Apocynin Ameliorates Monosodium Glutamate Induced Testis Demage by impaired Blood-testis بیریئر اور آکسیڈیٹیو سٹریس پیرامیٹرزⅠ

خلاصہ:

پس منظر: اس مطالعے کا مقصد ہارمون کی سطحوں پر apocynin (APO) کے اثرات، خون کے ٹیسٹس میں رکاوٹ، اور monosodium glutamate (MSG) کی حوصلہ افزائی والے خصیوں کی تنزلی میں آکسیڈیٹیو بائیو مارکر کی تحقیقات کرنا تھا۔ طریقے: Sprague Dawley نر چوہوں (150–200 g; n=32) کو تصادفی طور پر چار گروپوں میں تقسیم کیا گیا: کنٹرول، APO، MSG، اور MSG پلس APO۔ MSG اور MSG پلس APO گروپوں کو MSG (120 mg/kg) 28 دنوں کے لیے دیا گیا۔

ٹیسٹوسٹیرون کے لیے cistanche herba پر کلک کریں۔

مزید برآں، APO اور MSG پلس APO گروپس نے تجربے کے آخری پانچ دنوں کے دوران APO (25 mg/kg) حاصل کیا۔ تمام انتظامات زبانی گیجج کے ذریعے تھے۔ آخر میں، بائیو کیمیکل تجزیہ ٹیسٹوسٹیرون، follicle-stimulating hormone (FSH)، luteinizing hormone (LH)، malondialdehyde (MDA)، glutathione (GSH)، اور superoxide dismutase (SOD) کے ساتھ ساتھ روشنی اور ٹرانسمیشن کے تعین کی بنیاد پر کیا گیا۔ الیکٹران مائکروسکوپک امتحانات، سپرم پیرامیٹرز کی تشخیص، ZO-1، occludin، NOX-2، اور TUNEL امیونو ہسٹو کیمسٹری کا جائزہ لیا گیا۔

نتائج: MSG نے آکسیڈیٹیو تناؤ کی سطح اور apoptosis دونوں میں اضافہ کیا، خلیوں کے پھیلاؤ کو کم کیا، اور خصیوں کی مورفولوجی میں انحطاط کا سبب بنا جس میں خون کے ٹیسٹس کی رکاوٹ بھی شامل ہے۔ apocynin کی انتظامیہ نے MSG پلس APO گروپ میں تمام بگڑے ہوئے مورفولوجیکل اور بائیو کیمیکل پیرامیٹرز کو الٹ دیا۔ نتیجہ: apocynin کو متوازن ہارمون اور oxidant/antioxidant کی سطح کے ساتھ خون کے ٹیسٹس کی رکاوٹ کی سالمیت کو برقرار رکھتے ہوئے خصیوں کے انحطاط کو روکنے کے لیے سمجھا جاتا ہے۔

مطلوبہ الفاظ: مونوسوڈیم گلوٹامیٹ؛ apocynin NOX-2; خون کے ٹیسٹس میں رکاوٹ؛ الٹراسٹرکچر

1. تعارف

وسیع پیمانے پر استعمال ہونے والا L-glutamic ایسڈ، ایک اضافی کے طور پر، قدرتی طور پر مختلف کھانوں میں پایا جاتا ہے اور ذائقہ بڑھانے والے، مونوسوڈیم گلوٹامیٹ (MSG) کا ذریعہ ہے [1]۔ بہت سے پروسیسرڈ فوڈز میں MSG بطور ایڈیٹیو ہوتا ہے، جس میں یوروپی صنعتی ممالک میں اوسطاً یومیہ استعمال ہوتا ہے 0.3 سے 10 جی۔ [2]۔ اگرچہ MSG کی کھپت کو فوڈ سیفٹی تنظیموں کے ذریعہ محفوظ سمجھا جاتا ہے، اس کے باوجود کئی طبی اور طبی مطالعات میں اس پر سوال اٹھائے جاتے ہیں، خاص طور پر اس کی طویل مدتی نمائش۔ گلوٹامیٹ کے جسمانی افعال میں مرکزی اعصابی نظام میں اس کی نیورو ٹرانسمیٹر خاصیت ہے، جو کہ گلوٹاتھیون جیسے میٹابولائٹس کے پیش خیمہ کے طور پر ہے [1]۔

MSG کے طویل مدتی استعمال سے مردانہ تولیدی نظام پر منفی اثرات مرتب ہوتے ہیں۔ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ MSG کا طویل مدتی استعمال مردوں میں سپرم کی تعداد کو کم کرتا ہے اور سپرم اور خصیوں کی شکلیاتی ساخت کو متاثر کرتا ہے [3]۔ اس سے قبل کی گئی تحقیق کی اکثریت بنیادی طور پر چوہوں میں MSG کے زہریلے پن پر 2000-8000 mg/kg جسمانی وزن کی خوراک پر مرکوز تھی، جو اس سطح پر انسانوں کے لیے انتہائی امکان نہیں ہے [4]۔

