۔

امتیازی طور پر ظاہر کیے گئے جینز (DEGs) کو ہر علاج سے ان کے اظہار کی اہمیت کے مطابق منتخب کیا گیا تھا (p-value 0.001)۔ واضح رہے کہ اس رپورٹ میں ڈی ای جی کو منتخب کرنے کے لیے ہم نے 0 کی p-ویلیو استعمال کی ہے۔ اس سطح پر FDR (q-values) بھی اہم تھے (ٹیبلز S2–S5)۔ 0.001 کی پی ویلیو پر، FDRs 0.0039، 0.0051، 0.0025، اور 0.0035 تھے BTx623 کے لیے flg22 علاج کے ساتھ، SC155-14E flg22 علاج کے ساتھ، BTx623 اور chitin کے ساتھ علاج{SC155-14 26} بالترتیب chitin علاج کے ساتھ E۔ تمام حالات میں BTx623 اور SC155-14 کے جینز کی p-values ​​اور q-values ​​جدول S2–S5 میں درج ہیں۔ BTx623 اور SC155-14E کے MAMP سے علاج شدہ پتوں میں ان جینوں کے اظہار کے نمونوں کا تجزیہ کرتے ہوئے، ہم نے جینوں کی ایک بڑی تعداد (کل ظاہر شدہ جینوں کا 14–30 فیصد) کا مشاہدہ کیا جو flg22 یا chitin کے بعد بڑے فرق کو ظاہر کرتے ہیں۔ جوار کی دونوں لائنوں میں علاج۔ chitin کے علاج شدہ BTx623 (8085) کے کل DEGs کی تعداد اس کے بہت قریب تھی جو BTx623 میں ایک پچھلے ٹرانسکروم مطالعہ میں بتائی گئی تھی جو اینتھراکنوز پیتھوجین C. subline-ola (8078) [37] سے متاثر تھی۔ DEGs کی تعداد flg22 (19 فیصد) یا chitin (30 فیصد) علاج شدہ BTx623 پتوں میں SC155-14E (بالترتیب 14 فیصد اور 21 فیصد) سے زیادہ تھی۔

اگرچہ MAMP سے علاج شدہ BTx623 میں SC155-14E کے نسبت DEGs کی زیادہ تعداد ان دو جین ٹائپس کے ROS ردعمل کے برعکس تھی، یہ شاید حیران کن نہیں ہے کیونکہ MAMP علاج کے لیے ROS ردعمل اور جین کے اظہار کا ردعمل اس وقت ہوتا ہے۔ مختلف اوقات، بڑی حد تک آزاد ہیں، اور مختلف میکانزم کے ذریعے ثالثی کی جاتی ہیں [42,43]۔ GO ٹرم اور KEGG پاتھ وے کی افزودگی نے MAMP سے علاج شدہ SC155-14E نمونوں میں پیش کردہ مزید استثنیٰ اور پیتھوجین مزاحمت سے متعلق DEGs کا انکشاف کیا۔ مزید برآں، حقیقت یہ ہے کہ Flg22 کے ساتھ علاج کیے جانے والے chitin کے علاج شدہ نمونوں میں DEG کی تعداد زیادہ تھی ROS رسپانس اسسیس (شکل 1B) کے ساتھ اچھی طرح سے میل کھاتی ہے جہاں ہم نے چٹن کے علاج پر ROS کا مضبوط ردعمل دیکھا۔

یہ جاننے کے لیے کہ BTx623 اور SC155-14E میں flg22 اور chitin کے علاج کے درمیان جینز اور حیاتیاتی عمل کس حد تک مشترک ہیں، ہم نے ان کے DEGs کا مزید تفصیل سے موازنہ کیا۔ شکل 4A میں وین ڈائیگرامس DEGs میں مجموعی طور پر اوورلیپ دکھاتے ہیں، اوپر اور نیچے ریگولیٹڈ جین 0.001 کی p-value پر سیٹ کرتا ہے۔ کل 10,535 ڈی ای جی میں سے، 2272 جینز کے بنیادی سیٹ نے جوارم کی دونوں لائنوں میں flg22 اور chitin کے علاج دونوں کا جواب دیا۔ اسی طرح، کل 5410 اپ ریگولیٹڈ جینز میں سے، 1778 جینوں کا ایک بنیادی سیٹ دونوں جین ٹائپز میں اپ ریگولیٹ کیا گیا تھا، جب کہ، کل 5125 ڈاؤن ریگولیٹڈ جینز میں سے، 474 کا ایک بنیادی سیٹ دونوں میں نیچے ریگولیٹ کیا گیا تھا۔ جین ٹائپس

یہاں پیش کردہ RNA seq ڈیٹا کا تجزیہ بائیو انفارمیٹکس پائپ لائن ٹولز Bowtie2 2.3.4.3، TopHat 2.1.1، اور Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) کے ساتھ طے شدہ پیرامیٹرز (پائپ لائن #1) کے ساتھ کیا گیا۔ پرکھ کے نتائج کی مزید تصدیق کرنے کے لیے، ہم نے تجزیہ کرنے کے لیے HiSat2، HTSeq، اور edgeR کے ساتھ ایک اور پائپ لائن (پائپ لائن #2) کا استعمال کیا۔ HiSat2 TopHat2 کی اگلی ترقی ہے۔ ہم نے دونوں پائپ لائنوں کا استعمال کرتے ہوئے ہر حالت کے ڈی ای جی کا موازنہ کیا (یعنی دو جین ٹائپس جن کا علاج flg22 یا chitin، تمام، اوپر یا نیچے ریگولیٹڈ DEGs) کیا گیا ہے۔ نتائج (شکل 5) نے ظاہر کیا کہ دونوں پائپ لائنوں کا استعمال کرتے ہوئے منتخب کردہ ڈی ای جی نمبر بہت قریب تھے۔

