Streptozotocin-Nicotinamide-حوصلہ افزائی ذیابیطس چوہوں میں مردانہ تولیدی فعل پر Cistanche Tubulosa Extracts کا اثر-Ⅰ

1. تعارف

ذیابیطس mellitus (DM) ایک ایسی حالت ہے جس میں اضافہ ہوتا ہے۔گلوکوز کی سطحخون میں لبلبہ کی کافی انسولین پیدا کرنے میں ناکامی، یا جسم کے مؤثر طریقے سے استعمال کرنے میں ناکامی کی وجہ سے۔ ڈبلیو ایچ او کے مطابق ذیابیطس کے شکار افراد کی تعداد 1980 میں 108 ملین سے بڑھ کر 2014 میں 422 ملین ہو گئی [1]۔ چار اہم قسمیں ہیں: پری ذیابیطس (ذیابیطس سے پہلے کا مرحلہ)، ٹائپ 1 (جہاں لبلبہ انسولین پیدا کرنے میں ناکام رہتا ہے)، ٹائپ 2 (جسم انسولین استعمال کرنے میں ناکام رہتا ہے)، اور حمل ذیابیطس (جو حمل کے دوران ہوتا ہے)۔ آکسیڈیٹیو تناؤ ری ایکٹیو آکسیجن پرجاتیوں (ROS) اور اینٹی آکسیڈنٹ [2] کی پیداوار کے درمیان عدم توازن کی وجہ سے ہوتا ہے جو بالآخر ذیابیطس کی حالت کا باعث بنتا ہے۔ ذیابیطس کی پیچیدگیوں میں گردے کا خراب ہونا، اعصابی نقصان، اندھا پن، فالج، ہارٹ اٹیک، جنین کی موت اور بانجھ پن شامل ہیں۔ [1]۔ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ مرد ذیابیطس کے مریضوں میں سپرم نیوکلی، ڈی آکسیریبونیوکلک ایسڈ (ڈی این اے) اور مائٹوکونڈریا کو نمایاں طور پر نقصان پہنچا ہے۔ سپرم کی نقل و حمل کے دوران آکسیڈیٹیو تناؤ مردانہ تولیدی نظام کے عمل کو بدل دے گا [4,5]۔

جنسی فعل کو بہتر بنانے کے لیے نیچرل سیسٹینچ ٹیبلوسا PHGS75% ECH 30% ACT 12%

نطفہ پیدا کرنے کے عمل کو ہائپوتھیلمس – پٹیوٹری – گوناڈل (HPG) محور کے ذریعے کنٹرول کیا جاتا ہے۔ ہائپوتھیلمس کے ذریعہ تیار کردہ گوناڈوٹروپین جاری کرنے والا ہارمون (GnRH) luteinizing ہارمون (LH) اور follicle-stimulating hormone (FSH) کی پیداوار کو متحرک کرتا ہے۔ Leydig خلیات seminiferous tubule اور سے ملحق پائے جاتے ہیں۔ٹیسٹوسٹیرون پیداLH کے کنٹرول میں FSH اینٹیجن بائنڈنگ پروٹین (ABP) کی پیداوار کو متحرک کرتا ہے جو مردانہ ہارمون کو منتقل کرنے میں مدد کرتا ہے۔ اس طرح، بانجھ پن اور دیگر مسائل بنیادی طور پر HPG محور میں ہونے والے خلل کی وجہ سے پیدا ہوتے ہیں۔ اسٹریپٹوزوٹوسن – نیکوٹینامائڈ کے امتزاج کا انتظام تجرباتی چوہوں میں ذیابیطس کی حوصلہ افزائی کرتا ہے۔ Streptozotocin ایک کیمیائی مرکب ہے جو لبلبہ میں انسولین پیدا کرنے والے خلیوں کے لیے زہریلا ہے اور نیکوٹینامائڈ پانی میں حل ہونے والا وٹامن ہے جو خلیوں کو مکمل نقصان سے بچاتا ہے [6]۔

