Telomeric پروٹین TRF2 کے ایکسپریشن ریگولیٹرز کے لیے ایک نئی اسکرین نے چھوٹے مالیکیولز کی نشاندہی کی ہے جو TRF2 پر منحصر مدافعتی دباؤ اور ٹیومر کی نشوونما کو متاثر کرتے ہیں۔

از راہ کرم رابطہ کریںoscar.xiao@wecistanche.comمزید معلومات کے لیے

سادہ خلاصہ:ٹیلومیرک پروٹین ٹی آر ایف 2 (ٹیلومیرک ریپیٹ بائنڈنگ فیکٹر 2) انسانی کینسر میں الگ ہوجاتا ہے اور اس کا تعلق خراب تشخیص سے ہوتا ہے۔ TRF2 آنکوجینک خصوصیات اس کے اندرونی ٹیلومیر حفاظتی کردار پر انحصار کرتی ہیں، بلکہ مدافعتی اور انجیوجینک سرگرمیوں کے ذریعے سیل کے خارجی اثرات پر بھی۔ لہذا، TRF2 کو نشانہ بنانا ایک امید افزا علاج کی انسداد کینسر حکمت عملی کے طور پر ظاہر ہوتا ہے۔ اس مطالعے میں، ہم نے TRF2 روکنے والوں کی اسکریننگ کے لیے ایک سیل پر مبنی طریقہ تیار کیا ہے جس سے ہمیں دو مرکبات کی شناخت کرنے کی اجازت ملتی ہے جو Vivo میں TRF2 پرو آنکوجینک خصوصیات کو ختم کرتے ہیں۔

خلاصہ: ٹیلومیرک ریپیٹ بائنڈنگ فیکٹر 2 (TRIF2) شیلٹرن پروٹین کمپلیکس کا ایک ذیلی یونٹ ہے، جو ٹیلومیرس کو ناپسندیدہ ڈی این اے ڈیمیج رسپانس (DDR) ایکٹیویشن سے منسلک کرتا ہے اور اس کی حفاظت کرتا ہے۔ TRF2 اظہار عمر بڑھنے اور کینسر میں ایک اہم کردار ادا کرتا ہے، سیلولر سنسنی کے دوران کم ہوتا ہے اور oncogenesis کے دوران زیادہ متاثر ہوتا ہے۔ TRF2 کو زیادہ متاثر کرنے والے کینسر اکثر خراب تشخیص کی نمائش کرتے ہیں۔ کینسر کے خلیات میں، TRF2 متعدد افعال ادا کرتا ہے، بشمول ٹیلومیر پروٹیکشن اور غیر سیل خود مختار کردار، نو انجیوجینیسیس اور امیونوسوپریشن کو فروغ دینا۔puritans وٹامن سیہم یہاں اسکریننگ کی ایک اصل حکمت عملی پیش کرتے ہیں، جو چھوٹے مالیکیولز کی شناخت کے قابل بناتی ہے جو TRF2 اظہار کو کم یا بڑھاتے ہیں۔ فوڈ اینڈ ڈرگ ایجنسی (FDA) سے منظور شدہ دوائیوں کی ایک چھوٹی لائبریری کی اسکریننگ کرکے، ہم نے دو مالیکیولز (AR-A014418and alexidine-2HCl) کی نشاندہی کی جو ماؤس میں TRF2 اظہار کو کم کرکے ٹیومر کی نشوونما، نو انجیوجینیسیس اور امیونوسوپریشن کو متاثر کرتے ہیں۔ زینوگرافٹ ماڈل۔ یہ نتائج جارحانہ انسانی ٹیومر کے علاج کے لیے TRF2 اظہار کو کم کرنے کی کیموتھراپیٹک حکمت عملی کی حمایت کرتے ہیں اور TRF2 اظہار کی سطح کو ماڈیول کر کے ممکنہ اینٹی کینسر اور اینٹی ایجنگ مالیکیولز کی اسکریننگ کرنے کے قابل اس سیل پر مبنی پرکھ کی توثیق کرتے ہیں۔

مطلوبہ الفاظ:TRF2; کینسر عمر بڑھنے سیل پر مبنی اسکریننگ پرکھ؛ نو انجیوجینیسیس؛ مدافعتی دباؤ

مزید جاننے کے لیے براہ کرم یہاں کلک کریں۔

1. تعارف

ٹیلومیرس خصوصی نیوکلیوپروٹین ڈھانچے ہیں جو لکیری کرومو-سوم کے سروں پر پائے جاتے ہیں جو ٹیلومیر سے وابستہ عوامل جیسے ٹیلومیریز، شیلٹرن پروٹین کمپلیکس اور نان کوڈنگ ٹیلومیرک ریپیٹ پر مشتمل آر این اے [1] کے ذریعے ریگولیٹ ہوتے ہیں۔ جب مناسب طریقے سے ریگولیٹ کیا جاتا ہے، تو ٹیلومیرس کروموسوم کو عدم استحکام اور سنسنی سے بچاتے ہیں۔ ٹیلومیرک ڈی این اے شارٹ ایننگ پروگرام شدہ جسمانی نشوونما اور عمر بڑھنے کے حصے کے طور پر ہوتا ہے [2]۔ تاہم، ضرورت سے زیادہ ٹیلومیر ڈی این اے کو شارٹ کرنا نایاب پروجیرایڈ سنڈرومز کو چلاتا ہے، جیسے ڈیسکریٹوسس کنجینا [3]۔ مزید برآں، غیر منظم ٹیلومیر ریاستیں متعدد بیماریوں میں ملوث ہیں جو عام آبادی میں عام ہیں، جن میں کینسر کی تقریباً تمام اقسام اور کئی انحطاطی بیماریاں شامل ہیں [4]۔ اس طرح، مخصوص ٹیلومیر اجزاء کو نشانہ بنانے کے لیے فارماسولوجیکل علاج تیار کرنا ایسی بیماریوں کی روک تھام اور علاج کے لیے امید افزا ہے۔