پائپ لائن #1 بمقابلہ پائپ لائن #2 کے ساتھ منتخب کردہ کل DEGs تھے BTx623_flg22: 5241 بمقابلہ 5413; SC155-14E_flg22: 3849 بمقابلہ 3476; BTx623_chitin: 8085 بمقابلہ 8320; SC155-14E_chitin: 5786 بمقابلہ 5383. پائپ لائن #1 بمقابلہ پائپ لائن #2 کے ساتھ منتخب کردہ اپ ریگولیٹڈ DEGs BTx623_flg22: 3074 بمقابلہ 3076 تھے؛ SC155-14E_flg22: 2591 بمقابلہ 2483; BTx623_chitin: 4156 بمقابلہ 4583; SC155-14E_chitin: 3486 بمقابلہ 3346. پائپ لائن #1 بمقابلہ پائپ لائن #2 کے ساتھ منتخب کردہ ڈاؤن ریگولیٹڈ DEGs BTx623_flg22: 2152 بمقابلہ 2237 تھے؛ SC155-14E_flg22: 1257 بمقابلہ 993; BTx623_chitin: 3919 بمقابلہ 3757; SC155-14E_chitin: 2296 بمقابلہ 2037۔ اس کے علاوہ، شکل 5 کے نتائج سے یہ بھی پتہ چلتا ہے کہ دو پائپ لائنوں کا استعمال کرتے ہوئے منتخب کردہ DEGs کا ایک اعلی فیصد تمام حالات میں اوورلیپ ہوا۔ پائپ لائن #1 کا استعمال کرتے ہوئے منتخب کردہ ڈی ای جی نمبرز/ڈی ای جی نمبروں کا فیصد 79.6 فیصد اور 73.7 فیصد تھا۔ BTx623_flg22، SC155-14E_flg22، BTx623_chitin اور SC155-14E{{73} کے کل DEGs کا 80.8 فیصد اور 74.4 فیصد } chitin، بالترتیب؛ 83 فیصد، 80.6 فیصد، 85.3 فیصد اور BTx623_flg22، SC155-14E_flg22، BTx623_chitin اور SC{{ کے اپ ریگولیٹڈ DEGs کا 81.1 فیصد 88}E_chitin، بالترتیب؛ 75.1 فیصد، 59.5 فیصد، 75.8 فیصد اور BTx623_flg22، SC155-14E{102}}flg22، BTx623_chitin اور SC{{ کے نیچے ریگولیٹڈ DEGs کا 67.4 فیصد 105}ای_بالترتیب۔ اس طرح، ان تقابلی نتائج نے ثابت کیا کہ پیش کردہ RNA seq ڈیٹا درست ہے قطع نظر اس کے کہ تجزیہ کے لیے دونوں میں سے کون سا طریقہ استعمال کیا جائے۔

BTx623 اور SC155-14 کے DEGs کے کلسٹرڈ ایکسپریشن پروفائلز کا ہیٹ میپ جس کا علاج flg22 یا chitin کے ساتھ تین حیاتیاتی نقلوں کے لیے کیا گیا ہے تصویر 6 میں دکھایا گیا ہے۔ جین کے اظہار کی قدروں کو z-scores کے طور پر معمول بنایا گیا تھا۔ قیمت بڑھنے کے ساتھ ہی رنگ جامنی سے سرخ ہو جاتا ہے، جو جین کے اظہار کو کم سے بلندی تک ظاہر کرتا ہے۔ یہ ہیٹ میپ flg22 یا chitin کے علاج کے جواب میں BTx623 اور SC155-14E میں جین کے فرق کو واضح طور پر ظاہر کرتا ہے۔ اس کے علاوہ، نتائج یہ بھی ظاہر کرتے ہیں کہ ہر حالت میں تین حیاتیاتی نقلوں کے ہیٹ میپس بہت قریب تھے، جو کہ حیاتیاتی نقلوں کے درمیان اچھی تولیدی صلاحیت کی نشاندہی کرتے ہیں۔

اس کے علاوہ، flg22 اور chitin علاج سے اوپر اور نیچے ریگولیٹڈ DEGs کے درمیان جوڑے کے حساب سے موازنہ (شکل 7A) سے پتہ چلتا ہے کہ BTx623 اور SC155-14E کے درمیان ایک بڑا اوورلیپ تھا۔ BTx623 میں 3074 flg22-حوصلہ افزائی جینوں میں سے، 83.8 فیصد بھی BTx623 میں chitin علاج کے جواب میں شامل تھے، جب کہ SC155-14E میں 2591 flg22-حوصلہ افزائی جینوں میں سے، {{ 16}}.6 فیصد نے بھی chitin سے علاج شدہ SC155-14E. یہ شاید حیرت کی بات نہیں ہے کیونکہ عربیڈوپسس تھالیانا میں پچھلے کاموں نے مختلف قسم کے مختلف MAMPs کے جواب دینے والے جینوں میں نمایاں اوورلیپ دکھایا، جو عام MTI راستوں کی وضاحت کرتے ہیں [44–46]۔

مزید یہ کہ ژانگ وغیرہ۔ [17] نے مکئی میں flg22 اور chitin کے ردعمل کے درمیان ایک اہم ارتباط کی بھی اطلاع دی۔ BTx623 اور SC155-14E لیف ڈسکس کے درمیان ایک ہی MAMP (شکل 7A) کے ساتھ کم اوورلیپ دیکھا گیا۔ BTx623 میں 64.3 فیصد flg22-حوصلہ افزائی شدہ جین flg22-علاج شدہ SC155-14E اور BTx623 میں 68.3 فیصد chitin-حوصلہ افزائی جین chitin ٹریٹڈ SC میں شامل تھے{{15} ای۔ اسی طرح، BTx623 کے flg22 علاج پر 2152 جینوں میں سے، ایک اعلی فیصد (75.9 فیصد) کو بھی BTx623 میں chitin کے ذریعے نیچے ریگولیٹ کیا گیا۔ SC155-14E میں flg22 کے ذریعے 1257 جینوں کو کم کیا گیا تھا، 70.8 فیصد کو بھی SC155-14E میں chitin کے ذریعے ڈاؤن ریگولیٹ کیا گیا تھا۔ تاہم، BTx623 میں flg22 ڈاؤن ریگولیٹڈ جینز کا صرف 29 فیصد بھی flg22-علاج شدہ SC155-14E میں نیچے ریگولیٹ تھے اور BTx623 میں 45 فیصد chitin-down-regulated جینز ڈاؤن ریگولیٹڈ تھے۔ چٹن سے علاج شدہ SC155-14E (شکل 7A) میں۔ لہذا، جب کہ دو جینی ٹائپس کے مقابلے میں Flg22 اور chitin کے MTI کے راستوں میں نمایاں ہم آہنگی تھی، ڈیٹا اس بارے میں دلچسپ پیچیدگی کا بھی اشارہ کرتا ہے کہ یہ دو جین ٹائپس مختلف MAMPs کو کیسے جواب دیتے ہیں۔

2.3 BTx623 اور SC155-14E کے MTI ردعمل کا موازنہ کرنے والا جین فنکشنل افزودگی تجزیہ

یا تو flg22 یا chitin کے جواب میں ریگولیٹ شدہ جینوں کے فنکشنل زمروں کا تعین کرنے کے لیے اور جانچ کی گئی دو جوارم لائنوں کے امتیازی ردعمل کا تعین کرنے کے لیے، ہم نے PlantRegMap [47,48] پلیٹ فارم کا استعمال کیا تاکہ حیاتیاتی میں پائے جانے والے DEGs کی بنیاد پر جین سیٹ کی افزودگی کا تجزیہ کیا جا سکے۔ عمل کے زمرے. شکل 8A، اور B BTx623 اور SC155-14E دونوں سے اپ ریگولیٹڈ ڈی ای جی اور ڈاون ریگولیٹڈ ڈی ای جی کے ساتھ حیاتیاتی عمل سے افزودہ جینوں کی سرفہرست GO شرائط دکھاتا ہے۔ DEGs کی مکمل فہرست جدول S6–S13 میں فراہم کی گئی ہے۔ ان میں سے بہت سے جین ایسے عمل سے وابستہ ہیں جن میں تناؤ کا ردعمل، پودوں کے دفاعی ردعمل، محرک کا ردعمل، بائیوٹک محرک کا ردعمل، بیکٹیریم کا ردعمل، دوسرے جاندار کا ردعمل، سیل کمیونیکیشن، فاسفورس میٹابولک عمل، اور پروٹین فاسفوریلیشن شامل ہیں۔