Cistanche tubulosa ایک صحرائی پودوں کی نسل ہے جسے "Rou Cong-Rong" [7] کے نام سے بھی جانا جاتا ہے۔ یہ ایک غیر کلوروفیلک پرجیوی پودا ہے جو بنیادی طور پر کیلوٹروپیس پروسیرا کے درخت کی جڑ پر اگتا ہے اور گانسو، چنگھائی، سنکیانگ، منگولیا، ایران اور ہندوستان کی بنجر زمین میں وسیع پیمانے پر تقسیم ہوتا ہے۔ Cistanche tubulosa کا عام نام "Desert Hyacinth" ہے۔ اسے چینی روایتی ادویات میں بڑے پیمانے پر قبول کیا جاتا ہے اور اسے "صحرا کا Ginseng" کا نام دیا گیا ہے۔ یہ دواؤں کے میدان میں مربیڈ لیکوریا، پرفیوز میٹروریا، دائمی گردوں کی بیماریوں، قبض، نامردی اور بانجھ پن کے علاج کے لیے وسیع پیمانے پر استعمال ہوتا ہے۔ کے کیمیائی اجزاءCistanche tubulosa غیر مستحکم phenylethanoid glycosides پر مشتمل ہوتا ہے۔(PHGs)، iridoids، lignans، volatile oils، alditols، oligosaccharides، اور polysaccharides [8]۔ مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہechinacosideاس جڑی بوٹی سے آر او ایس کی سطح کو ریگولیٹ کرکے خراب شدہ فائبروبلاسٹ کی حفاظت کرتا ہے [9]۔ یہ کمپاؤنڈ اینٹی آکسیڈینٹ، ویسورلیکسیشن، اور اینٹی سوزش سرگرمیاں پیدا کرتا ہے جس میں نیورو پروٹیکشن اور آسٹیوپوروسس کی روک تھام ہوتی ہے [10,11]۔

اس مطالعہ کا مقصد کے اثرات کی تحقیقات کرنا ہےCistanche tubulosa اقتباساسٹریپٹوزوٹوسن – نیکوٹینامائڈ-حوصلہ افزائی ذیابیطس چوہے کی تولیدی خرابی پر ECH پر مشتمل ہے۔

2. مواد اور طریقہ

2.1 مواد

ECH اور CTE کو Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan) سے خریدا گیا تھا۔ ایڈوانسڈ گلائکیشن اینڈ پروڈکٹس (AGEs) بائیو ویژن (سان فرانسسکو، CA، USA) سے خریدے گئے تھے۔ LC-540 اور TM3 سیل لائنیں فوڈ انڈسٹری ریسرچ اینڈ ڈیولپمنٹ انسٹی ٹیوٹ (سنچو، تائیوان) سے خریدی گئیں۔ پانچ ہفتے پرانے Sprague-Dawley (SD) نر چوہوں کو نیشنل لیبارٹری اینیمل سنٹر (تائی پے، تائیوان) سے خریدا گیا تھا۔ Feed Lab Diet® PMI Nutrition International, Inc. (Taipei, Taiwan) سے خریدا گیا تھا۔ 2،2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) سگما (St. Louis, MO, USA) سے حاصل کیا گیا تھا۔ میتھانول اور 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) بھی سگما سے خریدے گئے تھے۔ Dulbecco کے ترمیم شدہ Eagle medium/F12 اور trypsin-EDTA GIBCO (نیویارک، NY، USA) سے حاصل کیے گئے تھے۔ 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA), ڈائمتھائل سلفوکسائڈ (DMSO)، اور nitroblue tetrazolium (NBT) سگما سے خریدے گئے تھے۔ گلوکوز انزیمیٹک کٹس Kyokutoseiyaku، ٹوکیو، جاپان سے حاصل کی گئیں۔ انسولین ELISA کٹس Mercodia AB Inc.، Sylveniusgatan 8A (Uppsala، سویڈن) سے خریدی گئیں۔ T-PER ٹشو پروٹین ایکسٹریکشن ریجنٹ تھرمو سائنٹیفک (شکاگو، IL، USA) سے حاصل کیا گیا تھا۔ اینٹی ہیومن/ماؤس/چوہا نیوکلیئر فیکٹر-کپا B NF-κB پولی کلونل اینٹی باڈیز سانتا کروز بائیو ٹیکنالوجی، سانتا کروز، CA، USA سے خریدی گئیں۔ اینٹی ماؤس/چوہا ریسیپٹر برائے ایڈوانس گلائیکیشن اینڈ پروڈکٹس (RAGE) پولی کلونل اینٹی باڈیز، اینٹی ہیومن/ماؤس/ریٹ اسٹار پولی کلونل اینٹی باڈیز، اور اینٹی ہیومن/ماؤس/چوہا سائٹوکوم پی450 17A1 مونوکلونل اینٹی باڈیز جین سے خریدی گئی تھیں۔ ٹیکس (Irvine, CA, USA)۔ اینٹی ہیومن/ماؤس/چوہا CYP11A1 پولی کلونل اینٹی باڈیز سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی (بیورلی، PA، USA) سے حاصل کی گئیں۔ ایزی بلیو ریجنٹ انویٹروجن، تھرمو فشر سائنٹیفک (کارلسباد، CA، USA) سے خریدا گیا تھا۔ Agarose اور DNA مارکر 100 bp پرومیگا، کارپوریشن (میڈیسن، WI، USA) سے حاصل کیے گئے تھے۔ RNeasy Lipid Tissue Mini Kit QIAGEN، Hilden، جرمنی سے خریدی گئی تھی۔

