Cistanche Tubulosa Phenylethanoid Glycosides Eca-109 خلیوں میں Mitochondria پر منحصر راستے کے ذریعے Apoptosis کو اکساتی ہے۔
Mar 06, 2022
رابطہ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ای میل:audrey.hu@wecistanche.com
چانگ شوانگ فو، جنیو لی، عادلہ آئیپائر، لیجی زیا، یی یانگ، کیویان چن، جی ایل وی، ژنہوئی وانگ اور جنیاو لی
خلاصہ
Cistanche tubulosaمختلف حیاتیاتی افعال ہیں. موجودہ مطالعہ میں، غذائی نالی کے کینسر پر C. tubulosa (CTPG-W) کے پانی میں گھلنشیل phenylethanoid glycosides کے اینٹی ٹیومر اثر کی تحقیق کی گئی۔ Eca-109 خلیوں کا علاج CTPG-W کے ساتھ کیا گیا تھا اور سیل کی قابل عملیت کو MTT پرکھ سے ماپا گیا تھا۔ اپوپٹوسس، سیل سائیکل، مائٹوکونڈریل جھلی کی صلاحیت (Δψm)، اور رد عمل آکسیجن پرجاتیوں کا بہاؤ سائٹوومیٹری کے ذریعہ تجزیہ کیا گیا۔ اپوپٹوٹک پاتھ ویز میں پروٹین کی سطح کا مغربی بلاٹ تجزیہ سے پتہ چلا۔ یہ طے کیا گیا تھا کہ CTPG‑W نے apoptosis اور سیل سائیکل گرفتاری کی شمولیت کے ذریعے Eca-109 خلیات کی عملداری کو نمایاں طور پر کم کیا ہے۔ CTPG-W علاج کے بعد، Eca-109 کے Δψm میں خاصی کمی واقع ہوئی تھی، جو کہ B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) سے وابستہ X اور نیچے کی سطح سے منسلک ہے۔ Bcl-2 کا۔ نتیجتاً، سائٹوکوم c اور c-Jun NH2-ٹرمینل کناز کی سطحوں میں اضافہ کیا گیا، جس نے کلیویڈ پولی (ADP-ribose) پولیمریز اور کلیویڈ کیسپیس کی سطحوں کو اپ ریگولیٹ کیا-3، {{18} } اور -9، لیکن کیسپیس نہیں-8۔ اسی کے مطابق، Eca-109 خلیات میں ری ایکٹیو آکسیجن پرجاتیوں کی سطح نے قابل ذکر تبدیلیاں ظاہر کیں۔ ان نتائج نے اشارہ کیا کہ CTPG-W نے مائٹوکونڈریل پر منحصر راستے کے ذریعے Eca-109 خلیوں کے apoptosis کی حوصلہ افزائی کی۔
تعارف
غذائی نالی کا کینسر کینسر کی سب سے عام اقسام میں سے ایک ہے جس میں 11ویں سب سے زیادہ بیماری کی شرح ہے اور عالمی سطح پر شرح اموات 6 ویں ہے اور 2015 میں ~439،000 اموات کا سبب بنی ہے (1)۔ غذائی نالی کے کینسر کے واقعات خاص طور پر مختلف خطوں میں مختلف ہوتے ہیں، مشرقی ایشیا اور مشرقی اور جنوبی افریقہ میں واقعات کی سب سے زیادہ شرح اور مغربی افریقہ میں 2012 میں سب سے کم شرح کی نمائش ہوتی ہے (1,2)۔ چین میں، تخمینہ شدہ غذائی نالی کے کینسر کے کیسز اور اموات بالترتیب 2015 (3) میں 477،000 اور 375،{12}} تھیں۔ اگرچہ 2005 اور 2015 کے درمیان درمیانی اور اعلی درمیانی سوشیو ڈیموگرافک انڈیکس والے ممالک میں غذائی نالی کے کینسر کی بیماری کی شرح میں کمی آئی ہے، لیکن خراب تشخیص (1,4) کی وجہ سے اموات کی شرح زیادہ ہے۔ کیموتھراپی یا ریڈیو تھراپی کے ساتھ جراحی سے نکالے جانے والے مرکب کو غذائی نالی کے کینسر کے علاج کے لیے استعمال کیا جاتا رہا ہے، تاہم، یہ بتایا گیا ہے کہ 2003 اور 2014 کے درمیان 5- سال کی بقا کی شرح برقرار رہی<20% in="" china,="" the="" usa,="" and="" europe="" (4,5).="" for="" these="" reasons,="" it="" is="" urgent="" to="" develop="" novel="" therapeutic="" agents="" to="" treat="" esophageal="">
روایتی چینی جڑی بوٹیوں کی دوا (CHM) کینسر کی مختلف اقسام کے علاج کے لیے استعمال ہوتی رہی ہے، بشمول غیر چھوٹے خلیے کے پھیپھڑوں کا کینسر (6)، کولوریکٹل کینسر (7)، ہیپاٹو سیلولر کارسنوما (8)۔ حال ہی میں، کلینیکل ٹرائلز نے اطلاع دی ہے کہ کیموتھراپی یا ریڈیو تھراپی کے ساتھ CHM کے امتزاج نے نہ صرف معیار زندگی اور کیموتھراپی یا ریڈیو تھراپی (9,10) سے ہونے والے ضمنی اثرات کو کم کرنے پر بہت سے فوائد کا مظاہرہ کیا ہے، بلکہ مریضوں کی بقا کی شرح کو بھی بہتر بنایا ہے۔ غیر چھوٹے سیل پھیپھڑوں، جگر، گیسٹرک، کولوریکٹل، nasopharyngeal یا سروائیکل کینسر کے ساتھ (9)۔ تاہم، غذائی نالی کے کینسر (10,11) پر CHM علاج کی افادیت کے بارے میں متضاد ثبوت موجود ہیں۔ متعدد مطالعات نے یہ طے کیا ہے کہ متعدد جڑی بوٹیوں کی دوائیں یا اجزاء وٹرو اور ویوو میں غذائی نالی کے کینسر کے خلیوں کی نشوونما کو روک سکتے ہیں، بشمول اینڈروگرافس پینکولاٹا (12,13)، ڈائیکینچوٹو (14)، آئیکارین (15)، روزا روکسبرگی ٹراٹ، اور فیگوپیرم۔ Cymosum (16)، Jaridonin (17)، Marsdenia tenacissima (18)، OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid) (19)، Qigesan (20) اور Tonglian decoction (21)۔ Cistanche CHM کی ایک قسم ہے اور مختلف حیاتیاتی افعال کا استعمال کرتی ہے، بشمول اینٹی آکسیڈیشن، اینٹی سوزش، اور نیورو پروٹیکشن (22,23)۔ ہمارے پچھلے مطالعہ نے اس کا مظاہرہ کیا۔Cistanche tubulosa phenylethanoid glycosides(CTPG) وٹرو اور ویوو (24) میں میلانوما B16-F10 خلیوں کی نشوونما کو روک سکتا ہے۔ تاہم، پہلے استعمال شدہ CTPG کی ناقص پانی میں حل پذیری منشیات کی نشوونما کو محدود کرتی ہے (24)۔ لہذا، پانی میں گھلنشیل CTPG (CTPG-W) کا استعمال کیا گیا اور غذائی نالی کے کینسر کے خلیات (Eca-109) پر اینٹیٹیمر اثر کی تحقیقات کی گئیں۔ یہ طے کیا گیا تھا کہ CTPG-W خوراک پر منحصر Eca-109 خلیوں کی عملداری کو مائٹوکونڈریل پر منحصر راستے کے ذریعے apoptosis کی شمولیت کے ذریعے روک سکتا ہے۔
مواد اور طریقے جانور۔
مادہ C57BL/6 چوہوں (6-8 ہفتے، ~25 گرام) بیجنگ لیبارٹری اینیمل ریسرچ سینٹر (بیجنگ، چین) سے خریدے گئے تھے اور درجہ حرارت پر قابو پانے والے (25˚C)، ہلکے سائیکل (12// 12) سنکیانگ یونیورسٹی (ارومچی، چین) کی جانوروں کی سہولت۔ تمام جانوروں کو روگزن سے پاک پانی اور کھانا ملا۔
سیل لائن اور ثقافت۔ انسانی غذائی نالی کے کارسنوما سیل لائن (Eca-109) کو سنکیانگ کلی لیبارٹری آف بائیولوجیکل ریسورسز اینڈ جینیٹک انجینئرنگ (کالج آف لائف سائنس اینڈ ٹیکنالوجی، سنکیانگ یونیورسٹی، ارومچی، چین) نے محفوظ کیا تھا اور RPMI{{1} } میڈیم (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) 10 فیصد ہیٹ ان ایکٹیویٹڈ فیٹل بوائن سیرم (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, China) کے ساتھ ضمیمہ، 1 فیصد L -گلوٹامین (100 ایم ایم)، 100 U/ml پینسلن اور 100 µg/ml streptomycin ایک مرطوب ماحول میں 37˚C پر جس میں 5 فیصد CO2 ہوتا ہے۔
اعلی کارکردگی مائع کرومیٹوگرافی (HPLC)۔ CTPG-W (cat. no. SGJG20170410) Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (شنگھائی، چین) سے خریدا گیا تھا۔ ہمارے پچھلے مطالعہ (24) کے مطابق CTPG کے بڑے مرکبات HPLC کے ذریعہ اہل اور مقدار کے مطابق تھے۔ مختصراً، HPLC کو ZORBAX SB‑C18 کالم (250x4.6 mm; 5 µm) پر 30˚C پر کیا گیا اور 0.2 فیصد فارمک ایسڈ محلول اور 23 فیصد سے شروع ہونے والے میتھانول کے میلان کے ساتھ ایلوٹ کیا گیا، جیسا کہ ہر منٹ میں 1 ملی لیٹر شامل کیا جاتا ہے۔ 31 فیصد تک پہنچنے تک 45 منٹ تک۔ کل 10 μl نمونہ انجکشن کیا گیا تھا اور 330 nm پر پتہ چلا تھا۔ echinacoside معیار کو Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (شنگھائی، چین) سے خریدا گیا تھا، اور ایکٹیوسائیڈ معیار سگما-الڈرچ (Merck KGaA، Darmstadt، Germany) سے خریدا گیا تھا۔ معیارات CTPG-W کے اجزاء کا تجزیہ کرنے کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔
ایم ٹی ٹی پرکھ۔ سیل کے پھیلاؤ کو ایم ٹی ٹی پرکھ سے ماپا گیا۔ Eca{{0}} سیلز کو 5x1 کی کثافت پر 96-کنویں پلیٹوں میں ٹیکہ لگایا گیا تھا0100 µl RPMI{{5 میں 3 سیلز }} درمیانہ/اچھا اور 24 گھنٹے کے لیے 37˚C پر مہذب، پھر 24 گھنٹے کے لیے CTPG-W کے مختلف ارتکاز (0, 200, 400, 600, اور 800 µg/ml) یا 0.4 فیصد ڈائمتھائل سلفوکسائیڈ (DMSO) کے ذریعے علاج کیا جاتا ہے، 48 اور 72 ح. DMSO کو سالوینٹ کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا (800 µg/ml CTPG-W جس میں 0.4 فیصد DMSO ہے)۔ سسپلٹین (20 µg/ml) کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ اس کے بعد، کمرے کے درجہ حرارت پر 5 منٹ کے لیے 225 xg پر سینٹرفیوگریشن کے بعد سپرنٹنٹ کو ضائع کر دیا گیا، اور 100 μl MTT محلول (0.5 mg/ml RPMI-1640 میڈیم میں FBS کے بغیر) ہر کنویں میں شامل کیا گیا اور 37˚C پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ 3 گھنٹے کے لیے تشکیل شدہ فارمازان کرسٹل 200 μl DMSO میں تحلیل ہوگئے تھے۔ آپٹیکل کثافت (OD) کی قدریں 490 nm کی طول موج پر ایک 96- ویل مائکروپلیٹ ریڈر (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) کے ذریعے ناپی گئیں۔ متعلقہ سیل کی عملداری کا حساب اس فارمولے کے مطابق کیا گیا تھا: سیل کی عملداری ( فیصد )=(ODtreated/ODuntreated)x100 فیصد ۔ Eca-109 خلیوں کی شکل کو ایک الٹی فلوروسینس مائکروسکوپ (میگنیفیکیشن، x200) (Nikon Eclipse Ti‑E؛ Nikon Corporation، Tokyo، Japan) کے ساتھ دیکھا گیا۔
splenocytes کے پھیلاؤ کے لئے، C57BL/6 چوہوں کو گریوا کی سندچیوتی کے ذریعہ خوش کیا گیا تھا، اور تلیوں کو الگ تھلگ کردیا گیا تھا۔ سنگل سیل سسپینشن بنایا گیا تھا اور اسپلینوسائٹس کو 1x1 کی کثافت پر 96-کنویں پلیٹوں میں سیڈ کیا گیا تھا0100 µl RPMI-1640 میڈیم میں 5 سیل/کنواں، اور پھر مختلف ارتکاز کے ساتھ علاج کیا گیا تھا۔ CTPG-W کا (0, 200, 400, 600, اور 800 µg/ml) 24, 48 اور 72 h کے لیے 37˚C پر 5 فیصد CO2 کے ساتھ۔ مذکورہ بالا پروٹوکول کے مطابق، splenocytes کے پھیلاؤ کو MTT پرکھ کے ذریعے ماپا گیا تھا۔ محرک انڈیکس{{20}ODtreated/ODuntreated.
اپوپٹوسس اور سیل سائیکل کی پیمائش۔ Eca{{0}} خلیوں کو 2.5x1 کی کثافت پر 60 ملی میٹر ڈشز میں کلچر کیا گیا تھا }، 200، 400، 600، اور 800 µg/ml) CTPG-W یا 0.4 فیصد DMSO 24 گھنٹے کے لیے 37˚C پر 5 فیصد CO2 کے ساتھ۔ مینوفیکچررز کے پروٹوکول کے مطابق سیلز کو Annexin V‑fluorescein isothiocyanate (FITC)/Propidium iodide (PI) Apoptosis Detection kit (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) کے ساتھ اکٹھا اور داغ دیا گیا تھا۔ نمونے فلو سائٹومیٹری (BD FACSCalibur؛ BD بایوسینسز، فرینکلن لیکس، NJ، USA) کے ذریعے جمع کیے گئے اور FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA) کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔ سیل سائیکل پر CTPG-W کے اثر کا تجزیہ کرنے کے لیے، 2.5x105 Eca-109 خلیات کو 60 ملی میٹر کلچر ڈشز میں سیڈ کیا گیا اور CTPG-W (0, 100, 200, اور 400 µg/ml) یا 0.4 کے ساتھ علاج کیا گیا۔ فیصد DMSO 24 گھنٹے کے لیے 37˚C پر 5 فیصد CO2 کے ساتھ۔ تمام خلیوں کی کٹائی اور دو بار آئس کولڈ پی بی ایس (گبکو؛ تھرمو فشر سائنٹیفک، انکارپوریٹڈ) کے ساتھ دھویا گیا، پھر 30 منٹ کے لیے 4˚C پر 70 فیصد آئس کولڈ ایتھنول میں طے کیا گیا۔ آئس کولڈ پی بی ایس کے ساتھ دو بار دھونے کے بعد، کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ کے لیے 300 μl PI/RNase سٹیننگ بفر (BD Biosciences، San Jose، CA، USA) میں سیلز کو دوبارہ معطل کر دیا گیا۔ سیل سائیکل کی تقسیم کا تجزیہ ModFit LT 3.0 سافٹ ویئر کے ذریعے بہاؤ cytometry (BD FACSCalibur) کے ذریعے کیا گیا۔
مائٹوکونڈریل جھلی کی صلاحیت (Δψm) اور رد عمل آکسیجن پرجاتیوں (ROS) کا تجزیہ۔ Δψm کا تجزیہ کرنے کے لیے، Eca{{0}} سیلز کا علاج CTPG-W (0, 400, 600 اور 800 µg/ml) یا 24 کے لیے 0.4 فیصد DMSO سے کیا گیا۔ h 37˚C پر 5 فیصد CO2 کے ساتھ، اور JC-1 (بیو ٹائم انسٹی ٹیوٹ آف بائیو ٹیکنالوجی، شنگھائی، چین) کے ساتھ مائٹوکونڈریل میمبرین پوٹینشل پرکھ کٹ سے داغدار، مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق، 37˚C پر 20 منٹ کے لیے . JC-1 واشنگ بفر (Beyotime Institute of Biotechnology) کے ساتھ دو بار دھونے کے بعد، نمونوں کو 300 µl JC-1 واشنگ بفر کے ساتھ دوبارہ معطل کیا گیا اور فلو سائٹومیٹری (BD FACSCalibur) کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔ Eca-109 خلیوں میں JC-1 ڈائی کا فلوروسینس بھی ایک الٹی فلوروسینس مائکروسکوپ (میگنیفیکیشن، x200؛ Nikon Eclipse Ti‑E) کے ساتھ دیکھا گیا۔ ROS کے تجزیہ کے لیے، Eca-109 خلیات کا علاج CTPG-W (0, 400, 600, اور 800 µg/ml) کے ساتھ 2, 4, 6, 12, اور 24 h کے لیے کیا گیا، اور Reactive Oxygen Species سے داغدار کیا گیا۔ Assay Kit (Beotime Institute of Biotechnology)، کارخانہ دار کے پروٹوکول کے مطابق، 37˚C پر 20 منٹ کے لیے۔ آئس کولڈ پی بی ایس کے ساتھ تین بار دھونے کے بعد، فلو سائٹومیٹری (BD FACSCalibur) کے ذریعے نمونے جمع کیے گئے اور FlowJo 7.6 سافٹ ویئر کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔
2,2‑ڈفینائل‑1‑picrylhydrazyl (DPPH) ریڈیکل اسکیوینگنگ سرگرمی۔ CTPG-W کی فری ریڈیکل سکیوینگنگ سرگرمی کا تعین DPPH فری ریڈیکل پرکھ کے ساتھ شائع شدہ پروٹوکول کے مطابق ایک معمولی ترمیم کے ساتھ کیا گیا تھا، کیونکہ DPPH (25,26) کو تحلیل کرنے کے لیے میتھانول کو ایتھنول سے بدل دیا گیا تھا۔ مستحکم حالت کی پیمائش کے لیے، ایتھنول میں 150 µl DPPH (100 mmol/l) کو CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400، 500، اور 600 µg/ml) 50 µl PBS میں، اور کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ تک اندھیرے میں سینکا۔ CTPG-W کی موجودگی اور غیر موجودگی میں 517 nm پر جاذبیت کا پتہ چلا۔ مجموعی طور پر 50 µl وٹامن سی کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا۔ DPPH ریڈیکل سکیوینگنگ سرگرمی کا حساب فارمولہ استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا: سکیوینگنگ ( فیصد )=[1-(ایک نمونہ-Ablank)/A0] x100، جہاں Ablank کنٹرول کا جذب ہے (DPPH کے بغیر)، ایک نمونہ نمونے کا جذب ہے اور A0 DPPH کے ساتھ PBS کا جذب ہے۔
مغربی دھبے کا تجزیہ۔ Eca{{0}} خلیوں کا علاج CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) یا 0.4 فیصد DMSO کے ساتھ 24 گھنٹے کے لیے 37˚C پر 5 فیصد CO2 کے ساتھ کیا گیا۔ PBS کے ساتھ مندرجہ ذیل دو بار دھونے کے بعد، خلیات کو Radioimmunoprecipitation Assay Lysis بفر (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd.، بیجنگ، چین) میں برف پر 20 منٹ کے لیے لیس کیا گیا۔ 10،000 xg پر 10 منٹ کے لیے 4˚C پر سینٹری فیوگریشن کے بعد، سپرنٹنٹس کو اکٹھا کیا گیا، اور مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق ایک بائی سینچونینک ایسڈ کٹ (تھرمو فشر سائنٹیفک، انکارپوریٹڈ) کے ساتھ پروٹین کی تعداد کا پتہ چلا۔ مغربی بلٹ تجزیہ ہماری پچھلی تفصیل (24) کے مطابق کیا گیا تھا۔ کیسپیس کے خلاف اینٹی باڈیز-7 (کیٹ نمبر D120077)، کیسپیس-8 (کیٹ نمبر D155240)، کیسپیس-9 (بلی نمبر D220078)، بی سیل لیمفوما-7 (بی سی ایل ) (بلی نمبر D111050) اور اینٹی خرگوش IgG-HRP (بلی نمبر D110058) بی بی آئی لائف سائنسز (شنگھائی، چین) سے خریدے گئے تھے۔ کیسپیس کے خلاف اینٹی باڈیز-3 (بلی نمبر E-AB-10050) اور ایکٹو کیسپیس-3 (بلی نمبر E-AB-22115) Elabscience سے خریدے گئے تھے۔ ووہان، چین)۔ کیسپیس کے خلاف دیگر اینٹی باڈیز-7 (بلی نمبر 9492)، پولی (ADP-ribose) پولیمریز (PARP) (cat. no. 9542)، cytochrome c (cat. no. AC909)، c-Jun NH{ {48}}ٹرمینل کناز (JNK) (cat. no. 9252S)، اور -actin (cat. no. 58169) Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) سے حاصل کیے گئے تھے۔ تمام پرائمری اور سیکنڈری اینٹی باڈیز کو 1:1،000 پر گھٹا دیا گیا تھا۔ پرائمری اینٹی باڈیز کو راتوں رات 4˚C پر انکیوبیٹ کیا جاتا تھا اور ثانوی اینٹی باڈیز کو 37˚C پر 1 گھنٹے کے لیے انکیوبیٹ کیا جاتا تھا۔
مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق، ٹارگٹ پروٹینز کو ایک بہتر کیمیلومینیسینس پرکھ کٹ (بیو ٹائم انسٹی ٹیوٹ آف بائیو ٹیکنالوجی) کا استعمال کرتے ہوئے پتہ چلا۔
شماریاتی تجزیہ. ٹکی کے پوسٹ ہاک ٹیسٹ کے ساتھ تغیر کے یک طرفہ تجزیہ سے شماریاتی اہمیت کا اندازہ لگایا گیا اور علاج اور کنٹرول گروپوں میں گراف پیڈ پرزم 5{2}} سافٹ ویئر (گراف پیڈ سافٹ ویئر، لا جولا، CA، USA) کا استعمال کرتے ہوئے نتائج کا تجزیہ کیا گیا۔ تمام اعداد و شمار کو اوسط ± معیاری انحراف کے طور پر پیش کیا گیا تھا۔ پی<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Cistanche tubulosa phenylethanoid glycosides(CTPG)
نتائج
CTPG-W Eca-109 خلیوں کی نشوونما کو روکتا ہے۔ CTPG-W کے اجزاء HPLC (تصویر 1) کے ذریعہ اہل اور مقدار کے مطابق تھے، جن کا موازنہ echinacoside اور acteoside کے معیارات سے کیا گیا تھا۔ چوٹی برقرار رکھنے کے اوقات اور چوٹی کے علاقوں کے مطابق، CTPG-W میں 39.16 فیصد echinacoside اور 2.44 فیصد ایکٹیوسائیڈ تھا۔ سب سے پہلے، Eca-109 خلیات کی عملداری پر CTPG-W کے اثر کا تعین MTT پرکھ سے کیا گیا تھا۔ CTPG-W کو DMSO میں 200 mg/ml پر تحلیل کیا گیا تھا اور RPMI-1640 میڈیم کے ساتھ پتلا کیا گیا تھا جس میں 10 فیصد حرارت سے غیر فعال FBS اشارہ شدہ ارتکاز میں تھا۔ Eca-109 سیلز کا علاج CTPG-W کے ساتھ کیا گیا تھا اور سیل کی قابل عملیت کا تجزیہ ایم ٹی ٹی پرکھ کے ساتھ اشارہ کردہ ٹائم پوائنٹس پر کیا گیا تھا۔ CTPG‑W علاج نے خوراک اور وقت پر منحصر انداز میں Eca-109 خلیوں کی عملداری کو نمایاں طور پر کم کیا (P<0.001; fig.="" 2a).="" the="" morphology="" of="" eca-109="" cells="" was="" observed="" with="" an="" inverted="" fluorescence="" microscope="" (magnification,="" x200)="" following="" ctpg‑w="" treatment="" for="" 24="" h,="" which="" changed="" notably="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" with="" the="" cells="" shrinking="" and="" becoming="" round="" following="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 2b).="" these="" results="" indicate="" that="" ctpg-w="" suppresses="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells.="" the="" effect="" of="" ctpg-w="" on="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" was="" also="" detected="" with="" an="" mtt="" assay.="" ctpg-w="" significantly="" promoted="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="" 2c),="" indicating="" that="" it="" has="" no="" cytotoxic="" effect="" on="">
CTPG-W Eca-109 خلیوں میں apoptosis کو اکساتا ہے۔ یہ جانچنے کے لیے کہ آیا CTPG-W نے apoptosis یا necrosis کی شمولیت کے ذریعے Eca-109 خلیات کی نشوونما کو دبایا، خلیوں کا علاج CTPG-W کے مختلف ارتکاز کے ساتھ کیا گیا۔ 24 گھنٹے کے بعد، Eca-109 خلیوں کے apoptosis اور necrosis کا پتہ Annexin V/PI سٹیننگ کے ساتھ ہوا۔ جیسا کہ تصویر 3A میں دکھایا گیا ہے، Annexin V-/PI پلس خلیوں کو necrotic خلیات کے طور پر گیٹ کیا گیا تھا، اور Annexin V پلس /PI پلس اور Annexin V پلس /PI- خلیوں کو اپوپٹوٹک خلیوں کے طور پر گیٹ کیا گیا تھا۔ CTPG-W نے بنیادی طور پر خوراک پر منحصر طریقے سے Eca{10}} خلیوں کے apoptosis کی حوصلہ افزائی کی، حالانکہ necrotic Eca-109 خلیات بھی 600 اور 800 µg/ml CTPG-W (P) کے علاج کے تحت نمایاں طور پر بڑھے۔<0.001 at="" 600="" µg/ml="" and=""><0.05 at="" 800="" µg/ml).="" consistently,="" the="" levels="" of="" pro-apoptotic="" bax="" and="" anti-apoptotic="" bcl-2="" in="" eca-109="" cells="" were="" upregulated="" and="" downregulated,="" respectively,="" upon="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 3b).="" the="" results="" indicated="" that="" ctpg-w="" primarily="" inhibited="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells="" through="" the="" induction="" of="">