شکل 8A، اور B میں نتائج عام طور پر دو جوار کے جین ٹائپ کے درمیان پیدائشی قوت مدافعت سے وابستہ جینوں کے اظہار میں واضح فرق کو ظاہر کرتے ہیں۔ ان افزودہ GO شرائط میں، کچھ منفرد DEGs ہر حالت میں اوورلیپ کے ساتھ پائے گئے۔ مثال کے طور پر، GO ٹرم ڈیفنس ریسپانس (GO 0006952): 91 اور 84 اپ ریگولیٹڈ DEGs کو بالترتیب BTx623 یا SC155-14E میں flg22 کے ساتھ برتا گیا تھا۔ ان DEGs کے اندر، BTx623 میں 24 DEGs منفرد تھے اور 15 DEGs صرف SC155-14E میں پائے گئے تھے، اور باقی دونوں جوارم کے جین ٹائپس میں پیش کیے گئے تھے۔ اسی طرح، 102 اور 93 اپ ریگولیٹڈ DEGs کو بالترتیب BTx623 یا SC155-14E میں افزودہ کیا گیا جس کا علاج chitin کے ساتھ کیا گیا۔ ان DEGs کے اندر، BTx623 میں 20 DEGs منفرد تھے اور SC155-14E میں 14 DEGs منفرد تھے، اور باقی دونوں جوارم جین ٹائپس میں پیش کیے گئے تھے۔

"کاائٹن کے جواب (GO: 0010200)" کی GO اصطلاح میں، ہم نے اس زمرے کے کل 779 جینوں میں سے 18 اپ ریگولیٹڈ ڈی ای جیز کا مشاہدہ کیا جو chitin کے علاج شدہ SC155-14E نمونوں میں افزودہ ہیں (شکل 8) ) ، جبکہ chitin سے علاج شدہ BTx623 نمونوں میں کوئی جین افزودہ نہیں کیا گیا تھا۔ اس کے علاوہ، 16 اپ-ریگولیٹڈ DEGs کو flg22-علاج شدہ SC155-14E نمونوں میں افزودہ کیا گیا تھا، اور 12 اپ ریگولیٹڈ DEGs کو flg22-علاج شدہ BTx623 نمونوں میں افزودہ کیا گیا تھا (شکل 8)۔ Flg22 اور chitin-treated BTX623 اور SC155-14E (ٹیبل S9) میں GO اصطلاح "chitin کے ردعمل" کی DEG فہرستوں کے موازنہ سے پتہ چلتا ہے کہ Flg22، یا chitin-treated SC155- 14 میں افزودہ DEGs E ایک جیسے تھے سوائے چٹن نے flg22 کے مقابلے میں دو مزید DEGs کی حوصلہ افزائی کی۔ اس کے برعکس، Flg22-علاج شدہ BTX623 میں افزودہ تمام 12 DEGs SC155-14E میں MAMPs کے ذریعے حوصلہ افزائی DEGs سے مختلف تھے۔ وہ MAMPs کی حوصلہ افزائی والے DEGs SC155-14E میں اینتھراکنوز کے مزاحمتی ردعمل میں حصہ ڈال سکتے ہیں کیونکہ چٹن فنگل سیل کی دیواروں سے ایک عام MAMP مالیکیول ہے جو پودوں کے مدافعتی ردعمل کو ظاہر کرتا ہے۔ Stringlis et al. [49] نے یہ بھی اطلاع دی ہے کہ اپ ریگولیٹڈ ڈی ای جیز کا ایک سیٹ GO اصطلاح میں chitin، flg22 سے "chitin کے ردعمل" میں افزودہ کیا گیا تھا، اور ایک پودے سے فائدہ مند rhizobacteria Pseudomonas simiae WCS417 Arabidopsis پودوں کا علاج کیا گیا تھا۔ میٹک وغیرہ۔ [33] نے اطلاع دی ہے کہ چاول کی پتی کے RNA-seq تجزیہ سے "chitin کے جواب" کی GO اصطلاح میں 21 DEGs کو افزودہ کیا گیا تھا لیکن فنگل پیتھوجین Fusarium fujikuroi کے ساتھ انفیکشن کے بعد حساس cultivar سے نہیں۔

پی آر (پیتھوجینس سے متعلق) جین پودوں کے مدافعتی ردعمل میں شامل ہیں [50] اور بہت سے فائٹو پیتھوجینک فنگس [51] کے خلاف اینٹی فنگل سرگرمی رکھتے ہیں۔ PR-10 پروٹین چھوٹے ہوتے ہیں، بنیادی طور پر تیزابی، اینٹی فنگل خصوصیات کے ساتھ انٹرا سیلولر پروٹین جو جوارم [52] سمیت پودوں کی انواع میں دفاعی ردعمل سے وابستہ ہوتے ہیں۔ PR-10 جین خاندان کے افراد پودوں کی وسیع اقسام میں روگزن کے حملوں سے متاثر ہوئے تھے [53]۔ سورغم میں، لو وغیرہ۔ [26] نے اطلاع دی ہے کہ PR-10 اظہار کو فولیئر فنگل پیتھوجینز C. heterostrophus اور C. sublineolum کے خلاف جوار کے فعال میزبان دفاع کے حصے کے طور پر آمادہ کیا گیا تھا۔ کیٹی وغیرہ۔ [54] نے اطلاع دی ہے کہ کھیت کے ٹیسٹوں میں سی لوناٹا اور ایف شملہ مرچ کے کوکیی بیضوں کے ساتھ ٹیکہ لگانے کے بعد جوارم کی متعدد اقسام نے PR-10 کی معمول کے مطابق مقدار میں نمایاں اضافہ دکھایا۔ گرین ہاؤس کی حالت میں، ٹیکہ لگائے گئے پودوں کے گلومز نے PR-10 mRNA کی شمولیت کو ظاہر کیا، اور دو حساس کاشتوں کے مقابلہ میں جانچ کی گئی دو مزاحم کاشتوں میں ردعمل زیادہ تھا۔

ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ شناخت شدہ ڈی ای جیز میں سے چار PR-10 جین پائے گئے (SORBI_3001G401300, SORBI_3001G401200, SORBI_3001G400800, SORBI_3001 G401000)۔ SC155-14E میں چاروں PR-10 DEGs کو flg22 یا chitin ٹریٹمنٹ کے ذریعے اپ ریگولیٹ کیا گیا تھا، اس کے برعکس، BTx623 میں، SORBI_3001G401000 DEGs میں نہیں ملا، اور SORBI{15} }G401300 (اپ ریگولیٹڈ) صرف BTx623 میں chitin علاج کے ساتھ پیش کیا گیا تھا لیکن flg22 علاج کے ساتھ نہیں۔ اس نے اشارہ کیا کہ PR جینز کے اظہار کو SC155-14E میں MAMPs کے علاج اور اینتھراکنوز کے خلاف مزاحمت کے بعد اعلی ROS مصنوعات کی سطح کے جواب میں استعمال کیا جا سکتا ہے۔