جہاں تک ٹیلومیر اور کینسر کا تعلق ہے، اہم ڈی این اے ڈیمیج رسپانس (DDR) چیک پوائنٹس کبھی کبھی ناکام ہو جاتے ہیں۔ یہ ضرورت سے زیادہ ٹیلومیرک ڈی این اے کو مختصر کرنے اور غیر معمولی کروموسوم کی دوبارہ ترتیب کا باعث بن سکتا ہے، جو بدلے میں آنکوجینیسیس میں حصہ ڈال سکتا ہے۔ مزید برآں، تمام کینسروں میں سے تقریباً 90 فیصد کی نشوونما میں ٹیلومیریز کا اپ گریجولیشن ایک اہم واقعہ ہے، کیونکہ یہ کینسر کے خلیات کو لامحدود ترقی دے سکتا ہے [5]۔ اس وجہ سے، ٹیلومریز کی روک تھام کینسر کے علاج کو تیار کرنے کی کوشش کرنے والے متعدد مطالعات کا ہدف رہا ہے [6]۔ حالیہ پیش رفت کے باوجود، اینٹی ٹیلومیریز ادویات کے طبی استعمال میں کچھ حدود ہیں۔ مثال کے طور پر، کینسر کے خلیات کے پھیلاؤ کو روکنے کے لیے، ایک انتہائی مختصر ٹیلومیرک ڈی این اے کی لمبائی تک پہنچنا ضروری ہے، اور p53 ٹیومر سپر-پریسر جین [7,8] کی عدم موجودگی میں چھوٹے ٹیلومیرس کے اینٹی آنکوجینک اثرات ختم ہو جاتے ہیں۔ یہ وقفہ وقفہ علاج کی افادیت کو کم کرتا ہے اور سیل کی تجدید کو محدود کرکے اور متبادل بحالی پر مبنی ٹیلومیر ایلوگیشن میکانزم [9,10] کو چالو کرنے کی حمایت کرکے عمر بڑھنے کے ضمنی اثرات کو بڑھاتا ہے۔sistancheلہذا، اینٹی ٹیلومیریس حکمت عملی کینسر کے خلیات کو نشانہ بنانے کے لیے بہتر موزوں ہو سکتی ہے جو پہلے سے ہی انتہائی مختصر ٹیلومیرز [11] کو محفوظ رکھتے ہیں۔

ٹیلومیریز کے علاوہ، شیلٹرن کمپلیکس ذیلی یونٹس (TRF1,TRF2,RAP1,TIN2,TPP1 اور POT1) کے اظہار اور سرگرمیوں میں تبدیلیاں ٹیوموریجینیسیس میں شامل ہیں، اور بعض صورتوں میں آزادانہ طور پر ٹیلومیر کی لمبائی [12-16]۔ اس طرح، کینسر کے علاج کے لیے شیلٹرن کو نشانہ بنانا اینٹی ٹیلومیریز مداخلتوں کا ایک دلچسپ متبادل ہو سکتا ہے۔ شیل ٹیرن سبونائٹ TRF2 ایک دلچسپ امیدوار کی نمائندگی کرتا ہے۔ TRF2 کینسر اور عروقی خلیوں دونوں میں متعدد انسانی خرابیوں میں زیادہ متاثر ہوتا ہے اور یہ عام طور پر خراب تشخیص [17-20] سے وابستہ ہوتا ہے۔ خاص طور پر، TRF2 اوور ایکسپریشن ٹیومرجنیسیس غیر سیل کو خود مختار طور پر فروغ دے سکتا ہے، جس سے امیونوسوپریشن اور نو انجیوجینیسیس ہوتا ہے ہیپران سلفیٹ پروٹیوگلائکنز کے اظہار کو تبدیل کرکے، TRF2 TLR2 راستے [21] کے ذریعے مائیلائیڈ سے حاصل کردہ دبانے والے خلیات (MDSCs) کو براہ راست بھرتی اور متحرک کرتا ہے۔ جب کہ کینسر کے خلیوں میں TRF2 اوور ایکسپریشن HSPG ترکیب کے ضابطے کے ذریعے ٹیومر مائیکرو ماحولیات میں NK سیل کی بھرتی کو سختی سے روکتا ہے[13]، TMSC کی TLR2 ایکٹیویشن TRF2 کی حد سے زیادہ کارکردگی کی وجہ سے NK بیمار سیل امیونوس کی ایک طاقتور روک تھام کا باعث بنتی ہے۔ NK خلیوں کی تنزلی، IFNgamma کی پیداوار اور قتل [21]۔cistanche کیا ہےاس طرح، TRF2 اوور ایکسپریشن MDSC پر منحصر امیونوسوپریسی مائیکرو ماحولیات کی تشکیل کے ذریعے NK خلیوں کی بھرتی اور بالواسطہ NK خلیوں کی فعالیت کو براہ راست روک کر اینٹی ٹیومر امیونو سرویلنس کے ابتدائی مرحلے کو مضبوطی سے روکتا ہے۔ اس کے نتیجے میں، کینسر میں TRF2 کو نشانہ بنانا سیل-خود مختار اور غیر سیل-خود مختار عمل کے ذریعے حواس کو فروغ دینے کے ساتھ ساتھ نو انجیوجینیسیس اور مدافعتی فرار کو نقصان پہنچا کر ایک قابل قدر ملٹی ہٹ حکمت عملی ہو سکتی ہے۔

cistanche عمر مخالف کر سکتے ہیں

آج تک، تمام شناخت شدہ چھوٹے مرکبات جو TRF2 کو نشانہ بناتے ہیں ڈی ڈی آر سے کروموسوم کے سروں کی حفاظت کرنے کی صلاحیت کو نقصان پہنچاتے ہیں اس طرح عمر بڑھنے کے ممکنہ ضمنی اثرات [22] کے ساتھ۔ ہمارے پچھلے کام نے یہ ظاہر کیا ہے کہ TRF2 اظہار کی جزوی کمی ڈی ڈی آر [13] کو شامل کیے بغیر، غیر سیل خود مختار اثرات کے ذریعے ماؤس ماڈلز میں ٹیومرجنیسیٹی کو ریورس کر سکتی ہے۔ لہذا ہم نے یہ استدلال کیا کہ کینسروں میں اضافی TRF2 کو کم کرنے پر توجہ مرکوز کرنا اس کے اوور ایکسپریشن کے نتیجے میں بڑھاپے کے ضمنی اثرات کے بغیر کینسر کے علاج کے لئے ایک دلچسپ حکمت عملی ہوسکتی ہے۔ اس مطالعہ میں، ہم TRF2 استحکام کو نشانہ بنانے والے چھوٹے کم پاؤنڈ کی شناخت کے لیے ایک اصل اسکریننگ پلیٹ فارم پیش کرتے ہیں۔ ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ دو ٹاپ ہٹس نے TRF2 اوور ایکسپریشن کی ٹیومرجینک سرگرمی کو روکا۔ اس مطالعے نے یہ ظاہر کیا کہ TRF2 اظہار کو فارماسولوجیکل طور پر ماڈیول کیا جا سکتا ہے اور یہ کہ ہماری اسکریننگ پرکھ دوائیوں کے انتخاب کے لیے ایک قابل اعتماد طریقہ ہے جو TRF2 کے اظہار کی سطح کو ماڈیول کرنے کے قابل ہے، جس میں ممکنہ انسداد کینسر اور عمر بڑھنے کی خصوصیات ہیں۔

2. مواد اور طریقے 2.1.Cells

انسانی برانن گردے (HEK)293-T خلیات (ATCC CRL-1573) اور BJ-HELTRAs خلیات[13] Dulbecco کے Modified Eagles Medium (DMEM) (Lonza, Levallois Perret, France) میں بڑھے تھے 10 فیصد فیٹل کاف سیرم (FCS)، 100 IU/mL پینسلن اور 100ug/mL streptomycin（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）۔