شن ایٹ ال کے ذریعہ ایلومیٹرک تبدیلی۔ [5] نے اس خوراک کو چوہوں میں 120 ملی گرام/کلوگرام جسمانی وزن کے برابر دکھایا۔ تولیدی اعضاء اور سپرم میں گلوٹامیٹ ریسیپٹرز کی ایک خاصی تعداد موجود ہے، جس کی وجہ سے وہ جسم میں اضافی گلوٹامیٹ سے جوش میں آنے والے نقصان کا شکار ہو جاتے ہیں۔ یہ تولیدی نظام کو گلوٹامیٹ سے متاثر ہونے والے نقصان کا بار بار ہدف بناتا ہے۔ اس کے علاوہ، گلوٹامیٹ زہریلا ہائپوتھیلمک – پٹیوٹری – گوناڈل محور کو براہ راست نقصان پہنچانے کے لیے جانا جاتا ہے، جس کی وجہ سے تولید میں ہومیوسٹیٹک عدم توازن پیدا ہوتا ہے [6]۔

ایم ایس جی کے نتیجے میں آکسیڈیٹیو نقصان ہوا ہے (لپڈ پیرو آکسیڈیشن میں اضافہ اور اینٹی آکسیڈینٹ انزائم کی سرگرمیوں میں کمی) اور سپرمٹوجینک تبدیلیاں جو نطفہ کی کم تعداد اور مورفولوجیکل اسامانیتاوں سے ظاہر ہوتی ہیں [3]۔ لہذا، ہم نے چوہوں پر MSG کے زبانی استعمال کے اثرات کا مطالعہ کیا جب انہوں نے انسانوں میں روزانہ کی خوراک سے براہ راست ایک اعتدال پسند خوراک کھائی۔ چوہوں کے ورشن مورفولوجی پر اس MSG خوراک کا اثر تجرباتی مطالعات میں بھی دیکھا گیا [3,7]۔

رد عمل آکسیجن پرجاتیوں (ROS) کی زیادہ پیداوار آکسیڈیٹیو تناؤ اور اپوپٹوسس کو متحرک کرتی ہے۔ ان کے رد عمل کے ڈھانچے کی وجہ سے، آزاد ریڈیکلز لپڈ، نیوکلک ایسڈ اور پروٹین کے ساتھ تعامل کر سکتے ہیں اور جسم پر نقصان دہ اثرات مرتب کر سکتے ہیں [8]۔ آکسیڈیٹیو تناؤ، ROS کی طرف سے حوصلہ افزائی، مردانہ بانجھ پن میں اہم کردار ادا کرنے کے لیے جانا جاتا ہے [9]۔ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ NADPH آکسیڈیس (NOX) ROS [10] کے اہم ذرائع میں سے ایک ہے۔ مردانہ تولیدی نظام میں ضرورت سے زیادہ ROS اور آکسیڈیٹیو تناؤ نطفہ کے ارتکاز، حرکت پذیری اور مورفولوجی میں منفی تبدیلیوں کا سبب بنتا ہے۔ انحطاط شدہ نطفہ اور خراب منی کے پیرامیٹرز بانجھ پن کا باعث بنتے ہیں [11]۔ ROS مردانہ بانجھ پن کا سبب بنتا ہے کیونکہ اسپرم میں ڈی این اے کو نقصان پہنچتا ہے [12]۔ آکسیڈیٹیو تناؤ نطفہ کی پلازما جھلی کی سالمیت سے سمجھوتہ کرتا ہے اور ابتدائی اہلیت پیدا کرتا ہے۔

نتیجے کے طور پر، نطفہ کی فرٹیلائزنگ کی صلاحیت کم ہو جاتی ہے اور بانجھ پن واقع ہوتا ہے [13]۔ Apocynin (APO)، Apocynum cannabinum پلانٹ کی جڑوں سے نکالا جاتا ہے، NOX [14] کے روکنے والے کے طور پر موثر سمجھا جاتا ہے۔ اے پی او کے انسداد سوزش اثر کو بہت سے تجرباتی مطالعات میں ظاہر کیا گیا ہے [15]۔ NOX ایکٹیویشن سائٹوسولک اجزاء کی سیل جھلی میں منتقلی کے ذریعے ہوتی ہے [16,17]۔ اے پی او فعال انسانی نیوٹروفیلز میں NOX سرگرمی پر عمل کرتے ہوئے ROS کی پیداوار کے ایک منتخب روکنے والے کے طور پر کام کرتا ہے۔