CTPG‑W Eca-109 خلیوں میں S مرحلے میں سیل سائیکل گرفتاری کو اکساتا ہے۔ کینسر سیل سائیکل کی خرابی سیل کی ترقی کو دبائے گی اور apoptosis کو فروغ دے گی (27). Eca-109 خلیات میں سیل سائیکل کی تقسیم کا پتہ 24 گھنٹے کے لیے CTPG-W کے علاج کے بعد PI سٹیننگ کے ساتھ پایا گیا۔ یہ دیکھا گیا کہ S مرحلے میں خلیات میں اضافہ ہوا اور G0/G1 مراحل میں خلیات نے CTPG-W علاج (P) پر مجموعی طور پر نمایاں کمی کی نشاندہی کی۔<0.05; fig.="" 4),="" indicating="" that="" ctpg-w="" arrests="" the="" eca-109="" cell="" cycle="" at="" the="" s="">
CTPG‑W Δψm کو کم کرتا ہے اور سائٹوکوم c کی رہائی کو اکساتا ہے۔ اپوپٹوس کو مائٹوکونڈریل پر منحصر راستہ (28,29) کے ذریعہ متاثر کیا جاسکتا ہے۔ BCL-2 پروٹین فیملی کے حامی اور اینٹی اپوپٹوٹک اراکین مائٹوکونڈریل میمبرین انٹیگریٹی (30,31) کے ضابطے میں اہم کردار ادا کرتے ہیں۔ 24 گھنٹے کے لئے CTPG-W علاج کے بعد، Δψm کا اندازہ JC-1 سٹیننگ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ JC‑1 مجموعی (FL‑2 میں سرخ فلوروسینس کا پتہ چلا) monomer میں ٹوٹ جائے گا (FL-1 میں سبز فلوروسینس کا پتہ چلا) جب Δψm کم ہو رہا ہو (32)۔ جیسا کہ تصویر 5A میں دکھایا گیا ہے، FL-1 plus FL-2-/ plus خلیات کی تعدد خوراک پر منحصر انداز میں نمایاں طور پر بڑھی ہے، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ Eca-109 خلیوں کے Δψm میں کمی واقع ہوئی ہے۔ Eca-109 خلیات میں فلوروسینس تبدیلیوں کو ایک الٹی فلوروسینس مائکروسکوپ (تصویر 5B) کے ساتھ بھی دیکھا گیا۔ CTPG-W کے بڑھتے ہوئے ارتکاز کے ساتھ، سرخ فلوروسینس میں کمی واقع ہوئی اور سبز فلوروسینس میں اضافہ ہوا، جو کہ فلو سائٹومیٹری کے ڈیٹا سے مطابقت رکھتا ہے۔ یہ بھی دیکھا گیا کہ cytosol میں cytochrome c کی سطح نمایاں طور پر بڑھی تھی (تصویر 5C)، جو Δψm کی کمی کا نتیجہ ہے۔ یہ FL-1 plus FL-2-/ plus خلیات کی بڑھتی ہوئی تعداد سے اخذ کردہ نتیجہ کو تقویت دیتا ہے جو CTPG-W علاج کے نتیجے میں Δψm کم ہوئے ہیں۔ یہ اطلاع دی گئی ہے کہ JNK BCL-2 پروٹین فیملی کی ایکٹیویشن کو ریگولیٹ کر سکتا ہے جس سے سائٹوکوم سی (33-35) کی رہائی ہوتی ہے۔ یہ بھی طے پایا کہ CTPG-W علاج (تصویر 5C) کے بعد JNK کی سطح کو نمایاں طور پر بڑھا دیا گیا تھا۔ نتائج نے اشارہ کیا کہ CTPG-W مائٹوکونڈریل پر منحصر راستے کے ذریعے Eca-109 خلیات کے اپوپٹوسس کو آمادہ کر سکتا ہے۔
انٹرا سیلولر ROS جنریشن پر CTPG-W کا اثر۔ ROS apoptosis (36) کو دلانے کے لئے Δψm کو کم کرسکتا ہے۔ یہ جانچنے کے لیے کہ آیا CTPG-W ROS کی پیداوار میں اضافہ کر سکتا ہے، Eca-109 خلیوں کا علاج CTPG-W کے مختلف ارتکاز کے ساتھ کیا گیا۔ سیلز کو اشارہ کردہ ٹائم پوائنٹس پر جمع کیا گیا تھا اور DCFH-DA سے داغ دیا گیا تھا۔ Eca-109 خلیوں میں انٹرا سیلولر ROS کی پیداوار کا تعین بہاؤ سائٹومیٹری کے ذریعے کیا گیا تھا۔ جیسا کہ تصویر 6A میں دکھایا گیا ہے، 800 µg/ml CTPG-W نے ROS کی پیداوار میں 2-6h سے نمایاں اضافہ کیا اور 12-24 h سے کم ہوا۔ مزید برآں، 400 µg/ml CTPG‑W نے ROS کی پیداوار میں 12-24 h سے نمایاں اضافہ کیا۔ مزید برآں، 200 µg/ml CTPG-W نے ROS کی پیداوار کو خاص طور پر تبدیل نہیں کیا۔ ROS کی پیداوار کی متحرک تبدیلیاں Eca-109 سیل اپوپٹوس سے وابستہ ہو سکتی ہیں۔ یہ بھی طے کیا گیا تھا کہ CTPG-W میں آزاد ریڈیکل سکیوینگنگ سرگرمی (تصویر 6B) تھی، جو 12 گھنٹے کے بعد 800 µg/ml CTPG-W کے ساتھ علاج کیے جانے والے Eca-109 خلیوں میں ROS کی پیداوار میں کمی سے منسلک ہو سکتی ہے۔