2.2.SDS-PAGE اور ویسٹرن بلاٹنگ

کل سیل لائسیٹس تیار کیے گئے تھے، الیکٹروفورسس کے ذریعے الگ کیے گئے تھے اور جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا، داغدار کیا گیا تھا [14]۔ مختصراً، خلیات کی کٹائی کی گئی اور لیسیز بفر (8.76 g/L NaCl 10 mM Tris-HCL pH7.2،0.1 فیصد SDS،0.1 فیصد Triton X -100,10 g/L سوڈیم ڈیوکسائکولیٹ، 5 ایم ایم ایتھیلینیڈیامینیٹیٹراسیٹک ایسڈ (EDTA)، 1{{50} ug/mL لیوپیپٹائن، 1 mM AEBSF اور 19 ug/mL aprotinin)۔ اس کے بعد بی سی اے پروٹین پرکھ کٹ (انٹرچم، مونلوکن، فرانس) کا استعمال کرتے ہوئے نمونوں کو ٹائٹریٹ کیا گیا۔ نمونے (60 ug/لین) کو لوڈنگ بفر میں 5 منٹ کے لیے 95 ڈگری پر گرم کیا گیا تھا (500 mM Tris-HCl، 100 mM DTI، 2 فیصد SDS، 0.1 فیصد بروموفینول بلیو، 10 فیصد گلیسرول pH 6.8)۔ اس کے بعد نمونوں کو 10 فیصد پولی کریلامائڈ جیلوں پر لوڈ کیا گیا اور 160 V پر 45 منٹ تک چلایا گیا۔ پھر پروٹینز کو ٹرانس بلاٹ ایس ڈی سیمی ڈرائی الیکٹروفورٹک ٹرانسفر سیل (بائیو-ڈرائی) کا استعمال کرتے ہوئے اموبیلون-FL جھلیوں (ملی پور، اپسٹیٹ نیویارک، امریکہ) میں منتقل کیا گیا۔ Rad, Hercules, CA, USA) انٹرسیپٹ بلاکنگ بفر (LI COR, Lincoln, NE, USA) میں پرائمری اینٹی باڈیز (mouselgGl anti-TRF2) کے مرکب کے ساتھ 4 ڈگری پر رات بھر انکیوبیشن سے پہلے جھلیوں کو 1 گھنٹے کے لیے بلاک کر دیا گیا تھا: 250؛ اور خرگوش IgGanti-Beta-actin 0.5 فیصد Tween20 پر مشتمل انٹرسیپٹ بلاکنگ بفر میں 1:10،000) پر پتلا ہوا۔ پی بی ایس 0.1 فیصد ٹوین 20 میں دھونے کے بعد، انٹرسیپٹ بلاکنگ بفر میں کمرے کے درجہ حرارت پر جھلیوں کو 1 گھنٹہ تک انکیوبیٹ کیا جاتا تھا جس میں ثانوی اینٹی باڈیز کے مرکب کے ساتھ 0.25 فیصد ٹوین 20 ہوتا تھا: اینٹی ٹی آر ایف 2 اینٹی باڈی کے لیے بکری اینٹی ماؤس IRDye 680 اور بکری اینٹی خرگوش IRDye اینٹی بیٹا ایکٹین اینٹی باڈی کے لیے 800CW (1:15،000 کمزوری)۔اینٹی ایجنگ cistancheپرائمری اور IRDye سیکنڈری اینٹی باڈیز جو استعمال کی گئی تھیں ذیل میں اینٹی باڈی ٹیبل (ٹیبل 1) میں درج ہیں۔ آخر میں، پروٹین بینڈ کو LiCor Odyssey 9120 امیجنگ سسٹم (LI-COR) کا استعمال کرتے ہوئے تصور کیا گیا۔ TRF2 اظہار کو ایکٹین بینڈ اور پس منظر کی شدت سے TRF2 بینڈ کی شدت کو معمول پر لا کر ماپا گیا۔

2.3.کلوننگ کی حکمت عملی

انسانی TRF2 cDNA ترتیب کو lentiviral SFFV-GPR پلازمیڈ کی BamHI/BclI پابندی والی جگہوں کے درمیان کلون کیا گیا تھا جو کہ HIV-SFFV-GFP-WPRE مشتق ہے [23]۔ SFFV-GPR پلازمیڈ میں ایک سپلین فوکس بنانے والا وائرس (SFV) پروموٹر ہوتا ہے جو ایک GPR پولی سیسٹرونک جین کو کنٹرول کرتا ہے جس میں گرین فلوروسینٹ پروٹین (GFP) کے لیے cDNA کی ترتیب، ایک puromycin ریزسٹنس پروٹین اور Tag-red fluorescent پروٹین (RFP)-T (S158) شامل ہوتا ہے۔ -RFP)، ہر ایک کو E2 اور T2 Picornaviridae تسلسل سے الگ کیا گیا ہے۔ hTRF2 cDNA RFP-T کے C-ٹرمینل خطے میں داخل کیا گیا تھا، تاکہ RFP-TRF2 فیوژن پروٹین کے اظہار کو قابل بنایا جا سکے۔

2.4.لینٹیوائرس کی پیداوار

لینٹیو وائرس کی پیداوار کے لیے، 5 × 10* HEK 293-T خلیات کو 8.6 ug خالی SFFV-GPR یا RFP-TRF2- ظاہر کرنے والے SFFV-GPR ویکٹر، 8.6 ug Lenti کے ساتھ منتقل کیا گیا تھا۔ ڈیلٹا 8.91 اور VSV-g کا 2.8 ug بذریعہ کیلشیم فاسفیٹ ثالثی ٹرانسفیکشن۔ منتقلی شدہ خلیوں کو DMEM میں 37 ڈگری پر 10 فیصد FCS کے ساتھ 10- سینٹی میٹر ڈشز میں 5 فیصد CO2 کے ساتھ کلچر کیا گیا تھا۔ نئے بنائے گئے وائرس پر مشتمل سپرنٹینٹس 48 گھنٹے کے بعد جمع کیے گئے، پھر 045-μm ملی پور فلٹر سے گزرے۔ وائرس ٹائٹریشن کے بعد، BJ-HELTRAs سیل لائن کو متاثر کرنے کے لیے 1∶1 （virus∶cell） کا تناسب استعمال کیا گیا، جسے TRF2 کے نقائص کے خلاف مزاحمت کے لیے منتخب کیا گیا[13]۔cistanche befíciosایک کلون جس نے GFP اور فیوزڈ RFP-TRF2 پروٹین کو اعتدال پسند سطح پر ظاہر کیا اس کے بعد فلوروسینس ایکٹیویٹڈ سیل چھانٹ (FACS) کے ذریعہ الگ تھلگ کیا گیا۔