تاہم، APO phagocytosis یا انٹرا سیلولر موت [18,19] کے دیگر میکانزم کو متاثر نہیں کرتا ہے۔ NOX isoforms کا اظہار مختلف خلیوں میں ہوتا ہے اور ان کے مختلف جسمانی افعال ہوتے ہیں۔ NOX-2 NOX کا ایک isoform ہے، جو eosinophils، macrophages اور neutrophils [20] میں موجود ہے۔ اسپرمیٹوجینک خلیے جڑے ہوئے ہیں اور سرٹولی خلیات۔ یہ متحرک تعلق تنگ جنکشنز اور گیپ جنکشنز کے ذریعے منظم کیا جاتا ہے [21]۔ سیرٹولی خلیوں کے درمیان سخت جنکشن خون کے ٹیسٹس رکاوٹ (BTB) کی تشکیل اور کام کے لیے اہم ہیں۔

بی ٹی بی کے ڈھانچے میں سخت جنکشن، ڈیسموسوم، بیسل ایکٹوپلاسمک اسپیشلائزیشن، اور گیپ جنکشن شامل ہیں۔ اپکلا اصل کے سخت جنکشن ملٹی مالیکیولر میمبرین اسپیشلائزیشنز ہیں جن میں ایک سے زیادہ انٹیگرل میمبرین پروٹین ہوتے ہیں جیسے کہ زونولا اوکلوڈینز-1 (ZO-1) اور occludin [21]۔ Occludins ان مالیکیولز میں سے ایک ہیں جو تنگ جنکشن کی تشکیل میں حصہ ڈالتے ہیں۔ Zonula occludens پروٹین جیسے zonula occludens-1 (ZO-1), ZO-2، اور ZO-3 اس ڈھانچے میں شامل اہم پروٹین ہیں۔ Occludin، ZO-1، اور ZO-3 ایکٹین سائٹوسکلٹن کے ساتھ تعامل کرتے ہیں۔ پروٹین ZO-3 ZO-1 اور occludin [22] کے سائٹوپلاسمک ڈومینز سے وابستہ ہے۔

آکسیڈیٹیو تناؤ اس وقت ہوتا ہے جب آزاد ریڈیکلز کے خلاف کافی اینٹی آکسیڈینٹ نہ ہوں۔ اینٹی آکسیڈینٹ انزائمز کی سرگرمی میں کمی جیسے سپر آکسائیڈ ڈسمیٹیز (SOD) اور گلوٹاتھیون (GSH) کی سطح آکسیڈیٹیو نقصان میں اضافے کا باعث بنتی ہے [23]۔ Malondialdehyde (MDA)، سیل کی جھلی کے نقصان کا ایک پیرامیٹر، رد عمل والے خلیوں میں آکسیجن ریڈیکل اٹیک کی کثافت اور Vivo میں فری ریڈیکل میٹابولزم کی نشاندہی کرتا ہے۔ SOD میں کمی اور MDA میں اضافہ آکسیڈیٹیو تناؤ کو متحرک کرتا ہے اور سیل کو نقصان پہنچاتا ہے جس کے نتیجے میں سیل کی موت ہوتی ہے [24]۔ مطالعات نے NOX-2 کو ROS [20,25] کے ماخذ کے طور پر ظاہر کیا۔ APO، ایک طاقتور NOX-2 inhibitor [26]، NOX-2 کی روک تھام میں مؤثر ثابت ہو سکتا ہے تاکہ آکسیڈیٹیو تناؤ کی وجہ سے ٹشو کو پہنچنے والے نقصان کو روکا جا سکے۔

APO کی انتظامیہ آکسیڈیٹیو تناؤ کے پیرامیٹرز اور ہسٹوپیتھولوجیکل نقصان پر علاج کا اثر ڈال سکتی ہے۔ اس مطالعہ کا مقصد MSG کے خصیوں کو پہنچنے والے نقصان، سیل کے پھیلاؤ، اپوپٹوسس، اور آکسیڈیٹیو تناؤ پر NOX-2 کے اظہار اور خون کے خصیوں کی رکاوٹ پر اثرات کا جائزہ لینا تھا۔ اس کے علاوہ، مطالعہ کا مقصد یہ تحقیقات کرنا تھا کہ آیا اپوکینن ان تمام پیرامیٹرز پر اثرات کو بہتر بنا سکتا ہے۔