CTPG‑W caspase‑3، caspase‑7، caspase‑9 اور PARP کی سرگرمی کو اپ گریڈ کرتا ہے۔ Δψm کی کمی کی وجہ سے سائٹوکوم سی کی رہائی اپوپٹوسس (29,30,37) کو دلانے کے لئے کیسپیس پروٹیز کو چالو کرسکتی ہے۔ 24 گھنٹے کے لیے CTPG-W کے علاج کے بعد، کیسپیس-3، 7، 8، 9، اور PARP کے فعال ہونے کا پتہ مغربی دھبے کے تجزیہ سے ہوا۔ کنٹرول کے ساتھ مقابلے میں، کلیویڈ-کیسپیس-9، کلیویڈ-کیسپیس-7، کلیویڈ-کیسپیس-3، اور کلیویڈ-PARP کی سطحیں، لیکن کلیویڈ-کیسپیس کی سطحیں نہیں{{ 20}}، خوراک پر منحصر طریقے سے CTPG علاج کے ذریعے اپ ریگولیٹ کیے گئے تھے (تصویر 7)۔ ان نتائج نے اشارہ کیا کہ CTPG-W نے Δψm کو کم کیا اور کیسپیسز کو چالو کرنے کے لیے سائٹوکوم سی ریلیز کو فروغ دیا جو Eca-109 خلیات کے اپوپٹوسس کو اکساتے ہیں۔
Cistanche tubulosa اقتباس
بحث
روایتی CHM مختلف راستوں کے ذریعے غذائی نالی کے کینسر کے خلیوں کے اپوپٹوس کو آمادہ کر سکتا ہے، بشمول خارجی موت کے رسیپٹر، اندرونی مائٹوکونڈریل اور اینڈوپلاسمک ریٹیکولم اسٹریس پاتھ ویز (29)۔ ہمارے پچھلے مطالعے نے یہ ظاہر کیا کہ CTPG، C. tubulosa کے بڑے جزو کے طور پر، میلانوما B16-F10 خلیات کی افزائش کو مائٹوکونڈریل پر منحصر راستے (24) کے ذریعے apoptosis کی شمولیت سے روکتا ہے۔ موجودہ مطالعہ میں، Eca-109 خلیوں پر CTPG-W کے اینٹی ٹیومر اثر کی تحقیق کی گئی اور یہ طے پایا کہ CTPG-W نے Eca-109 خلیوں کی نشوونما، حوصلہ افزائی apoptosis، اور سیل سائیکل گرفتاری کو دبایا، کم Δψm، سائٹوکوم سی کی رہائی میں اضافہ اور چالو کیسپیسز۔ CTPG اور CTPG-W کینسر کے خلیوں میں apoptosis اور سیل سائیکل گرفتاری کو آمادہ کر سکتے ہیں۔ تاہم، CTPG (26.64 فیصد echinacoside، 10.19 فیصد ایکٹیوسائیڈ، اور 1.71 فیصد isoacteoside) اور CTPG-W (39.16 فیصد echinacoside اور 2.44 فیصد ایکٹیوسائیڈ) کے مختلف اجزاء کی وجہ سے درست طریقہ کار مختلف ہیں۔ CTPG نے B16-F10 سیلز کو G0/G1 مراحل میں گرفتار کیا، لیکن CTPG-W نے Eca-109 سیلز کو S فیز (24) میں گرفتار کیا۔ ROS کی پیداوار میں خوراک پر منحصر CTPG کے ذریعے اضافہ کیا گیا تھا، لیکن اس نے CTPG-W کی ایک اعلی خوراک کے ذریعے وقت پر منحصر انداز میں تبدیلی کی نشاندہی کی، جس میں CTPG-W علاج کے آغاز میں نمایاں اضافہ ہوا (2-6 h) اور کنٹرول کے مقابلے میں 12 گھنٹے کے بعد نمایاں کمی آئی۔ ایک ممکنہ وجہ یہ ہے کہ CTPG-W کا بڑا جزو echinacoside ہے۔ متعدد مطالعات میں بتایا گیا ہے کہ echinacoside ROS کی پیداوار اور ROS کی حوصلہ افزائی اپوپٹوسس کو اپنے نیوروپروٹیکٹو اور اینٹی ایجنگ اثرات (38-40) کو استعمال کرنے کے لیے روک سکتا ہے۔ اسی طرح، موجودہ مطالعہ میں آزاد ریڈیکل سکیوینگنگ سرگرمی دیکھی گئی۔ لہذا، یہ قیاس کیا گیا تھا کہ CTPG-W کی زیادہ مقدار میں verbascoside، iso-verbascoside، اور salidroside سمیت کچھ اجزاء Eca-109 خلیات (41,42) کے اپوپٹوسس کا سبب بننے کے لیے فوری طور پر ROS جنریشن کو آمادہ کر سکتے ہیں، اور پھر ROS کو echinacoside کے ذریعہ صاف کیا گیا تھا۔ CTPG اور CTPG-W کے ذریعہ ROS کی پیداوار میں فرق کی ایک اور ممکنہ وجہ یہ ہے کہ اس مطالعہ اور پچھلے مطالعہ (24) میں مختلف سیل لائنوں کا استعمال کیا گیا تھا۔ ڈونگ ایٹ ال (43) نے اطلاع دی ہے کہ ایچیناکوسائڈ آر او ایس کی سطح میں اضافے کے بغیر آکسیڈیٹیو ڈی این اے نقصانات کی نسل کے ذریعے انسانی SW480 کولوریکٹل کینسر کے خلیوں کے اپوپٹوس کو آمادہ کرسکتا ہے۔
CTPG-W علاج نے Δψm کو کم کیا اور سائٹوکوم c کی رہائی کا سبب بنا، جو کیسپیس کے کلیویج کو فروغ دیتا ہے-9 (28)۔ مستقل طور پر، CTPG-W ٹریٹمنٹ کے ذریعے کلیویڈ کیسپیس-9 کی سطحوں کو اپ ریگولیٹ کیا گیا تھا۔ اس کے بعد، فعال کیسپیس-9 اپوپٹوس (44) کو دلانے کے لیے کیسپیس-3 کو چالو کر سکتا ہے۔ CTPG-W ٹریٹمنٹ کے ذریعے کلیویڈ کیسپیس کی سطحوں کو بھی اپ ریگولیٹ کیا گیا تھا۔ تاہم، کیسپیس-8 کو CTPG-W کے ذریعے چالو نہیں کیا گیا تھا، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ CTPG-W کے ذریعے پیدا ہونے والے اپوپٹوسس میں خارجی موت کے رسیپٹر کا راستہ شامل نہیں تھا۔ یہ مشاہدات بتاتے ہیں کہ CTPG-W مائٹوکونڈریل پر منحصر راستے کو چالو کرنے کے ذریعے Eca-109 خلیوں کے apoptosis کو اکساتا ہے۔