2.5. فلو سائٹومیٹری اسکریننگ

BJ-HELTRAs کلونل لائن سیلز جن میں SFFV-GPR ویکٹر ہوتا ہے اور RFP-TRF2 فیوژن پروٹین کا اظہار کرتے ہیں ان کو DMEM میڈیم میں 10 فیصد FCS اور 1 فیصد پینسلن/سٹریپٹومائسن کے ساتھ مل کر 96-وییل پلیٹوں میں کلچر کیا گیا تھا۔ منشیات کے علاج کے 24 گھنٹے کے بعد، خلیات کو پھر ٹرپسنائز کیا گیا اور فاسفیٹ بفرڈ نمکین (PBS) میں دھویا گیا جس میں 0.5 mM EDTA اور 2 فیصد FCS تھا، 0.5 فیصد formaldehyde (FA) کے ساتھ طے کرنے سے پہلے۔ فکسڈ سیلز کو پھر نشانہ بنایا گیا۔ FacsCalibur ہائی تھرو پٹ سیمپلر (BD Biosciences، Franklin Lakes, NJ, USA) کا استعمال کرتے ہوئے سائٹومیٹری کو بہاؤ۔

2.6.Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR)

کل RNA کو RNeasy Mini Kit (کیجین، وینلو، نیدرلینڈز) کا استعمال کرتے ہوئے الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ ریورس ٹرانسکرپشن سپر اسکرپٹ II ریورس ٹرانسکرپٹیس (انویٹروجن) کا استعمال کرتے ہوئے کل RNA کے 1 ug کے ساتھ انجام دیا گیا تھا۔ ہر جین کے اظہار کو GAPDH کے مطابق معمول بنایا گیا تھا۔ مندرجہ ذیل پرائمر استعمال کیے گئے تھے: hTRF2 Fw 5'-GCTGCCTGACTIGAACAGT-3';hTRF2 Rv 5'-CCGTTCTCAACCAACCCTC-3';hGAPDHFw5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'hCCCCATCGCTCAGACAC-3'hCCGACCTGATGACAGT-3' 14}}۔ 2.7.AlamarBlue

ایک 96-کنویں کی فلیٹ نیچے پلیٹ میں، 5 × 103 سیل فی کنویں کو 200 uL DMEMsup میں سیڈ کیا گیا- 10 فیصد FCS کے ساتھ۔ منشیات کے علاج کے بعد 24 گھنٹے پر، AlamarBlue (Bio-Rad) کا 10 uL شامل کیا گیا اور ایک Spectrostar Nano پلیٹ ریڈر (BMGLabtech، Ortenberg، Germany) میں 36 گھنٹے کے لیے جذب کی پیمائش 570 nm اور 600 nm کی گئی۔ AlamarBlue کی آکسیکرن کمی فیصد کا تعین جیسا کہ مینوفیکچرر نے کیا ہے۔

2.8۔جانور

تجربات جانویئر لیبز (فرانس) سے 8- سے 12- ہفتہ پرانے NMRI عریاں مادہ چوہوں پر کیے گئے۔ ماؤس کے تمام تجربات مقامی اور بین الاقوامی ادارہ جاتی رہنما خطوط کے مطابق کیے گئے تھے اور انہیں یا تو IRCAN کی اینیمل کیئر کمیٹی اور علاقائی (CIEPAL Cote d'Azur #187 اور #188) اور قومی (فرانسیسی وزارت برائے تحقیق #03482.01/02482.2) نے منظور کیا تھا۔ اور #02973.01/02973.2) حکام۔

2.9.ٹیومر کی نشوونما کے تجربات

ہر NMRI عریاں ماؤس کو 1 x 106 BJ-HELTRAs خلیات کے ساتھ پیچھے میں ذیلی طور پر انجکشن لگایا گیا تھا جس میں 100 μL PBS （n=8 چوہوں فی گروپ） میں معطل کیا گیا تھا۔ چوہوں کا علاج 16، 18، 20 اور 22 دنوں میں DMSO کے 100 uL (45 فیصد)، alexidine-2HCl (1 mg/kg) یا AR-A014418 (5 mg/kg) کے انٹراپریٹونیئل انجیکشن کے ساتھ کیا گیا۔ پھر 26 دن تک فالو اپ کیا گیا۔ ٹیومر کی ظاہری شکل کا اندازہ ہر روز دھڑکن کے ذریعے کیا جاتا تھا۔ ٹیومر کا سائز ہر 2-3 دن میں کیلیپر کا استعمال کرتے ہوئے ناپا جاتا تھا۔ اس کے بعد ٹیومر کے حجم کا تعین hemi-ellipsoid فارمولے کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا: π×(L×1× h)/6، جہاں L لمبائی، I چوڑائی اور h ٹیومر کی اونچائی سے بالترتیب مساوی ہے۔

2.10۔Matrigel پلگ اسیس

BJ-HELTRAs خلیوں کا علاج DMSO (1 فیصد)، alexidine-2HCl (1 uM) یا AR-A014418 （10 μM） کے ساتھ 2 دن تک کیا گیا۔ پھر، پی بی ایس میں معطل شدہ 1 × 10 ڈگری کے علاج شدہ خلیوں کے 100 μL ساتھ ساتھ 400 uL گروتھ فیکٹر سے کم میٹریجل (کارننگ، نیو یارک، USA) کو آئسوفلورین اینستھیزیا کے تحت NMRI عریاں چوہوں کے پچھلے حصے میں ٹیکہ لگایا گیا۔ ٹیکہ لگانے کے بعد 5ویں دن، میٹریجل پلگس کی کٹائی کی گئی، اور دراندازی کرنے والے خلیوں کو 37 ڈگری پر 30 منٹ کے لیے ڈسپیس (کارننگ)، کولیگنیس A (روشے، بیل، سوئٹزرلینڈ) اور DNAseI (Roche) ہاضمہ کے ذریعے انزیمیٹک تحلیل کے ذریعے جمع کیا گیا۔ ] سیلز کو 15 منٹ تک برف پر Fe-Block اینٹی CD16/CD32 اینٹی باڈیز (کلون 2.4G2) کے ساتھ 30 منٹ تک 4 ڈگری پر سیر کیا گیا تھا۔ استعمال شدہ کنججٹیڈ اینٹی باڈیز اینٹی باڈی ٹیبل میں درج ہیں۔ سیلز PBS میں 0.5 mM EDTA، 2 فیصد FCS اور 0.5 فیصد FA کے ساتھ دھوئے گئے تھے۔ DIVA6 سافٹ ویئر (BD Biosciences) اور FlowJo 10 (LLC) کے ساتھ ARIA III cytometer کا استعمال کرتے ہوئے داغدار خلیوں کا تجزیہ کیا گیا۔