2. مواد اور طریقہ

2.1 تجرباتی نمونہ

اس تجرباتی مطالعہ کو Acibadem Mehmet Ali Aydinlar یونیورسٹی کے تجرباتی جانوروں کی اخلاقیات کمیٹی (ACU-HADYEK، منظوری نمبر: HDK2020/39) نے منظور کیا تھا۔ اس مطالعے میں، 8-ہفتہ پرانے Sprague Dawley نر البینو چوہوں (n=32) کو پنجروں میں رکھا گیا جس کا درجہ حرارت 22 ± 2 ◦C اور ایک معیاری روشنی/تاریک (12:12 h) سائیکل چوہوں کو تجرباتی مدت کے 28 دنوں تک معیاری جانوروں کے کھانے کی اشتہا کھلائی گئی۔ یہ تحقیق ARRIVE (جانوروں کی تحقیق: In Vivo Experiments کی رپورٹنگ) کے رہنما خطوط اور ضوابط کے ذریعہ کی گئی تھی۔ اس مطالعہ میں، Sprague Dawley نر چوہوں (n=8 ہر گروپ میں) کو تصادفی طور پر 4 گروپ کنٹرول، APO، MSG، اور MSG پلس APO میں تقسیم کیا گیا تھا۔ آست پانی (1 ملی لیٹر) چوہوں کے کنٹرول گروپ کو 28 دن تک زبانی گیویج کے ذریعے دیا گیا۔ ایم ایس جی اور ایم ایس جی پلس اے پی او گروپس کو 120 ملی گرام / کلوگرام ایم ایس جی مسلسل 28 دنوں تک زبانی گیویج کے ذریعے دیا گیا [4]۔ اے پی او اور ایم ایس جی پلس اے پی او گروپس کو تجربے کے آخری 5 دنوں میں زبانی گیویج کے ذریعہ 25 ملی گرام/کلوگرام اے پی او کا انتظام کیا گیا تھا [27]۔ تجرباتی گروپوں میں چوہوں کے وزن کا ہفتہ وار تجزیہ کیا گیا۔ آئسو فلورین اینستھیزیا کے بعد چوہوں کی قربانی دی گئی۔ خون کے نمونوں کے ساتھ ساتھ ورشن اور ایپیڈیڈیمس ٹشو کے نمونے، بائیو کیمیکل اور خوردبینی تشخیص کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔

2.2 سیرم ٹیسٹوسٹیرون، ایف ایس ایچ، اور ایل ایچ کی تعداد کی پیمائش

سیرم ٹیسٹوسٹیرون، follicle-stimulating hormone (FSH)، اور luteinizing ہارمون (LH) کے ارتکاز کو اینزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ (ELISA) کٹس کا استعمال کرکے ماپا گیا۔ چوہا ٹیسٹوسٹیرون (کیٹلاگ نمبر: EA0023Ra، ELISA کٹ Bioassay ٹیکنالوجی لیبارٹری)، Rat FSH (کیٹلاگ نمبر: EA0015Ra، Bioassay ٹیکنالوجی لیبارٹری، شنگھائی، چین)، اور Rat LH ELISA (کیٹلاگ نمبر: EA0013Ra، Bioassay ٹیکنالوجی لیبارٹری کے لیے استعمال کیے گئے) کٹ کے طریقہ کار کے مطابق ہارمون کی سطح کا تجزیہ۔ ٹیسٹوسٹیرون کے نتائج nmol/L اور FSH اور LH کو mIU/L کے طور پر دیا گیا تھا۔

2.3۔ خصیوں کے ایم ڈی اے، جی ایس ایچ، اور ایس او ڈی کی سطحوں کی پیمائش

MDA کی سطح کا تعین تجارتی کٹ (E-BC-K025-M, Elabscience, Houston, TX, USA) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ ایم ڈی اے، لپڈ پیرو آکسیڈیشن کے انحطاط کی مصنوعات میں سے ایک، تھیوباربیٹورک ایسڈ (ٹی بی اے) کے ساتھ رد عمل ظاہر کر کے ایک گلابی کمپلیکس بناتا ہے جس کا جذب زیادہ سے زیادہ 532 این ایم ہوتا ہے۔ ٹشو میں ایم ڈی اے کی سطح کا حساب nmol/g میں کیا گیا تھا۔ ورشن ٹشو میں GSH تجزیہ بیوٹلر کے طریقہ کار کے مطابق کیا گیا تھا [28]۔ طریقہ کار کا اصول اس حقیقت پر مبنی ہے کہ تجزیہ ٹیوب میں GSH 5,50 -dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) کے ساتھ رد عمل ظاہر کرتا ہے تاکہ ایک زرد رنگ حاصل کر سکے۔ اس رنگ کی روشنی کی شدت کو اسپیکٹرو فوٹومیٹر میں 410 nm کی طول موج پر پڑھا گیا۔ ٹشو ہوموجنیٹس کو سینٹرفیوج کیا گیا تھا، اور پروٹین کو تیز کرنے کے لیے ایک 10 فیصد TCA محلول حاصل شدہ سپرنٹنٹ میں ملایا گیا تھا، اور دوبارہ سینٹرفیوج کیا گیا تھا۔ چمکدار رنگ کے سپرنٹنٹس GSH تجزیہ کے لئے استعمال کیے گئے تھے۔ 5 منٹ کے لیے کمرے کے درجہ حرارت پر رکھے گئے نمونوں میں رنگ کی شدت کو اسپیکٹرو فوٹومیٹر میں 410 nm پر پڑھا گیا، اور ٹشو میں µmol/g میں GSH کی سطح کا تعین glutathione معیاری وکر کے ذریعے کیا گیا۔ SOD سرگرمی کا تعین سگما SOD ڈیٹرمینیشن کٹ (E-BC-K019-M, Elabscience, Houston, TX, USA) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ انزائم ورکنگ سلوشن کے ساتھ ایس او ڈی کی سرگرمی کو انکیوبیٹ کرنے کے بعد جاذب اقدار کو 450 این ایم پر پڑھا گیا۔ ٹشو میں SOD کی سطح کا حساب IU/g میں کیا گیا تھا۔