سیلیسیلک ایسڈ (SA) ایک پودوں کا مدافعتی سگنل ہے جو مقامی دفاعی ردعمل اور نظامی حاصل شدہ مزاحمت دونوں کے لیے ضروری ہے۔ یہ پیتھوجین حملوں کے خلاف مزاحمت اور پودوں کے دفاع میں اہم کردار ادا کرتا ہے [55]۔ سورغم میں، توگیزیمانا وغیرہ۔ [56] نے C. subline-ola سے متاثرہ جوارم میں جیسمونک ایسڈ، سیلیسیلک ایسڈ کنجوگیٹس، اور ابسیسک ایسڈ کی سطحوں میں مقداری تبدیلیوں کی اطلاع دی۔ C. subline-ola anthracnose کا کازل ایجنٹ ہے۔ امائنو ایسڈز (ٹرپٹوفان اور ٹائروسین)، جیسمونک ایسڈ اور سیلیسیلک کنجوگیٹس، اور زیٹن کی بڑھتی ہوئی سطح کے ساتھ جوارم کے جین ٹائپس اینتھراکنوز کے خلاف زیادہ مزاحم تھے۔ اس مطالعہ میں، GO کی اصطلاح 'سیلیسیلک ایسڈ کا ردعمل' (GO:0009751) بشمول 19 اپ-ریگولیٹڈ DEGs کو خاص طور پر صرف SC155-14E میں جو chitin کے ساتھ علاج کیا گیا تھا (ٹیبل S9) میں افزودہ کیا گیا تھا۔ لہٰذا، سیلیسیلک سگنلنگ پاتھ وے MAMP کے علاج اور SC155-14E میں اینتھراکنوز کے خلاف مزاحمت کے بعد ROS کی اعلی پیداوار کی سطح کے جواب میں اہم کردار ادا کر سکتا ہے۔

مزید برآں، 169 اپ-ریگولیٹڈ DEGs کو GO ٹرم کے ردعمل میں صرف SC155-14E میں جو chitin (ٹیبل S9) کے ساتھ علاج کیا جاتا ہے، میں افزودہ کیا گیا۔ دیگر GO اصطلاحات جو صرف SC155-14E میں MAMPs کے ساتھ علاج کی جاتی ہیں، لیکن BTx623 میں اسی علاج کے ساتھ نہیں ہیں، ثانوی میٹابولک عمل (GO:0019748)، فاسفیٹائڈیلچولین بائیو سنتھیٹک عمل (GO:0006656)، اور لپڈ بائیو سنتھیٹک عمل ( GO:0008610)۔

مزید برآں، 169 اپ-ریگولیٹڈ DEGs کو GO ٹرم کے ردعمل میں صرف SC155-14E میں جو chitin (ٹیبل S9) کے ساتھ علاج کیا جاتا ہے، میں افزودہ کیا گیا۔ دیگر GO اصطلاحات جو صرف SC155-14E میں MAMPs کے ساتھ علاج کی جاتی ہیں، لیکن BTx623 میں اسی علاج کے ساتھ نہیں ہیں، ثانوی میٹابولک عمل (GO:0019748)، فاسفیٹائڈیلچولین بائیو سنتھیٹک عمل (GO:0006656)، اور لپڈ بائیو سنتھیٹک عمل ( GO:0008610)۔

ہم نے جینوں کی ترکیب کا بھی جائزہ لیا جو flg22 یا chitin علاج کے بعد دو جینی ٹائپس کے درمیان باضابطہ ہیں نیز تمام علاجوں میں DEGs کے بنیادی سیٹ اور GO افزودگی تجزیہ (اعداد و شمار 4B اور 7B) کے ذریعہ دو جین ٹائپس۔ ڈی ای جی کی مکمل فہرست ٹیبلز S14 اور S15 میں فراہم کی گئی ہے۔ شکل 4B نے تمام علاج کے ساتھ BTx623 اور SC155-14E میں کل، اوپر اور نیچے ریگولیٹڈ DEGs کے بنیادی سیٹوں کی افزودہ GO شرائط دکھائیں۔ MAMPs کے ردعمل اور پودوں کے دفاع سے متعلق GO شرائط (مثال کے طور پر، chitin بائنڈنگ، دفاعی ردعمل، پروٹین کناز سرگرمی، پروٹین فاسفوریلیشن، پروٹین سیرین/تھریونائن کناز سرگرمی) کو اپ ریگولیٹڈ DEGs میں نمایاں طور پر افزودہ کیا گیا تھا جبکہ ثانوی میٹابولائٹ بائیو سنتھیٹک عمل کی GO شرائط، آئرن آئن بائنڈنگ، oxidoreductase سرگرمی کو صرف ڈاون ریگولیٹڈ DEGs میں افزودہ کیا گیا تھا۔ یہ نتیجہ عربیڈوپسس کے نتائج سے ملتا جلتا تھا جہاں ایلیسیٹرز کے جواب سے متعلق GO کی اصطلاحات (P. simile WCS417 اور P. aeruginosa PAO1، chitin، اور P. simile WCS417 کے بیکٹیریل سیلز سے flg22 پیپٹائڈس) سب سے نمایاں طور پر اپ ریگولیٹڈ میں افزودہ تھے۔ DEGs کا بنیادی سیٹ [49]۔

شکل 7B نے Flg22 یا chitin ٹریٹمنٹ کے بعد BTx623 اور SC155-14E کے درمیان DEGs کے کو-ریگولیٹڈ (یعنی دونوں جین ٹائپس میں اوپر یا نیچے ریگولیٹڈ) کی نمایاں طور پر افزودہ GO شرائط کو دکھایا۔ نتائج سے یہ بات سامنے آئی کہ MAMPs کے ردعمل اور پودوں کے دفاع سے متعلق GO کی شرائط (مثال کے طور پر، دفاعی ردعمل، پروٹین کناز سرگرمی، پروٹین فاسفوریلیشن، پروٹین سیرین/تھریونائن کناز سرگرمی) صرف flg22 یا chitin up-regulated DEGs میں دونوں جین ٹائپس میں افزودہ کی گئی تھیں جبکہ GO کی شرائط۔ ثانوی میٹابولائٹ بائیو سنتھیٹک عمل، ہیم بائنڈنگ، آئرن آئن بائنڈنگ، آکسیجن کے ایک ایٹم کی آکسیڈورڈکٹیس سرگرمی اور فاسفیٹائڈیلچولین بائیو سنتھیٹک عمل کو مکمل طور پر ڈی ای جی کے نیچے ریگولیٹڈ سیٹوں میں افزودہ کیا گیا تھا۔