جنسی فعل کو بہتر بنانے کے لیے نیچرل سیسٹینچ ٹیبلوسا PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.2 طریقے

2.2.1 وٹرو تجزیہ میں

LC{{0}} اور TM3 سیل کلچر: LC-540 سیل لائنوں کو Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) میڈیم میں 37 ◦C پر سوڈیم بائک کاربونیٹ (1.5 g/L) کے ساتھ مکمل کیا گیا، L-glutamine (2 mM)، غیر ضروری امینو ایسڈ (0.1 mM)، سوڈیم پائروویٹ (1.0 mM)، اور فیٹل بووائن سیرم (FBS) (10%) 5% CO2 انکیوبیٹر (CO2 انکیوبیٹر، نیپکو 5410، تائیوان)۔ TM3 سیل لائن کو Dulbecco کے ترمیم شدہ ایگل میڈیم (DMEM) میں گلوکوز (4.5 g/L)، سوڈیم پائروویٹ (0.5 mM)، L-glutamine (2.5 mM)، سوڈیم بائکاربونیٹ (1.2 g/L)، {{ 28}}(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES, 15 mM)، اور fetal calf serum (FCS, 10%) یا ہارس سیرم (5%) 37 ◦C پر 5% CO2 انکیوبیٹر۔

کے سیل کی قابل عملیت کا تعینEchinacoside (ECH): 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) ریجنٹ سیل وائبلٹی پرکھ کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ سیل کی حراستی کو ایک 96-کنویں پلیٹ میں 2 × 105 خلیات / ایم ایل میں ایڈجسٹ کیا گیا تھا۔ پھر، 20 µL ECH (میڈیم کے 2% میں پتلا) شامل کیا گیا اور 5% CO2 انکیوبیٹر میں 37 ◦C پر 24 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ بعد میں، 100 µL MTT ریجنٹ شامل کیا گیا اور تاریک حالات میں 37 ◦C پر 4 گھنٹے کے لیے انکیوبیٹ کیا گیا۔ جاذبیت کی پیمائش 570 nm (ELISA ریڈر، Dynatech MR5000، Kloten، Switzerland) کی گئی۔

متعلقہ خلیے کی قابل عملیت (%)=[(570 nm پر اسامپل − 570 nm پر خالی)]/[(570 پر ایک کنٹرول − خالی پر 570)] × 100۔