2.4 سپرم کاؤنٹ، موٹیلٹی، اور مورفولوجی

چوہوں سے ایپیڈیڈیمل ٹشوز کے نمونے ارلی کے متوازن نمکیات کے محلول میں ہیپس بفر کے محلول کے ساتھ رکھے گئے تھے اور پچھلے مطالعہ [27] کی بنیاد پر سپرم کی گنتی، حرکت پذیری اور مورفولوجی کے تجزیہ کے لیے کارروائی کی گئی تھی۔ مختصراً، چوہوں کے ایپیڈیڈیمس ٹشو کے نمونوں کو ارلی کے متوازن نمکیات کے محلول میں منتقل کیا گیا جس میں ہیپس بفر محلول شامل کیا گیا۔ سپرمیٹوزوا کا اندازہ کرنے کے لئے ایک معمول کی کثافت میلان کا طریقہ استعمال کیا گیا تھا۔ سپرنٹنٹ کو ہٹا دیا گیا تھا، اور گولی کو سپرمیٹوزوا واشنگ میڈیم (SAGE، Newcastle on Tyne، UK) سے پتلا کر کے سینٹرفیوج کیا گیا تھا۔ پھر گولی کو سپرم کی تیاری کے میڈیم (SAGE، UK) سے پتلا کر دیا گیا۔ 10 µm گولی کا استعمال ایک میکلر گنتی چیمبر (سیفی کٹ آؤٹ میڈیکل انسٹرومنٹس، حائفہ، اسرائیل) میں اسپرمیٹوزوا کو فوٹو مائکروسکوپ کے ساتھ شمار کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ مورفولوجیکل تشخیص کے لیے، سمیرز تیار کیے گئے اور پھر ڈِف کوئیک کٹ (میڈیئن ڈائیگنوسٹک، گرافلفنگ، میونخ، جرمنی) کا استعمال کرتے ہوئے داغ لگائے گئے۔ ہر سلائیڈ میں، نطفہ کی شکل کا اندازہ لگانے کے لیے 100 نطفہ کو 100 × میگنیفیکیشن پر فوٹو مائیکروسکوپ (Zeiss A1 Axio Scope، Oberkochen، Germany) کے ذریعے جانچا گیا۔

2.5 لائٹ مائکروسکوپی کے لیے ٹشو پروسیسنگ

ٹیسٹیکولر ٹشوز کو معمول کے ہسٹولوجیکل امتحانات کے لئے بوئن حل کے ساتھ طے کیا گیا تھا۔ امیونو ہسٹو کیمیکل امتحانات کے لیے، ورشن کے ٹشوز کو 4 فیصد پیرافارمیلڈہائیڈ (PFA) محلول کے ساتھ طے کیا گیا تھا۔ فکسشن کے بعد، ٹشوز معمول کے مطابق پیرافین ایمبیڈنگ کے طریقہ کار سے گزرے [29]۔ ہیماتوکسیلین اور eosin (H&E) داغ کو معمول کے ہسٹولوجیکل تشخیص کے لئے حصوں پر لگایا گیا تھا۔ سیمینیفرس نلیوں کی بیسل جھلیوں کی ساخت کو ظاہر کرنے کے لیے ایک متواتر ایسڈ-شِف (PAS) رد عمل کا اطلاق کیا گیا۔ H&E-داغ دار خصیوں کے حصوں میں سیمینیفرس نلیاں تبدیل شدہ جانسن کے ہسٹوپیتھولوجیکل اسکورنگ پیرامیٹرز [30,31] کی بنیاد پر اسکور کی گئیں۔ اس کے علاوہ، امیج جے (امیج جے سافٹ ویئر، نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ) پروگرام کا استعمال کرتے ہوئے تمام حصوں میں 100 سیمینیفرس نلیوں کی اپکلا موٹائی کی پیمائش کی گئی۔

2.6۔ ٹرمینل Deoxynucleotidyl Transferase dUTP نک اینڈ لیبلنگ (TUNEL) امیونو کیمسٹری