2.4 BTx623 اور SC155-14E کے MTI رسپانس کا KEGG پاتھ وے افزودگی تجزیہ

شکل 9 DAVID آن لائن ٹول [57] کا استعمال کرتے ہوئے MAMP سے علاج شدہ BTx623 اور SC{{4}E نمونے میں پائے جانے والے اپ ریگولیٹڈ DEGs کے KEGG راستے کی افزودگی کا تجزیہ دکھاتا ہے۔ DEGs کی مکمل فہرست جدول S16-S20 میں فراہم کی گئی ہے۔ نتائج ان مخصوص KEGG راستوں کی نشاندہی کرتے ہیں جو دو جوار کے جین ٹائپز میں MTI کے فعال ہونے کے نتیجے میں افزودہ ہوتے ہیں۔ KEGG پاتھ وے "پلانٹ-پیتھوجین تعامل" میں، ہم نے مشاہدہ کیا کہ 24 اپ ریگولیٹڈ ڈی ای جیز کو چائٹن سے علاج شدہ SC{11}E نمونوں میں افزودہ کیا گیا تھا، جبکہ کسی بھی ڈی ای جی کو چٹن سے علاج شدہ BTx623 نمونوں میں افزودہ نہیں کیا گیا تھا۔ جینی ٹائپ SC155-14E کا مضبوط chitin ردعمل فنگل بیماری اینتھراکنوز [39] کے خلاف اس جین ٹائپ کی زیادہ مزاحمت کے ساتھ تعلق رکھتا ہے۔ مزید برآں، KEGG پاتھ وے کی افزودگی نے SC155-14E میں اصطلاح phenylpropanoid biosynthesis میں شامل 28 جینوں کا انکشاف کیا جن کا flg22 کے ساتھ علاج کیا گیا۔ فینیلپروپینائڈ بائیو سنتھیس کا راستہ فینی لالینین سے شروع ہوتا ہے جسے خوشبودار مرکبات میں تبدیل کیا جا سکتا ہے جیسے کہ فلیوونائڈز، بینزینائڈز، کومرین، ہائیڈروکسی سنامیٹس، اور لگنن [58,59]۔ بہت سے فینیلپروپینائڈز اور فلیوونائڈز بیماری کے خلاف مزاحمت کے ردعمل میں شامل تھے [28,60]۔ phytoalexins کی پیداوار جوار میں اینتھراکنوز پیتھوجین C. subline-ola [28] کے خلاف ایک بڑا دفاعی ردعمل ہے۔ 3- deoxy anthocyanidins flavonoids کا ایک غیر معمولی گروپ ہے جو جوار میں فائٹو ایلیکسن کے طور پر جانا جاتا ہے۔ Phytoalexins چھوٹے مالیکیولز ہیں جن میں antimicrobial سرگرمی ہوتی ہے جو پیتھوجین انفیکشن [61] کے بعد پیدا ہوتی ہے۔ وانگ وغیرہ۔ [37] نے یہ بھی پایا کہ KEGG کی اصطلاح phenylpropanoid biosynthesis کو C. subline-ola-infected پودوں کے DEGs میں ان کے جوار کے ٹرانسکرپٹومکس مطالعہ میں نمایاں طور پر افزودہ کیا گیا تھا۔ ہمیں نوٹ کرنا چاہئے کہ KEGG پاتھ وے افزودگی کے نتائج (شکل 9) نے بھی کچھ راستوں میں MAMPs کے علاج کے بعد BTx623 کا زیادہ ردعمل ظاہر کیا جو پودوں کے روگزنق تعامل میں کردار ادا کر سکتا ہے (مثال کے طور پر، راستے میں فینیلالینائن اور ٹرپٹوفن بائیو سنتھیسس، اینٹی بائیوٹک بائیو سنتھیسس)۔

مزید برآں، ڈاؤن ریگولیٹڈ DEGs کے KEGG پاتھ وے افزودگی کے تجزیے کے نتائج سے یہ بات سامنے آئی ہے کہ دس ڈاؤن ریگولیٹڈ DEGs کو 'فوٹو سنتھیس-اینٹینا پروٹین' کے طور پر بیان کیا گیا تھا اور 84 DEGs کو تشریح کیا گیا تھا جیسا کہ 'ثانوی میٹابولائٹس کے بائیو سنتھیسز' میں حصہ لیا گیا تھا۔ BTx623۔ تاہم، اس طرح کے جین ایکسپریشن اسٹڈیز MAMPs کے علاج یا پیتھوجین انفیکشن کے جواب میں مختلف جینوں کی شناخت کر سکتے ہیں، لیکن یہ لازمی طور پر یہ ظاہر نہیں کرتا ہے کہ یہ جینز کسی مخصوص روگزنق کے خلاف مزاحمت کے لیے اہم ہیں۔ اس طرح، فنگل مزاحمت اور دونوں جین ٹائپس میں ان KEGG راستوں کو چالو کرنے کے درمیان کارآمد تعلقات کو سمجھنے کے لیے مزید تحقیق کی ضرورت ہوگی، جیسا کہ RNA-Seq تجزیہ سے ظاہر ہوا ہے۔

ہم نے تمام حالات (شکل 4C) میں DEGs کے بنیادی سیٹوں کے ساتھ ساتھ flg22 یا chitin ٹریٹمنٹ (شکل 7C) کے بعد دو جین ٹائپس کے درمیان شریک ریگولیٹڈ DEGs کے لئے KEGG پاتھ وے افزودگی تجزیہ بھی کیا۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ چھ اہم راستے، بشمول پلانٹ پیتھوجین کے تعامل کے راستے، کو صرف DEGs کے اپ-ریگولیٹڈ کور سیٹوں میں افزودہ کیا گیا تھا لیکن DEGs کے نیچے ریگولیٹڈ کور سیٹوں میں نہیں۔ اسی طرح، سات اور تین راستے، بشمول پلانٹ-پیتھوجین کے تعامل کے راستے، بالترتیب BTx623 اور SC155-14E میں chitin up-regulated DEGs اور flg22 up-regulated DEGs میں نمایاں طور پر افزودہ تھے۔ اس کے برعکس، eukaryotes پاتھ وے میں صرف ribosome biogenesis کو دونوں جین ٹائپس میں chitin-down-regulated DEGs میں افزودہ کیا گیا تھا۔

2.5 منتخب جینز کے مقداری RT-PCR کا استعمال کرتے ہوئے RNA-Seq ڈیٹا کی توثیق

RNA-seq کے ذریعے حاصل کردہ جین ایکسپریشن پروفائلنگ ڈیٹا کی تصدیق کرنے کے لیے، ہم نے نو منتخب امیدوار جینوں کے اظہار کا اندازہ کرنے کے لیے qRT-PCR تجزیہ کیا۔ ان نو جینوں کا انتخاب RNA-seq کے مشاہدہ کردہ اظہار کی بنیاد پر کیا گیا تھا جو تین زمروں میں تھا: (a) اسی طرح کا اظہار BTx623 اور SC155-14E میں flg22 یا chitin علاج کے ساتھ؛ (b) صرف MAMPs میں علاج شدہ SC155-14E میں اظہار کیا گیا لیکن علاج شدہ BTx623 میں انتہائی کم اظہار کے ساتھ اور (c) BTx623 کے مقابلہ میں MAMPs کے علاج شدہ SC155-14E میں 2–21-گنا زیادہ ظاہر کیا گیا۔ . qRT-PCR تجزیہ کے نتائج (ٹیبل 1) نے تشخیص کیے گئے نو جینوں میں سے ہر ایک کے لیے RNA-seq تجزیہ کے ذریعے متعین اظہار کی سطحوں کے ساتھ ایک مکمل معاہدہ ظاہر کیا۔ یہ نتائج ہمیں یقین دلاتے ہیں کہ RNA-seq کے ذریعے کی گئی پیمائش MAMP کے علاج کے لیے جوارم لائنوں کے نقلی ردعمل کی عکاسی کرتی ہے۔