PARP جینومک استحکام میں اہم کردار ادا کرتا ہے اور اسے فعال کیسپیسز، خاص طور پر کیسپیس-3 اور -7 (45) کے ذریعے صاف کیا جا سکتا ہے۔ یہ طے کیا گیا تھا کہ CTPG-W علاج نے کیسپیس کو چالو کیا ہے-3 اور -7، جو ڈی این اے کی مرمت کو روکنے اور اپوپٹوسس کا سبب بننے کے لیے PARP کو بند کر سکتا ہے۔
CTPG-W خوراک اور وقت پر منحصر انسانی ہیپاٹو سیلولر کارسنوما BEL-7404 خلیات (غیر مطبوعہ ڈیٹا) کی نشوونما کو بھی روکتا ہے۔ اگرچہ CTPG-W Eca-109 اور BEL-7404 خلیوں کی نشوونما کو روکتا ہے، لیکن یہ splenocytes کے پھیلاؤ کو فروغ دیتا ہے، جو CTPG-W میں پولی سیکرائڈز (~50 فیصد) کے مواد کی وجہ سے ہو سکتا ہے۔ )۔ اسی طرح، متعدد مطالعات نے اطلاع دی ہے کہ پولی سیکرائڈز اسپلینوسائٹس (46-49) کے پھیلاؤ کو فروغ دے سکتے ہیں۔ ماؤس ماڈل میں، یہ طے کیا گیا تھا کہ کنٹرول گروپ کے مقابلے میں CTPG-W نے تلی کے انڈیکس میں نمایاں اضافہ کیا ہے، لیکن اس نے جسمانی وزن اور دیگر اعضاء کے اشاریہ جات بشمول دل، جگر، گردے، اور پھیپھڑے (غیر مطبوعہ ڈیٹا) کو متاثر نہیں کیا۔ یہ بتاتا ہے کہ CTPG-W کا عام خلیوں پر کوئی سائٹوٹوکسک اثر نہیں ہے۔
مجموعی طور پر، ڈیٹا نے اشارہ کیا کہ CTPG-W مائٹوکونڈریل پر منحصر راستے کے ذریعے اپوپٹوسس کی شمولیت سے Eca-109 خلیوں کی نشوونما کو روکتا ہے۔
cistanche فوائد: مخالف apoptosis
اعترافات
مصنفین اس نسخے کو چمکانے کے لیے ڈاکٹر جیانہوا یانگ (بیلر کالج آف میڈیسن) کا شکریہ ادا کرنا چاہیں گے۔
فنڈنگ
اس مطالعہ کو کلیدی نظم و ضبط حیاتیات کے بولی کے منصوبے (گرانٹ نمبر 17SDKD0202)، سنکیانگ نارمل یونیورسٹی اور سنکیانگ میں خصوصی ماحولیاتی حیاتیاتی تنوع کی درخواست اور ضابطے کی کلیدی لیبارٹری (گرانٹ نمبر XJTSWZ-2017-04) کے لیے 13ویں پانچ سالہ منصوبے کی حمایت حاصل تھی۔ XW کو JL اور چائنیز نیشنل نیچرل سائنس فاؤنڈیشن گرانٹ (گرانٹ نمبر 31760260)۔
ڈیٹا اور مواد کی دستیابی
موجودہ مطالعہ کے دوران استعمال شدہ اور تجزیہ کردہ ڈیٹا اور مواد متعلقہ مصنف سے معقول درخواست پر دستیاب ہیں۔
مصنفین کی شراکتیں۔
CF، AA، YY، اور QC نے تجربات کئے۔ LX، JLv، اور XW نے ڈیٹا اور تیار کردہ اعداد و شمار کا تجزیہ کیا۔ JinyuL اور JinyaoL نے پروجیکٹ کو ڈیزائن کیا اور مخطوطہ لکھا۔
اخلاقیات کی منظوری اور شرکت کے لیے رضامندی۔
حیاتیاتی وسائل اور جینیاتی انجینئرنگ کی سنکیانگ کلیدی لیبارٹری (منظوری، نمبر BRGE-AE001؛ سنکیانگ یونیورسٹی) کی جانوروں کے تجربات کی اخلاقیات کی کمیٹی نے جانوروں کے تمام تجربات کی منظوری دی تھی۔
اشاعت کے لیے مریض کی رضامندی۔
قابل اطلاق نہیں۔
مسابقتی مفادات
مصنفین اعلان کرتے ہیں کہ ان کی کوئی مسابقتی دلچسپی نہیں ہے۔
حوالہ جات
وو سی آر، لن ایچ سی، اور ایس یو ایم ایچ: پانی سے الٹ جاناCistanche tubulosa کے عرقالزائمر کی بیماری جیسے چوہے کے ماڈل میں طرز عمل کے خسارے سے: امیلائڈ جمع کرنے اور مرکزی نیورو ٹرانسمیٹر فنکشن کے لئے مطابقت۔ BMC Complement Altern Med 14: 202، 2014۔
Li J، Aspire A، Gao L، Huo S، Luo J اور Zhang F:Cistanche tubulosa سے Phenylethanoid glycosidesمائٹوکونڈریا پر منحصر پاتھ وے کے ذریعے اپوپٹوسس شامل کرکے وٹرو اور ویوو دونوں میں B16-F10 خلیوں کی نشوونما کو روکتا ہے۔ جے کینسر 7: 1877-1887، 2016۔
برانڈ ولیمز ڈبلیو، کلور ایم ای، اور بیرسیٹ سی: اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی کا اندازہ کرنے کے لیے ایک آزاد بنیاد پرست طریقہ کار کا استعمال۔ LWT-Food Sci Technol 28: 25-30، 1995۔