2.11۔اعداد و شمار

تمام گراف اور شماریاتی تجزیے GraphPad Prism سافٹ ویئر (San Diego,CA,USA) کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیے گئے تھے۔تمام نتائج کو اوسط ± معیاری انحراف (sd) یا اوسط ± معیاری غلطی (SEM) کے طور پر پیش کیا گیا ہے۔ ذرائع کے درمیان اہم اختلافات کا تعین مان-وٹنی دو دم والے ٹیسٹ کے ذریعے کیا گیا۔ ٹیومر لینے کا تعین کرنے کے لیے لاگ رینک (Mantel-Cox) ٹیسٹ استعمال کیا گیا تھا۔ ہر ٹیسٹ کے لیے، پی<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. نتائج

3.1.TRF2 روکنے والے مالیکیولز کی شناخت

TRF2 پروٹین کی سطح کو ماڈیول کرنے کی صلاحیت رکھنے والی دوائیوں کی اسکریننگ کے لیے، ہم نے TRF2 کے N-ٹرمینس میں فیوز ہونے والے GFP جین اور RFP کو باہم نقل کرنے کے لیے ایک لینٹیو وائرل سسٹم کا استعمال کیا۔ دوسری جگہوں پر بیان کردہ ایک عمومی حکمت عملی کے بعد [23]، ہم نے ایک GRT lentivirus بنایا، جس میں SFFV پروموٹر نے پولی سیسٹرونک جین انکوڈنگ GFP، ایک puromycin ریزسٹنس پروٹین اور RFP-TRF2 یا RFP کو صرف ایک کنٹرول کے طور پر کنٹرول کیا (شکل) 1A)۔ اس کے نتیجے میں ، تمام منتقلی خلیوں نے GFP اور RFP-TRF2 دونوں کا اظہار کیا۔ یہ نظام ایسی دوائیوں کی نشاندہی کرنے کے لیے ڈیزائن کیا گیا تھا جو TRF2 اظہار کو ماڈیول کرتی ہیں، بہاؤ سائٹومیٹری کا استعمال کرتے ہوئے RFP کی شدت کی پیمائش کر کے، جبکہ GFP کی شدت رپورٹر کی تعمیر کی نقل کے لیے اندرونی کنٹرول کے طور پر کام کرتی ہے۔

ہم نے GRT lentiviruses کو انسانی BJ-HELTRAs fibroblasts میں تبدیل کیا جو SV40 اور hTERT کے ذریعے امر کر دیا گیا تھا اور Ras v12[13] کے ذریعے آنکوجینک بنا دیا گیا تھا۔ TRF2 کے اوپر اور نیچے کے دونوں ضابطوں کی پیمائش کو آسان بنانے کے لیے، ایک puromycin مزاحم کلون جس نے GFP اور RFP-TRF2 پروٹین دونوں کا اعتدال سے اظہار کیا تھا اسے FACS چھانٹی کا استعمال کرتے ہوئے الگ تھلگ کیا گیا تھا اور اسے GRI-BJ-HELTRAs (شکل 1A) کا نام دیا گیا تھا۔ ایک مثبت کنٹرول کے طور پر، ہم نے GRT-BJ-HELTRAs خلیوں کا علاج 10 uM gemcitabine کے ساتھ کیا، جو کہ TRF2 stabil-ity [24] کا پہلے بیان کردہ ماڈیولر ہے، 24 گھنٹے کے لیے۔ اگرچہ خالی ویکٹر کے ساتھ منتقل ہونے والے خلیوں میں RFP ماڈیولیشن کا پتہ نہیں چل سکا، RFP/GFP مطلب فلوروسینس شدت (MFI) کے تناسب میں ایک نمایاں کمی DMSO-علاج شدہ کنٹرول کے مقابلے GRT-BJ-HELTRAs خلیوں میں دیکھی گئی۔ کنٹرول کے؛ پی<0.0001)(figure 1b).moreover,="" gemcitabine="" specifically="" diminished="" rfp-trf2="" protein="" levels="" without="" affecting="" gfp="" levels="" (figure="" s1a).="" of="" note,="" we="" observed="" here="" that="" gemcitabine="" is="" reducing="" trf2="" level="" in="" contrast="" to="" the="" published="" work[24],="" a="" difference="" that="" may="" be="" explained="" by="" cell="" type="" differences="" in="" the="" dna="" damage="" response="" induced="" by="" gemcitabine="" since="" trf2="" stability="" can="" be="" altered="" in="" a="" p53-dependent="" manner="" [25].="" this="" effect="" was="" further="" confirmed="" by="" western="" blotting="" analyses="" where="" we="" observed="" that="" endogenous="" trf2="" levels="" were="" affected="" by="" gemcitabine="" treatment="" on="" untrans-duced="" bj-heltras="" cells="" (figure="" s1b).therefore,="" grt-bj-heltras="" cells="" enabled="" detection="" of="" specific="" variations="" in="" trf2="" protein="" levels="" induced="" by="" drug="" treatment.="" or="" gemcitabine="" (right="" panel)(n=""><0.001;two-tailed student'st="" test).="" (c)representative="" rfp/gfp="" flow="" cytometry="" plots="" of="" trf2="" vector-transduced="" bj-heltras="" cells="" treated="" with="" 10="" um="" of="" alexidine-2hcl,="" ar-a014418="" or="" dmso="" (left="" panel).="" box-plot="" quantification="" of="" rfp-trf2="" fusion="" (trf2="" vector)="" proftein="" levels="" following="" treatment="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418(right="" panel)(n=""><0.05;mann-whitney test).(d)representative="" western="" blotting="" showing="" reduced="" trf2="" protein="" levels="" following="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" in="" untransduced="" bj-heltras="" cells="" (left="" panel;="" full="" western="" lolotting="" image="" is="" presented="" in="" figure="" s2a).="" quantification="" of="" trf2="" protein="" levels="" after="" treatment="" with="" 10="" μm="" alexidine-2hccl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" （right="" panel)(n="2;mean" +="" standard="" error="" of="" the="" mean).(e)quarntification="" of="" trf2="" mrna="" levels="" analyzed="" by="" rt-qpcr="" after="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="">