ٹرمینل deoxynucleotidyl transferase dUTP نک اینڈ لیبلنگ (TUNEL) طریقہ کارخانہ دار (ApopTag Plus، In Situ Apoptosis Detection Kit, S7101, Merck Millipur, Germany, Darmstad) کی طرف سے دی گئی کٹ کے ہدایت نامہ کے مطابق ورشن کے ٹشو سیکشنز پر لاگو کیا گیا تھا۔ مختصراً، deparaffinization اور rehydration کے بعد، حصوں کو PBS میں دھویا گیا اور پھر ایک سائٹریٹ بفر میں مائکروویو اوون میں گرم کیا گیا۔ ٹھنڈا ہونے کے بعد، پروٹیناس K (20 µg/mL) ٹشو سیکشنز پر ٹپکایا گیا۔ حصوں کو آست پانی میں دھویا گیا اور 3 فیصد ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ سے تیار کردہ محلول میں بھگو دیا گیا۔ پی بی ایس میں دھونے کے بعد، کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ کے لیے حصوں پر 10 µL اسٹیبلائزنگ ٹیمپون رکھا گیا۔ اس کے بعد، 10 µL Tdt انزائم کو ٹپکایا گیا، اور حصوں کو 37 ◦C پر 1 گھنٹے کے لیے انکیوبیٹ کیا گیا۔ اسٹاپ واش بفر کو کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ تک ٹپکایا گیا تھا۔ پی بی ایس سے دھونے کے بعد، 13 µL اینٹی ڈیگوکسیجنن حصوں پر ٹپکایا گیا۔ کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ تک انکیوبٹنگ کے بعد، پی بی ایس میں حصوں کو 2 منٹ کے لیے 4 بار دھویا گیا۔ پھر، 13 µL 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) محلول ٹپکایا گیا۔ پھر، حصوں کو آست پانی سے ہلایا گیا۔ اس کے برعکس داغ لگانے کے لیے، حصوں کو مائر ہیماتوکسیلین محلول (جے ٹی بیکر، سینٹر ویلی، PA، USA) میں بھگو دیا گیا تھا۔ آست پانی کے حصوں میں دھونے کے بعد اطالوی کے ساتھ نصب کیا گیا تھا. حصوں کو ہلکی مائکروسکوپ (زیس اے 1 ایکسیو اسکوپ، اوبرکوچن، جرمنی) کے ساتھ امیج کیا گیا تھا۔ اپوپٹوٹک انڈیکس کا تخمینہ خصیوں کی کل تعداد کو 3 یا اس سے زیادہ TUNEL-مثبت خلیوں کے ساتھ سیمینیفرس نلیوں کی تعداد سے تقسیم کرکے لگایا گیا تھا [32]۔

2.7۔ پھیلنے والا سیل نیوکلیئر اینٹیجن (PCNA) امیونو ہسٹو کیمسٹری

پھیلاؤ والے خلیوں کی تعداد اور پھیلاؤ انڈیکس کا تعین کرنے کے لیے حصوں کو PCNA امیونو ہسٹو کیمسٹری کا نشانہ بنایا گیا۔ deparaffinization اور rehydration کے بعد، حصوں پر PCNA امیونو ہسٹو کیمسٹری کے لیے کارروائی کی گئی جیسا کہ پچھلے مطالعہ میں بیان کیا گیا ہے [32]۔ مختصراً، حصوں کو 3 فیصد ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ محلول (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) میں 20 منٹ کے لیے محفوظ کیا گیا تھا۔ حصوں کو مائیکرو ویو اوون میں 20 منٹ کے لیے ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) بفر (Sigma-Aldrich، USA) میں 200 W پر گرم کیا گیا۔ پی بی ایس سے 3 بار دھونے کے بعد، حصوں کو 5 فیصد گوٹ سیرم بلاک کرنے والے محلول (انویٹروجن، والتھم، ایم اے، یو ایس اے) میں 10 منٹ تک بھگو دیا گیا۔ پھر، بنیادی خرگوش اینٹی پی سی این اے اینٹی باڈی (کیٹلاگ نمبر: SY12-07، Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) (1:50) لاگو کیا گیا۔ حصوں کو راتوں رات 4 ◦C پر مرطوب چیمبر میں رکھا گیا تھا اور ہر بار 5 منٹ کے لئے پی بی ایس کے ساتھ 3 بار دھویا گیا تھا۔ بایوٹین کے لیبل والے بکرے کے اینٹی خرگوش سیکنڈری اینٹی باڈی (کیٹلاگ نمبر: A16100، انویٹروجن، والتھم، MA، USA) (1:500) کو حصوں پر گرا دیا گیا اور 37 ◦C پر 30 منٹ تک رکھا گیا۔ Streptavidin peroxidase (Invitrogen، Waltham، MA، USA) کو حصوں میں ڈالا گیا اور 10 منٹ کے لیے چھوڑ دیا گیا۔ PBS کے ساتھ 3 بار دھونے کے بعد، حصوں کو 5 منٹ کے لیے 3،30 -diaminobenzidine (DAB) کروموجن (1 mL DAB سبسٹریٹ پلس 30 µL DAB کروموجن) میں بھگو دیا گیا۔ آست پانی سے دھونے کے بعد، حصوں کو کنٹراسٹ سٹیننگ کے لیے مائر کے ہیماتوکسیلین محلول سے داغ دیا گیا تھا۔ اس کے بعد حصوں کو قیصر کے گلیسرول جیلیٹن کے ساتھ نصب کیا گیا تھا (کیٹلاگ نمبر: 1.09242، سگما-الڈرچ، ڈرمسٹادٹ، جرمنی)۔ حصوں کی جانچ ہلکی خوردبین (A1 Axio Scope، Oberkochen، Zeiss، Germany) کے تحت کی گئی۔ پھیلاؤ انڈیکس کا تعین کرنے کے لیے، ہر سیکشن میں 20 نلکیوں میں PCNA- مثبت خلیوں کی تعداد کو خلیوں کی کل تعداد سے تقسیم کیا گیا تھا [32]۔