2.6۔ نتائج

اس مطالعے میں، ہم نے سب سے پہلے پتوں کے تین سیٹوں کا استعمال کرتے ہوئے ROS کی پیداوار کی جانچ کرکے دو جینی ٹائپس کے MTI ردعمل کے موازنہ کے لیے بہترین حالات تلاش کیے اور RNA نکالنے اور اس کے بعد ٹرانسکرپٹومک تجزیہ کے لیے پندرہ دن پرانے پودوں کے دوسرے سب سے چھوٹے پتے کا انتخاب کیا۔ جوارم لائن SC155-14E (شکل 1C) میں flg22-متحرک اور chitin سے متحرک ROS کی پیداوار کے ایک ٹائم کورس نے انکشاف کیا کہ chitin-triggered ROS کی پیداوار flg22 کے علاج سے شروع ہونے سے پہلے ہوئی تھی۔ ہم نے ابتدائی مراحل کے دوران MAMP کے علاج کے لیے ROS پروڈکٹ پر کم ردعمل کے ساتھ ROS پروڈکشن پر MAMPs کے علاج اور حساس جینوٹائپ BTx623 کے لیے اعلی ردعمل کے ساتھ فنگل بیماری اینتھراکنوز مزاحم سورگھم بائیکلر جینوٹائپ SC155-14کے ایکسپریشن پروفائلز حاصل کیے ہیں۔ پیدائشی قوت مدافعت کے ردعمل کا۔

نتائج MAMP علاج کے جواب میں جوارم کے جین ٹائپس BTx623 اور SC155-14E میں جین کے اظہار کی واضح تبدیلی کو ظاہر کرتے ہیں۔ جب کہ دو MAMPs کے جوابات نے ہر لائن (86.6–70.8 فیصد) کے اندر کافی حد تک اوورلیپ دکھایا، وہ الگ الگ تھے۔ کچھ، کم ہونے کے باوجود، اوورلیپ (68.3–29 فیصد ) ایک ہی MAMP پر دو لائنوں کے ردعمل کے درمیان بھی دیکھا گیا۔ DEGs کی ایک قابل ذکر تعداد، 10,535 DEGs میں سے 2272، چاروں حالات میں شناخت کی گئی ہیں اور عارضی طور پر بنیادی MAMP ردعمل کی وضاحت کرتے ہیں۔ جینز کی یہ فہرست ان لیبارٹریوں کے لیے کارآمد ہونی چاہیے جو MAMP کے علاج کے لیے جین کے اظہار کے ردعمل کو پروفائل کرنا چاہتی ہیں۔ RNA-seq تجزیہ نے BTx623 اور SC155-14E میں مختلف جینز کے بڑے سیٹوں کی نشاندہی کی جن کا علاج flg22 یا chitin کے ساتھ ان دو لائنوں کے غیر علاج شدہ فرضی کنٹرول کے مقابلے میں کیا گیا۔ مزید برآں، دو مختلف بائیو انفارمیٹکس پائپ لائنوں کا استعمال کرتے ہوئے منتخب کردہ ڈی ای جیز کے موازنہ نے بہت ملتے جلتے نتائج دکھائے۔ ان DEGs کے تفصیلی اظہار پروفائل تجزیہ، GO افزودگی تجزیہ اور KEGG پاتھ وے تجزیہ نے دو جین ٹائپس کے جین کے اظہار کے ردعمل میں واضح تغیر کا انکشاف کیا۔ GO ٹرم اور KEGG پاتھ وے کی افزودگی نے MAMP سے علاج شدہ SC میں مزید استثنیٰ اور پیتھوجین مزاحمت سے متعلق DEGs (PR جینز، جینز کا chitin کے لیے ردعمل، سیلیسیلک ایسڈ کے لیے جینز کا ردعمل، تناؤ کا ردعمل، phenylpropanoid biosynthesis وغیرہ) دریافت کیا{{18} اسی علاج کے ساتھ BTx623 سے متعلق E نمونے۔ یہ معلومات اہم بنیادی معلومات فراہم کرتی ہے کہ اس کلیدی فصل کے پودے کا فطری مدافعتی نظام MAMPs کے اخراج پر کیسے ردعمل ظاہر کرتا ہے۔ Arabidopsis ماڈل کی نسبت فصل کے پودوں کے فطری مدافعتی ردعمل کے بارے میں معلومات کی عمومی کمی کے پیش نظر، بیان کردہ جین کی فہرستیں اور طریقے روگجنوں کے خلاف جوار کے ردعمل کی مزید کھوج کے لیے ایک وسیلہ فراہم کرتے ہیں اور بالآخر بیماریوں کے خلاف مزاحمت کو بہتر بنانے کی کوششوں میں سہولت فراہم کرتے ہیں۔ یہ اہم خوراک اور بایڈماس فصل.

3. مواد اور طریقے

3.1 پلانٹ کا مواد

اس تحقیق میں ڈاکٹر ولیم رونی (ٹیکساس A&M یونیورسٹی، کالج اسٹیشن، USA) اور ڈاکٹر اسٹیفن کریسووچ (Clemson University، Clemson، USA) کی طرف سے فراہم کردہ جوارم کی دو لائنیں استعمال کی گئیں۔ BTx623 ایک معیاری جوارم لائن ہے جس میں دستیاب پوری جینوم ترتیب ہے [22]، اور SC155-14E ایک لائن ہے جو اینتھراکنوز مزاحمت کے لیے تیار کی گئی ہے [39]۔

3.2 ROS Assays

BTx623 اور SC155-14E کے جوار کے بیجوں کو سطحی جراثیم سے پاک کیا گیا تھا (1 منٹ کے لئے 70 فیصد ایتھنول اور پھر 10 منٹ کے لئے 10 فیصد بلیچ، آٹوکلیوڈ ddH2O سے دھویا گیا) اور آٹوکلیوڈ سنشائن پاٹنگ مکس میں لگایا گیا، اور گروتھ چیمبرز میں انکرن کیا گیا ( 16 h/8 h روشنی/تاریک، 28/26 ◦C، 60–70 فیصد نمی)۔ تجربات کے لیے پندرہ دن پرانے پودے استعمال کیے گئے۔