فلو سائٹومیٹری کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے پھر 396 فوڈ اینڈ ڈرگ ایڈمنسٹریشن (ایف ڈی اے) کے منظور شدہ فارماسولوجیکل مرکبات کی اسکریننگ کی جو حیاتیاتی عمل کی چھ اہم اقسام کو نشانہ بنانے کے قابل ہیں: آئن چینلز، فاسفیٹیز، کنیز، ایپی جینیٹک عوامل، نیوکلیئر ریسیپٹر لیگنڈز اور Wnt SC1 وے .GRT-BJ-HELTRAs خلیات کا علاج سب سے پہلے 396 مرکبات میں سے ہر ایک میں سے 10 uM یا DMSO سے 24 گھنٹے پہلے فلو سائٹومیٹری تجزیہ (فگر S1D) سے کیا گیا تھا۔ اس معاملے میں، 84 مرکبات TRF2 پروٹین کی سطح کو ماڈیول کرنے کے لیے پائے گئے (فگر S1D، دائیں پینل؛ ٹیبل S1)، اور اسے سیکنڈری اسکرین کے لیے استعمال کیا گیا (فگر S1E؛ ٹیبل S1)۔ اس ثانوی اسکرین میں، 10 um منتخب مرکبات کے ساتھ GRT-BJ-HELTRAs خلیات کا علاج کرنے کے علاوہ، خالی ویکٹر کے ساتھ منتقلی BJ-HELTRAs خلیات یا BJ-HELTRAs خلیات کے ساتھ بھی ایسا ہی سلوک کیا گیا تاکہ غلط مثبت خارج ہونے والے ٹنگ ریڈ کو خارج کیا جا سکے۔ یا سبز آٹو فلوروسینس یا RFP یا GFP پروٹین کو متاثر کرنے والا۔ اس کے بعد مغربی بلوٹنگ (فگر S2A، B ٹیبل S1) کی بنیاد پر، غیر منتقلی BJ-HELTRAs خلیات میں endoge nous TRF2 کے اظہار کو ماڈیول کرنے کی ان کی صلاحیت کا تعین کرنے کے لیے 18 بہترین کام پاؤنڈز کا انتخاب کیا گیا۔ ہم نے ہٹ کی تعریف TRF2 کی کم از کم 20 فیصد خوراک (یا اوپر یا نیچے) کے مرکبات کے طور پر کی۔ ان معیارات کا استعمال کرتے ہوئے، مغربی بلوٹنگ کے ذریعے جانچی گئی 18 دوائیوں میں سے، ان میں سے 9 میں کمی ہوئی اور ایک میں endogenous TRF2 پروٹین کی سطح میں اضافہ ہوا (Figure S2A، Table S1) پھر ہم نے Vivo تجربات میں ان دوائیوں میں سے دو مرکبات کا انتخاب کرنے کا فیصلہ کیا تاکہ اس بات کا تعین کیا جا سکے کہ آیا وہ ان دوائیوں کو استعمال کر سکتے ہیں۔ TRF2 اوور ایکسپریشن کے پرو آنکوجینک اثرات کا مقابلہ کریں۔ غیر ٹیومرجینک خلیوں میں DDR ایکٹیویشن اور ضمنی اثرات سے بچنے کے لیے، ہم نے ایسے مرکبات کا انتخاب کیا جو نہ تو سب سے زیادہ اور نہ ہی کم ترین سطح پر TRF2 کی خوراک۔ ان میں سے، AR اور AD ان معیارات کے مطابق تھے۔ دونوں مرکبات نے GRT-BJ-HELTRAs خلیات میں RFP-TRF2 کو گھٹا دیا جیسا کہ فلو سائٹومیٹری (فگر 1C)، اینڈوجینس TRF2 پروٹین لیولز جیسا کہ ویسٹرن بلوٹنگ تجزیہ (شکل 1D؛ فگر S2A،B) اور TERF2 mRNA لیول کا تعین کرتا ہے۔ -qPCR (شکل 1E)۔ مزید برآں، AR اور AD کے متعلقہ LD50 ارتکاز کے ساتھ علاج نے BJ-HELTRAs دونوں خلیوں میں اور TRF2-اوور ایکسپریس کرنے والے BJ-HELTRAs خلیات (شکل S3A-C) میں TERF2 mRNA اظہار کو کم کیا۔

3.2.AR-A014418 اور Alexidine-2HCl نے اعلی TRF2 اظہار کی سطحوں کے ذریعہ عطا کردہ ٹیومرجنیسیٹی کو تبدیل کر دیا

اس کے بعد ہم نے ٹیومر کی نشوونما پر AR اور AD کے اثرات کا جائزہ لیا۔ TRF2-زیادہ متاثر کرنے والے کینسروں کو نشانہ بنانے کی ان کی صلاحیت کو کنٹرول کرنے کے لیے، ہم نے BJ-HELTRAs سیلز اور TRF2-اوور ایکسپریسنگ BJ-HELTRAs سیل دونوں پر AR اور AD کے ممکنہ اینٹی ٹیومرجنک اثرات کا تجزیہ کیا۔ BJ-HELTRAs خلیوں کو TRF2lentiviral ویکٹر یا خالی ویکٹر کے ساتھ منتقل کیا گیا تھا، پھر عریاں چوہوں میں subcutaneously انجکشن لگایا گیا تھا۔ اس کے بعد چوہوں کا علاج DMSO، 1 mg/kg AD یا 5 mg/kg AR کے ساتھ 16,18,20 اور 22 پوسٹ انجیکشن [26,27] (شکل 2A) میں کیا گیا۔ جیسا کہ پہلے بتایا گیا ہے [13,21]، TRF2 اوور ایکسپریشن نے ٹیومر ini کو فروغ دیا۔ Vivo میں تعلق اور نمو (شکل 2B-D؛ p<0.05). treatment="" with="" neither="" ar="" nor="" ad="" impacted="" tumor="" volume="" in="" bj-heltras="" cells="" transduced="" with="" the="" empty="" vector="" (figure="" 2e,="" upper="" panels)="" neither="" tumor="" growth="" rate(figure="" 2f-h).="" by="" contrast,="" both="" drugs="" induced="" a="" significant="" decrease="" in="" the="" tumor="" volume="" of="" trf2-overexpressing="" xenografted="" tumors,="" leading="" to="" significantly="" smaller="" tumor="" sizes="" at="" day="" 26="" (figure="" 2e,middle=""><001)but also="" of="" the="" tumor="" growth="" rate="" (figure="" 2f-h)="" at="" each="" time-point.="" furthermore,="" the="" vol-ume="" and="" growth="" rates="" of="" trf2-overexpressing="" tumors="" treated="" by="" the="" two="" drugs="" returned="" to="" levels="" similar="" to="" those="" of="" the="" control="" tumors,="" thus="" demonstrating="" the="" trf2-specific="" selectivity="" of="" ar="" and="" ad="" (figure="" 2e,lower="" panels).these="" results="" show="" that="" ar="" and="" ad="" treatment="" reversed="" specifically="" the="" tumorigenicity="" conferred="" by="" trf2="" overexpression.="" or）="" were="" injected="" subcutaneously（1×10°cells/100μl）into="" nmri="" nude="" mice.="" the="" mice="" were="" then="" treated="" with="" dmso,alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)="" or="" ar-a014418(5="" mg/kg)="" at="" days16,18,20="" and="" 22="" post-injection,="" then="" followed="" up="" until="" day="" 26="" (n="8" mice="" per="" group).(b-d)="" the="" percentage="" of="" tumor-free="" mice="" (b)="" and="" tumor="" volumes(c)="" were="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" in="" mice="" injected="" with="" bj-heltras="" cells="" overexpressing="" trf2(trf2="" vector)="" or="" empty="" vector.="" tumor="" take="" based="" on="" palpability="" was="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" and="" is="" represented="" as="" a="" percentage="" of="" tumor-free="" mice.p="" values="" were="" determined="" using="" the="" log-rank="" mantel-cox="" test(*=""><0.05). tumor="" volumes="" were="" assessed="" at="" different="" time-points="" (mean="" ±="" standard="" deviation);="" tumor="" volume="" at="" d.ay="" 15="" is="" represented="" in="" (d).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><0.001). (e)="" tumor="" volumes="" were="" followed="" as="" in="" (c)="" after="" repetitive="" treatments="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg),="" or="" ar-a014418(5mg/kg).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><0.0001;ns: not="" significant).(f-h)="" tumor="" growth="" rate="" of="" ar-a014418(5mg/kg)treated="" mice(f,h)="" or="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)(g,h)="" treated="" mice="" were="" determined="" by="" considering="" the="" last="" day="" before="" treatment="" for="" empty="" vector="" or="" trf2="" vector="" as="" 100%.="" variations="" of="" the="" growth="" rate="" in="" both="" treatments="" over="" the="" time="" are="" represented="" in="" (f,g)="" and="" for="" each="" time-point="" (h).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><>