2.8۔ ZO-1 اور Occludin کی امیونو ہسٹو کیمسٹری

4 فیصد پی ایف اے فکسڈ ٹشو سیکشنز کو الکحل کے حل کے ساتھ ڈیپرافینائز اور ری ہائیڈریٹ کیا گیا تھا۔ اس کے بعد حصوں کو 3 فیصد ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ محلول (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) میں 20 منٹ تک بھگو دیا گیا تاکہ اینڈوجینس انزائمز کو روکا جا سکے۔ PBS کے ساتھ دھونے کے بعد، حصوں کو EDTA بفر (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) میں مائکروویو میں 200 W پر گرم کیا گیا تھا۔ حصوں کو کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ کے لیے ٹھنڈا کیا گیا اور پی بی ایس میں 5 منٹ کے لیے 3 بار ذخیرہ کیا گیا اور اس کے بعد 10 فیصد بفرڈ گوٹ سیرم (انویٹروجن، یو ایس اے) میں 10 منٹ۔ حصوں کا علاج خرگوش مخالف ZO-1 (کیٹلاگ نمبر: 61-7300، انویٹروجن، والتھم، MA، USA) اور خرگوش اینٹی اوکلوڈین (1:100) (کیٹلاگ نمبر: {{18}) کے ساتھ کیا گیا تھا۔ }، انویٹروجن، والتھم، ایم اے، یو ایس اے) اینٹی باڈیز (رات بھر، جمع 4 ◦C پر)۔ پی بی ایس میں 5 منٹ تک 3 بار دھونے کے بعد، بایوٹین کا لیبل لگا ہوا اینٹی ریبٹ سیکنڈری اینٹی باڈی (کیٹلاگ نمبر: 65-6140، انویٹروجن، والتھم، ایم اے، یو ایس اے) (1:1000) کو حصوں پر چھوڑ دیا گیا۔ پی بی ایس میں 3 بار اور 5 منٹ بھگنے کے بعد، اسٹریپٹاویڈن پیرو آکسیڈیس (انویٹروجن، والتھم، ایم اے، یو ایس اے) کو حصوں پر لگایا گیا۔ پی بی ایس میں دھونے کے بعد، اے ای سی سنگل/پلس کروموجن (ابکیم، کیمبرج، یو کے) پر گرا دیا گیا، اور حصوں کو آست پانی سے ہلایا گیا اور قیصر کے گلیسرول جیلیٹن کے ساتھ نصب کیا گیا (کیٹلاگ نمبر: 1.09242، سگما-الڈرچ، ڈرمسٹڈ، جرمنی)۔ حصوں کو ہلکے مائکروسکوپ (A1 Axio Scope، Oberkochen، Zeiss، Germany) کا استعمال کرتے ہوئے امیج کیا گیا تھا۔ ZO-1 اور occludin دونوں کی مدافعتی سرگرمی کی شدت کا شمار امیج J پروگرام (1.44 سافٹ ویئر، نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔

2.9 ZO-1، Occludin اور NOX-2 Immunofluorescence Analysis

حصوں کو 3 فیصد ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ میں رکھا گیا تھا اور پی بی ایس سے دھویا گیا تھا۔ پھر، حصوں کو خرگوش مخالف ZO-1(1:100) ZO-1(کیٹلاگ نمبر: 61-7300، انویٹروجن، والتھم، MA، USA)، خرگوش اینٹی اوکلوڈن (1 100 مینیسوٹا، امریکہ)۔ سلائیڈوں کو پی بی ایس کے ساتھ دھویا گیا اور پھر AF 488 (کیٹلاگ نمبر: ab150077، Abcam، USA) کے ساتھ بکری کے اینٹی ریبٹ سیکنڈری اینٹی باڈی (1:1000) کا لیبل لگایا گیا۔ حصوں کو آخری بار پی بی ایس سے دھونے کے بعد، انہیں ایک 406- ڈائمینو-2-فینائل آئیڈل (DAPI) محلول (کیٹلاگ نمبر: ab104139, Abcam, Boston, MA, USA) کے ساتھ نصب کیا گیا تھا۔ حصوں کو فلوروسینس مائکروسکوپ (زیس ایکسیو اسکوپ. اے 1 مائکروسکوپ جس میں فلوروسینس اٹیچمنٹ Zeiss AxioCam MRc 5 کیمرہ) کے ساتھ امیج کیا گیا تھا۔ تصویر والے حصوں میں فلوروسینس کی شدت کا حساب امیج جے (امیج جے سافٹ ویئر، نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ) پروگرام کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔

2.10 ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی کے لئے ٹشو پروسیسنگ

ٹیسٹس ٹشو کے نمونے بفر شدہ 2.5 فیصد گلوٹرالڈہائڈ سلوشن (0.1 M PBS، pH 7.2 میں) کے ساتھ طے کیے گئے تھے اور پہلے شائع شدہ پروٹوکول [32] کے مطابق روٹین ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپیکل تیاری کے لیے کارروائی کی گئی تھی۔ حصوں کا تجزیہ ایک ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپ (TALOS L 120 C، تھرمو سائنٹیفک فشر، آئندھوون، نیدرلینڈز) کے تحت کیا گیا۔

2.11۔ شماریاتی تجزیہ

ڈیٹا کا تجزیہ یک طرفہ ANOVA اور Tukey کے متعدد موازنہ ٹیسٹوں کے ساتھ کیا گیا جس میں p < 0۔{4}}5 کو اہم سمجھا گیا۔ گراف پیڈ پرزم 8.0 (سان ڈیاگو، CA، USA) کا استعمال کرتے ہوئے شماریاتی تجزیہ کیا گیا۔

Cistanche ٹیسٹوسٹیرون کو کیسے بڑھاتا ہے؟

Cistanche ایک جڑی بوٹی ہے جو روایتی طور پر چینی طب میں توانائی، لبیڈو، اور مجموعی طور پر جیورنبل کو بڑھانے کے لیے استعمال ہوتی ہے۔ یہ خیال کیا جاتا ہے کہ Cistanche aromatase نامی انزائم کی سرگرمی کو روک کر ٹیسٹوسٹیرون کی سطح کو بڑھا سکتا ہے، جو ٹیسٹوسٹیرون کو ایسٹروجن میں تبدیل کرتا ہے۔ Cistanche جسم میں luteinizing ہارمون (LH) کی پیداوار کو بڑھانے کے لیے بھی پایا گیا ہے۔ خصیوں میں ٹیسٹوسٹیرون کی پیداوار کو منظم کرنے میں LH ایک اہم کردار ادا کرتا ہے۔ LH کی سطح کو بڑھانے سے، Cistanche بالواسطہ طور پر ٹیسٹوسٹیرون کی پیداوار کو بڑھا سکتا ہے۔ مزید برآں، Cistanche میں متعدد فائٹو کیمیکلز بھی شامل ہیں جیسے echinacoside اور acteoside، جو اینٹی آکسیڈینٹ خصوصیات کے مالک ہیں۔ یہ مرکبات خصیوں اور دیگر تولیدی اعضاء کو آکسیڈیٹیو نقصان سے بچانے میں مدد کرسکتے ہیں، اس طرح ان کے کام کو بہتر بناتے ہیں اور ٹیسٹوسٹیرون کی پیداوار میں اضافہ ہوتا ہے۔ مجموعی طور پر، درست طریقہ کار جن کے ذریعے Cistanche ٹیسٹوسٹیرون کی سطح کو بڑھاتا ہے پوری طرح سے سمجھ میں نہیں آتا، لیکن یہ ممکنہ طور پر aromatase کو روکنے، LH کی پیداوار میں اضافہ، اور تولیدی نظام کو اینٹی آکسیڈینٹ سپورٹ فراہم کرنے کا ایک باہمی عمل ہے۔

جاری ہے...

مرو ایکیل-ایلماس 1،*، سلوا اسماء الگیلانی 1، بیگم ساہین 1، اوزلم بنگول اوزاکپنار 2، میرٹ گیسیم 2، کٹے کورگلو 3 اور سیراپ اربک 1

1 ڈپارٹمنٹ آف ہسٹولوجی اینڈ ایمبریالوجی، سکول آف میڈیسن، اکیبادم مہمت علی آیدنلر یونیورسٹی، آئسرینکوئے مہ۔، کییسڈگی کیڈ۔ نمبر 32، اتاشیر، استنبول 34752، ترکی

2 شعبہ بایو کیمسٹری، فیکلٹی آف فارمیسی، مارمارا یونیورسٹی، باسیبیوک یولو، 4/A، باسیبیوک، استنبول 34854، ترکی

3 ڈپارٹمنٹ آف ہسٹولوجی اینڈ ایمبریالوجی، سکول آف میڈیسن، مارمارا یونیورسٹی، باسیبیوک یولو نمبر 9 ڈی:2، مالٹیپ، استنبول 34854، ترکی