اس مطالعے میں دو MAMPs، flg22 (Genscript catalog# RP19986) اور کیکڑے کے خول سے chitin (Sigma-Aldrich، catalog# C3641) استعمال کیے گئے۔ Flg22 ایک پیپٹائڈ ہے جو پودوں کے پیتھوجینک بیکٹیریا کے فلیجیلین این ٹرمینس سے اخذ کیا جاتا ہے اور یہ پودوں میں ایک مخصوص پیدائشی مدافعتی ردعمل کو ظاہر کرنے کے لیے مشہور ہے [62]۔ چٹن ایک عام MAMP مالیکیول ہے جو فنگل سیل کی دیواروں سے حاصل ہوتا ہے، جو پودوں کے مدافعتی ردعمل کو ظاہر کرتا ہے [3]۔ کمبل ایٹ ال کے مطابق آر او ایس اسیس کیے گئے تھے۔ [38]۔ انفرادی جینی ٹائپ کے اندر MAMP ردعمل میں تغیر کا اندازہ لگانے کے لیے، ساتھ ہی پتوں کی پوزیشن، ہر جین ٹائپ کے پودوں کے تینوں مکمل پھیلے ہوئے پتوں کا انفرادی طور پر اندازہ کیا گیا۔ ہر جین ٹائپ کے پندرہ دن پرانے جوار کے پودوں کے نیچے سے اوپر تک پتوں کو پتی #1، #2 اور #3 کے طور پر نشان زد کیا گیا تھا۔ ہم نے ROS کی پیداوار کی پیمائش کے لیے نمونے لینے کے لیے پتی کا صرف درمیانی حصہ استعمال کیا۔ علاج کے فوراً بعد، فوٹیک سی سی ڈی کیمرہ (فوٹیک لمیٹڈ، ایسٹ سسیکس یوکے) کا استعمال کرتے ہوئے ہر نمونے کا کیمیلومینسنٹ سگنل 30 منٹ تک ریکارڈ کیا گیا۔ آٹھ کنویں ایک فرضی علاج پر مشتمل ہیں (ایم اے ایم پی کے بغیر) اور آٹھ کنویں ایک علاج (ایم اے ایم پی کے ساتھ) پر مشتمل ہیں۔ ہر معاملے میں، ہر علاج کے لیے کل 8 نمونوں کے ساتھ تین حیاتیاتی نقلوں کا موازنہ کیا گیا۔

3.3 MAMPs کے ساتھ نمونہ علاج

تجربات کے لیے پندرہ دن پرانے پودے استعمال کیے گئے۔ MAMPs کے علاج کیے گئے جیسا کہ Valdes-Lopez et al میں بیان کیا گیا ہے۔ [12] معمولی ترامیم کے ساتھ۔ مختصراً، ہر جوارم کی لکیر کے لیے پانچ پودوں سے دوسری پتی (اوپر سے یعنی دوسری سب سے چھوٹی پتی) کو الگ کیا گیا اور پھر 2 منٹ کے لیے آٹوکلیوڈ ddH2O کے ساتھ خلا میں گھسایا گیا۔ تقریباً پچاس 1 سینٹی میٹر قطر کے پتوں کی ڈسکوں کو ہر جین ٹائپ کے پانی میں گھسنے والے پتوں سے کاٹ کر جمع کیا گیا تھا۔ ہر جین ٹائپ سے پینتالیس لیف ڈسکس کو تین مختلف پیٹری ڈشز (ہر پیٹری ڈش میں 15 لیف ڈسکس) میں منتقل کیا گیا اور پھر ایلومینیم ورق سے ڈھکی ہوئی پلیٹوں کے ساتھ آٹوکلیوڈ ddH2O پر کمرے کے درجہ حرارت پر راتوں رات تیرا گیا۔ اگلے دن، تمام پیٹری ڈشز سے پانی ہٹا دیا گیا اور اس کی جگہ 10 ملی لیٹر ddH2O (مذاق)، 10 mL 1 µM flg22، یا 10 mL 20 mg/mL chitin محلول ڈالا گیا۔ ایک 60- منٹ کے علاج کے بعد، فرضی اور MAMP سے علاج شدہ پتی کے ٹکڑوں کو مختلف ٹیوبوں میں کاٹا گیا اور فوری طور پر مائع نائٹروجن میں منجمد کر دیا گیا۔ پتی کے ٹکڑوں کے نمونے (101 quenced "ies ied-11272 کے لیے) مدافعتیBTx623 اور SC155-14E mock, flg22، یا chitin کے علاج کے ساتھ، تین حیاتیاتی نقل) RNA نکالنے کے لیے −80 ◦C پر محفوظ کیے گئے تھے۔ سبھی اوپر بیان کردہ طریقہ کار کسی بھی ممکنہ فوٹو سنتھیس اثر کو ختم کرنے کے لیے تاریک حالات میں انجام دیا گیا تھا۔

3.4 آر این اے نکالنا، ترتیب دینا، اور لائبریری کی تعمیر

آر این اے نکالنے کو مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق Zymoresearch (کیٹلاگ #R2071) سے Direct-zol RNA Miniprep Plus کٹ کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا تھا۔

یونیورسٹی آف میسوری ڈی این اے کور سہولت میں ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ کی گئی۔ Illumina کی TruSeq mRNA پھنسے ہوئے نمونے کی تیاری کی کٹ میں فراہم کردہ ریجنٹس کے ساتھ مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے بعد اٹھارہ لائبریریاں تعمیر کی گئیں۔ نمونے کے ارتکاز کا تعین Qubit fluorometer (Invitrogen) کے ذریعے Qubit HS RNA پرکھ کٹ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا، اور RNA کی سالمیت کو فریگمنٹ اینالائزر خودکار الیکٹروفورسس سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے چیک کیا گیا تھا۔ مختصراً، پولی-A پر مشتمل mRNA کو کل RNA (1 µg) سے پاک کیا گیا تھا، RNA کو ٹکڑے ٹکڑے کر دیا گیا تھا، دوہری پھنسے ہوئے cDNA کو بکھرے ہوئے RNA سے تیار کیا گیا تھا، اور اڈیپٹرز پر مشتمل انڈیکس سروں تک بند تھا۔ Axyprep Mag PCR کلین اپ موتیوں کے اضافے سے ایمپلیفائیڈ سی ڈی این اے تعمیرات کو پاک کیا گیا تھا۔ فریگمنٹ اینالائزر آٹومیٹڈ الیکٹروفورسس سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے ہر پیوریفائیڈ لائبریری کی حتمی تعمیر کا جائزہ لیا گیا، Qubit HS dsDNA پرکھ کٹ کا استعمال کرتے ہوئے Qubit fluorometer کے ساتھ مقدار درست کی گئی، اور Illumina کے معیاری ترتیب سازی پروٹوکول کے مطابق گھٹا کر NextSeq پر ترتیب دینے کے لیے سنگل تھیک کی لمبائی تھی. 75 بنیادوں پر پڑھیں۔