3.3.AR-A014418 اور Alexidine-2HCI کاونٹریکٹڈ TRF2-انحصار امیونوسوپریشن اور نو انجیوجینیسیس

اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا AR اور AD کے اینٹیٹیمر اثرات TRF2 کی غیر سیل خود مختار آنکوجینک خصوصیات کو نشانہ بنا سکتے ہیں، ہم نے علاج شدہ ٹیومر میں مدافعتی خلیوں کی دراندازی اور ایکٹیویشن کے ساتھ ساتھ انجیوجینیسیس کا بھی جائزہ لیا۔ ہم نے معیاری اور TRF2-اوور ایکسپریسنگ BJ-HELTRAs سیلز (Figure S3A) کا 1 uM AD، 10 uM AR یا DMSO کے ساتھ 48 گھنٹے کے لیے میٹریجل کے ساتھ عریاں چوہوں میں ان کے ذیلی کیوٹینیئس انجیکشن سے پہلے علاج کیا۔ میٹریجل پلگ اس کے بعد انجیکشن کے 5 دن بعد جمع کیے گئے تاکہ فلو سائٹومیٹری (شکل 3A) کے ذریعہ ٹیومر مائکرو ماحولیات کا تجزیہ کیا جاسکے۔ جیسا کہ توقع کی گئی ہے [13,21]، TRF2 اوور ایکسپریشن نے عالمی مدافعتی سیل (CD45 پلس سیل) کی دراندازی (فگر 3B؛ فگر S4A) کو تبدیل نہیں کیا، لیکن قدرتی قاتل (NK) سیل کی بھرتی (فگر 3C؛ فگر S4B) اور NK فنکشن کو روکا -ality (Figure 3C-E؛ Figure S4C)، اور MDSC کی دراندازی میں اضافہ (شکل 3F)۔ TRF2-میں خاص طور پر BJ-HELTRAs خلیات کو زیادہ متاثر کرتے ہوئے، کسی بھی دوائی کے ساتھ علاج سے عالمی قوت مدافعت میں اضافہ ہوا (فگر 3B؛ فگر S4A)، نیز انٹرا ٹیومرل NK سیلز کی مقدار اور فعالیت (Figure 3C-E؛ شکل S4B,C)۔ خاص طور پر، دونوں دوائیوں نے TRF2 اوور ایکسپریشن (شکل 3C) کے ذریعہ این کے سیل ثالثی مدافعتی نگرانی (CD107a پلس اور CD69 پلس NK سیل) کی روک تھام کو مکمل طور پر بچایا۔ اس کا تعلق MDSC کی بھرتی میں ڈرامائی کمی (فگر 3F؛ فگر S4D) اور مونوکیٹس اور میکروفیجز (فگر 3G) کی بڑھتی ہوئی بھرتی کے ساتھ تھا۔

جیسا کہ پہلے رپورٹ کیا گیا تھا [14,20]، ٹیومر انجیوجینیسیس TRF2-اوور ایکسپریسنگ ٹیومر میں کنٹرول ٹیومر کے مقابلے زیادہ تھا۔ جب کہ TRF2 اوور ایکسپریشن نے ٹیومربڈ کے اندر CD31 پلس CD45-اینڈوتھیلیل سیلز کی مقدار میں اضافہ کیا (فگر 3H؛ فگر S4E)، کسی بھی دوا کے ساتھ علاج کے بعد خالی ویکٹر یا TRF2-اوور ایکسپریسنگ ٹیومر کے درمیان کوئی فرق نہیں پایا گیا۔ ing TRF2（TRF2 vector） یا خالی ویکٹر کا علاج 1uM alexidine-2HCl یا 10 μM AR-A014418 یا DMSO سے 2 دن پہلے میٹریگل (1 × 10 ڈگری سیلز) کے ساتھ ذیلی کٹے ہوئے انجیکشن سے NMRI (1 × 10 ڈگری سیلز) میں کیا گیا تھا۔ n=8)۔ اس کے بعد مدافعتی اور اینڈوتھیلیل سیل کی دراندازی کا اندازہ انجیکشن کے 5 دن بعد فلو سائٹومیٹری کے ذریعہ کیا گیا۔ (بی ایچ)۔ میٹریجل پلگ کی مدافعتی دراندازی کا فلو سائٹومیٹری تجزیہ۔ زندہ خلیوں کے درمیان میٹریجل پلگ میں گھسنے والے مدافعتی خلیوں کی تعداد دکھائی گئی ہے۔ ٹوٹل امیون سیل انفلٹریشن (CD45 پلس سیل) کو (B) میں دکھایا گیا ہے؛ قدرتی قاتل (NK) سیل (NKp46 پلس سیل) انفلٹریشن (C) میں دکھایا گیا ہے؛ چالو NK سیل (CD107a پلس اور CD69 پلس NK سیل) دراندازی کو (D,E) میں دکھایا گیا ہے؛ مائیلوڈ سے ماخوذ دبانے والے سیل (MDSC؛ CD11b پلس GR1 پلس)) دراندازی (F) میں دکھائی گئی ہے؛ مونوسائٹ میکروفیج انفلٹریشن (G) میں دکھائی گئی ہے اور اینڈوتھیلیل سیل انفلٹریشن کو (H) میں دکھایا گیا ہے۔ وٹنی ٹیسٹ (*p<><><0.001;n =="" 8="" mice="" per="">

4. بحث

یہاں، ہم ایسے مرکبات کے لیے اسکرین پر سیل پر مبنی پرکھ کی ترقی کی اطلاع دیتے ہیں جو ٹیلومیرک پروٹین TRF2 کے اظہار کو ماڈیول کرتے ہیں۔ FDA سے منظور شدہ مالیکیولز کی ایک چھوٹی لائبریری کی اسکریننگ کرکے، ہم نے ایسے مرکبات کی نشاندہی کی جو TRF2 اظہار کی سطح کو بڑھا یا گھٹا سکتے ہیں۔ ہم نے دریافت کیا کہ AD اور AR نے TRF2 کو کم کیا اور TRF2 کو زیادہ متاثر کرنے والے ٹیومر خلیوں کے لئے مخصوص اینٹی ٹیومرجینک سرگرمی کی نمائش کی۔ مزید ان کی TRF2-کی مخصوص سرگرمی کا مظاہرہ کرتے ہوئے، AR اور AD کے علاج نے TRF2 اوور ایکسپریشن کے ذریعے عطا کردہ امیونوسوپریشن اور نو انجیوجینیسیس کو بچایا۔ حیرت انگیز طور پر، حقیقت یہ ہے کہ AR یا AD کے علاج کے بعد TRF2 اوور ایکسپریسنگ ٹیومر کے لیے عالمی مدافعتی دراندازی میں اضافہ ہوتا ہے یہ بتاتا ہے کہ جب TRF2 کا زیادہ اظہار ہوتا ہے تو وہ ادویات مدافعتی ردعمل کو بڑھانے کے لیے زیادہ طاقتور ہوتی ہیں۔ وہ ادویات NK سیل کی فعالیت (CD107a اور CD69 پلس NK سیلز) کو بحال کرکے TRF2 اوور ایکسپریشن کے مدافعتی اثر کو روکتی ہیں اور MDSC کی دراندازی کو سختی سے کم کرتی ہیں۔ اس سے پتہ چلتا ہے کہ وہ دوائیں TRF2-انحصار مخصوص پروگرام کو ختم کرتی ہیں جو مدافعتی فرار اور مدافعتی دباؤ کو متحرک کرتی ہیں اور خطرے سے وابستہ مالیکیولز (DAMP) کے اخراج کو بڑھا سکتی ہیں جو خاص طور پر جب TRF2 زیادہ متاثر ہوتا ہے تو مدافعتی ردعمل کو بڑھاتا ہے۔ قابل غور بات یہ ہے کہ ہم مشاہدہ کرتے ہیں کہ اے آر اور اے ڈی نے TRF2 اوور ایکسپریشن کے مدافعتی اور پرو انجیوجینک افعال کو بچایا، TRF2 overexpress-sion کی دو خصوصیات جنہیں ہم نے پہلے DDR آزاد کے طور پر دکھایا تھا۔ اس طرح، ہم نے قیاس کیا کہ ٹیومر کی نشوونما پر AR اور AD کے اثرات DDR سے آزاد ہیں، ایک ایسا طریقہ کار جو مزید مطالعات میں مکمل طور پر بیان کیا جانا باقی ہے۔ موجودہ ثبوت کا تصور کا مطالعہ اس بات کا ثبوت فراہم کرتا ہے کہ TRF2 اظہار کی فارماسولوجیکل کمی کینسر کے خلاف ایک قیمتی حکمت عملی ہو سکتی ہے۔

اگرچہ اسکریننگ کے طریقہ کار میں TRF2 پروٹین کی سطحوں کو ٹرانسکرپٹ کی سطحوں سے آزادانہ طور پر سمجھا جاتا ہے، دونوں ادویات نے endogenous TERF2 mRNA کی سطح کو کم کیا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ AR اور AD TRF2 ریگولیشن کی متعدد سطحوں کو نشانہ بناتے ہیں۔ اس کی حمایت کرتے ہوئے، AR Wnt سگنلنگ [28] کا ایک روکنے والا ہے، جو TERF2 ٹرانسکرپشن [29] کا ایکٹیویٹر ہے۔ عام طور پر، Wnt سگنلنگ پاتھ وے کو نشانہ بنانے والی دوائیں اسکریننگ کے مراحل کے دوران افزودہ ہوئیں (فگر S1B-D)۔ AD، مائٹوکونڈریا کو نشانہ بنانے والا ایجنٹ، TRF2 اظہار کو کیسے متاثر کرتا ہے، اس کا تعین کرنا باقی ہے۔ چونکہ کینسر جو اعلی TRF2 کی سطح کو ظاہر کرتے ہیں ان کی تشخیص خراب ہوتی ہے اور کیموتھراپی کے خلاف مزاحمت میں اضافہ ہوتا ہے [21]، اس لیے AR اور AD ایسے ٹیومر کے لیے دلچسپی کے علاج کے ایجنٹ ہیں۔ TRF2[13] کی ٹیلومیرک اور پرو آنکوجینک سرگرمیوں کو جوڑنے کی صلاحیت فارماسولوجیکل طور پر TRF2 کو کم کرنے کے امکان کو بڑھاتی ہے اس طرح عمر بڑھنے کے نقصان دہ ضمنی اثرات کے بغیر ملٹی ہٹ اینٹی کینسر فوائد فراہم کرتے ہیں۔ لہذا، کلینیکل اسٹڈیز میں TRF2 اظہار کی سطح پر ان دوائیوں کے ہم آہنگی کے اثرات کا تعین کرنے کے لیے مستقبل کے مطالعے کی ضمانت دی جاتی ہے۔

اگرچہ TRF2 کو مختلف انسانی کینسروں میں اپ ریگولیٹ کیا جاتا ہے [13,21]، اس کے اظہار کو بہت سے ٹشوز کی نارمل اور پیتھولوجیکل ایجنگ دونوں کے دوران کم کیا جاتا ہے [30,31] مزید برآں، TRF2 dysregulation کے ماؤس ماڈل پر مشتمل متعدد رپورٹس میں TRF2 کی اہمیت پر زور دیا گیا ہے۔ بڑھاپے اور کینسر کے درمیان سنگم [31-35]۔ لہٰذا، یہاں بیان کردہ اسکریننگ کے طریقہ کار سے جن مالیکیولز کی نشاندہی کی گئی ہے وہ منشیات کے دلچسپ امیدوار ہیں، دونوں TRF2 ڈاؤن ریگولیشن کے لیے کینسر مخالف ایجنٹوں کے طور پر جیسا کہ اس مطالعہ میں تصدیق کی گئی ہے، اور ممکنہ طور پر TRF2 کو اپ گریڈ کرکے اینٹی ایجنگ ایجنٹس کے طور پر۔

یہ مضمون کینسر 2021، 13، 2998 سے لیا گیا ہے۔ https://doi.org/10.3390/cancers13122998 https://www.mdpi.com/journal/cancers