3.5 آر این اے سیک ریڈز کی میپنگ اور پروسیسنگ

ترتیب کے اعداد و شمار نے چھ مختلف شرائط کی نمائندگی کی: BTx623 موک، flg22، یا chitin علاج کے ساتھ، اور SC155-14E mock, flg22، یا chitin علاج کے ساتھ۔ ہر حالت کی نمائندگی تین حیاتیاتی نقلیں کرتی تھیں، جس کے نتیجے میں کل 18 نمونے ہوتے ہیں۔ سب سے پہلے، ریڈز کے 30 سروں کو ایلومینا اڈاپٹر کے لیے، مبہم نیوکلیوٹائڈس (N's) کے لیے، اور (NextSeq ٹیکنالوجی کی وجہ سے) مصنوعی پولی-G (جی کے طور پر پیش کیا جاتا ہے) کے لیے کٹاڈیپٹ کا استعمال کرتے ہوئے "تراشے" کیے گئے تھے۔ ورژن 1.15 (http://dx.doi.org/10.14806/ej.17.1.200، 21 اگست 2019 کو حاصل کیا گیا) ان پڑھنے کے لیے جن کے 30 سرے 90 فیصد شناخت کے ساتھ کم از کم 3 بیسز کے لیے اڈاپٹر کے ساتھ اوورلیپ ہوتے ہیں۔ اگر اس تراشنے کے بعد، ایک ریڈ میں دس سے کم بیسز ہوں تو اسے ضائع کر دیا گیا تھا (اگر قابل اطلاق ہو تو اس کے جوڑے والے پڑھنے کے ساتھ)۔ FASTQC (ورژن 0.11.9) [63] کا استعمال کرتے ہوئے تراشنے کے بعد RNA seq ڈیٹا کے معیار کے اسکور کی جانچ کی گئی۔ ریڈز میں تمام پوزیشنوں کے لیے، میڈین کوالٹی اسکور تقریباً 34 ہے، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ بیس کالنگ کی درستگی 99.9 فیصد سے زیادہ ہے۔ ہر نمونے کے لیے ریڈز کو حوالہ جینوم (Sorghum_bicolor_NCBIv3.dna. top-level. fa) ٹوفیٹ 2.1.1 کے ساتھ منسلک کیا گیا تھا۔ نتیجے میں ترتیب والی فائلیں کفلنکس 2.2.1 کو فراہم کی گئیں تاکہ ہر نمونے کے لیے نقلیں جمع کی جا سکیں۔ اس تحقیق میں استعمال کیا گیا تشریحی ورژن Sorghum_bicolor_NCBIv3.38.gff3 تھا۔ اسی حالت کے نمونوں کو کفمرج کا استعمال کرتے ہوئے ملا دیا گیا تھا۔ مقصد ہر حالت میں جین اور ٹرانسکرپٹ اظہار کا حساب لگانے کے لئے یکساں بنیاد فراہم کرنا تھا۔

3.6۔ RNA-Seq ڈیٹا کا بایو انفارمیٹک تجزیہ

RNA seq ڈیٹا کا تجزیہ بائیو انفارمیٹکس ٹولز Bowtie{{0}}.3.4.3، TopHat 2.1.1، اور Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) کے ساتھ طے شدہ پیرامیٹرز کے ساتھ کیا گیا۔ ہم نے ان ٹولز کے ساتھ وہی پائپ لائن استعمال کی جیسا کہ Trapnell et al میں بیان کیا گیا ہے۔ [64]۔ پرکھ کے نتائج کی مزید تصدیق کرنے کے لیے، ہم نے تجزیہ کرنے کے لیے HiSat2 (ورژن 2.1۔{15}})، HTSeq (ورژن 0.12.4) اور edgeR (ورژن 3.26.8) کے ساتھ ایک اور پائپ لائن کا استعمال کیا۔ HiSat2 TopHat2 کی اگلی ترقی ہے۔ سب سے پہلے، ہم نے HiSat2 کا استعمال Sorghum حوالہ جینوم کا استعمال کرتے ہوئے سیدھ میں کرنے کے لیے کیا۔ پھر ہم نے HTSeq کا استعمال اس گنتی کے لیے کیا کہ ہر جین میں کتنے ریڈز میپ کیے گئے تھے۔ اس کے لیے ہمیں پچھلے مرحلے سے تیار کردہ بام فائلوں اور جینوم تشریح (gif فائل) کی ضرورت تھی۔ نوٹ کریں کہ حوالہ جینوم اور تشریحی فائلیں وہی ہیں جو ہم نے اصل پائپ لائن میں استعمال کی ہیں۔ آخر میں، ہم نے R پیکیج edgeR کا استعمال کیا تاکہ ہر حالت میں مختلف جین کا تعین کیا جا سکے۔

3.7۔ مختلف اظہار شدہ جینوں کی شناخت
ضم شدہ اسمبلی کو کفڈف میں کھلایا گیا تھا، جو اظہار کی سطحوں کا حساب لگاتا ہے اور دو شرائط کے درمیان مشاہدہ شدہ تبدیلیوں کی شماریاتی اہمیت کی جانچ کرتا ہے۔ ہم نے موک بمقابلہ flg22، اور موک بمقابلہ چٹن برائے BTx623، اور SC155-14E کے درمیان حالات کا بالترتیب موازنہ کیا۔ امتیازی طور پر ظاہر کیے گئے جینز کو 0 کا استعمال کرتے ہوئے نکالا گیا تھا۔{9}}01 p-value کی حد آتش فشاں پلاٹ R پیکیج (ggplot2 V3.3.0) کا استعمال کرتے ہوئے BTx623 کی حالتوں میں جین کے اظہار کی تبدیلی کی اہمیت کو ظاہر کرنے کے لیے بنائے گئے تھے جن کا علاج flg22 یا chitin کے ساتھ کیا گیا تھا اور SC155- 14E کا علاج flg22 یا chitin کے ساتھ کیا گیا تھا۔ تین کے برابر یا اس سے زیادہ −log10 (p-value) والے جین نقطوں کو DEG سمجھا جاتا تھا۔ ہر پلاٹ میں، صفر سے زیادہ لاگ 2 (فولڈ_تبدیلی) والے جین کے نقطے اپ ریگولیٹڈ جین تھے، بصورت دیگر، وہ جین کو نیچے ریگولیٹ کرتے ہیں۔

3.8۔ پی سی اے پلاٹ

ہر جوارم لائن کی تین حیاتیاتی نقلوں اور ہر MAMP ٹریٹمنٹ کے جین ایکسپریشن ویلیو کے درمیان تعلق کو جانچنے کے لیے، R پیکجز (ggfortify V{{0}}.4.10، ggplot2 V3 کا استعمال کرتے ہوئے پرنسپل کمپوننٹ اینالیسس (PCA) پلاٹ تیار کیے گئے تھے۔ .3.0)۔ ہر ڈاٹ اصل فیچر اسپیس (جین ایکسپریشن) سے پہلے دو پرنسپل اجزاء تک میپنگ کے بعد ایک شرط کی نمائندگی کرتا ہے۔ ایک ہی حالت سے تعلق رکھنے والے نقطے ایک ساتھ کلسٹر ہوتے ہیں۔

3.9 DEGs کی گرمی کا نقشہ

1 ڈویژن آف پلانٹ سائنس اینڈ ٹیکنالوجی اور بائیو کیمسٹری، CS بانڈ لائف سائنسز سینٹر، یونیورسٹی آف مسوری، کولمبیا، MO 65211، USA؛ cuiy@missouri.edu (YC)؛ chendq@cau.edu.cn (DC)

2 شعبہ الیکٹریکل انجینئرنگ اور کمپیوٹر سائنس، CS بانڈ لائف سائنسز سینٹر، یونیورسٹی آف مسوری، کولمبیا، MO 65211، USA؛ yjm85@mail.missouri.edu (YJ)؛ xudong@missouri.edu (DX)

3 Department of Entomology and Plant Pathology, NC State University, Raleigh, NC 27695, USA; pjbalint@ncsu.edu

4 پلانٹ سائنس ریسرچ یونٹ، USDA-ARS، Raleigh، NC 27695، USA

* Correspondence: staceyg@missouri.edu