Nitroblue Tetrazolium (NBT) کمی پرکھ اور 2،2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) پرکھ: خلیات کی تعداد 1×1{{10}}6 خلیات/ میں ایڈجسٹ کی گئی تھی۔ ایم ایل اس کے بعد، 50 mg/mL ECH، resveratrol (RES)، اور اعلی درجے کی گلائیکیشن اینڈ پروڈکٹس (AGEs) (کنٹرول) کو 37 ◦C پر 18 گھنٹے کے لیے شامل کیا گیا اور ہم آہنگ کیا گیا۔ پھر، 0.3 mL NBT محلول (0.1 mg/mL NBT، 5% FBS، اور 3% dimethyl سلفوکسائیڈ (DMSO) 10 mL DMEM میں تحلیل کیا گیا) شامل کیا گیا اور 1 H ​​کے لیے 5% CO2 میں 37 ◦C پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ سینٹرفیوگریشن کے بعد (3 منٹ کے لیے 800×g پر) سپرنٹنٹ کو ہٹا دیا گیا اور 200 µL DMSO شامل کیا گیا اور الٹراسونک آسکیلیٹر (ڈیلٹا الٹراسونک کلینر D 200، کیلونگ، تائیوان) میں 5 منٹ تک ہلایا گیا۔ جذب 630 nm پر ماپا گیا۔ DPPH ریڈیکل پرکھ کے لیے، Trolox (95% الکحل میں) کو معیار کے طور پر لیا گیا تھا۔ اس کے بعد، 0.5 mM DPPH محلول کے 75 µL کو 25 µL نمونوں کے ساتھ ملایا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ تک تاریک جگہ پر رد عمل ظاہر کرنے کی اجازت دی گئی۔ مرکب کو ہلایا گیا اور جاذبیت کو 517 nm پر ماپا گیا۔

Reactive Oxygen Species (ROS) مواد کا تجزیہ: سیل نمبر کو 2 × 105 سیل/mL میں ایڈجسٹ کیا گیا 12-کنویں پلیٹ میں جس میں 2% FBS ہے۔ پھر، ECH، RES، اور AGEs کے 50 µL/mL کو پلیٹ میں شامل کیا گیا اور 24 گھنٹے کے لیے 37 ◦C پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ 24 گھنٹے کے بعد، 20،70 -ڈائیکلورو فلوروسین ڈائیسیٹیٹ (DCFH-DA) کو شامل کیا گیا اور 37 ◦C پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ سینٹرفیوگریشن (400 × g، 5 منٹ) کے بعد، سپرنٹنٹ کو ہٹا دیا گیا اور خلیوں کو فاسفیٹ بفرڈ نمکین (PBS) سے دو بار دھویا گیا۔ اس کے بعد، PBS کے 1 mL میں خلیوں کو معطل کر دیا گیا تھا اور ROS کی سطح کا تعین فلو سائٹو میٹر (فلو سائٹو میٹر، بیکٹن ڈکنسن، CA، USA) کے ذریعے کیا گیا تھا۔

پروٹین کی شناخت اور مقداری تجزیہ: پروٹین کو ایک پروٹین ایکسٹرکشن ریجنٹ (T-PER) کا استعمال کرتے ہوئے نکالا گیا تھا۔ سیل کی کثافت کو 2 × 105 سیلز/mL میں ایڈجسٹ کیا گیا تھا ایک 12-کنویں پلیٹ میں اور 50 µL/mL ECH، RES، اور ایک ریسیپٹر اعلی درجے کی گلائیکیشن اینڈ پروڈکٹ (RAGE) مخالف کے لیے، اور AGEs کو شامل کیا گیا اور انکیوبیٹ کیا گیا۔ 24 گھنٹے کے لیے 5% CO2 انکیوبیٹر میں 37 ◦C پر۔ اس کے بعد، 400 μL T-PER کو شامل کیا گیا، خلیات کو ختم کیا گیا، اور 20 منٹ (4 ◦C) کے لیے 125،000× g پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ سپرنٹنٹ کو مزید تجزیہ کے لیے −80 ◦C (−80 ◦C فریزر، نوئیر، پلائی ماؤتھ، MN، USA) میں جمع اور ذخیرہ کیا گیا تھا۔ پروٹین کی مقدار معلوم کرنے کے لیے ایک بائیسنکونیک ایسڈ (BCA) کٹ استعمال کی گئی تھی۔ پھر، 10 µL معیاری سیل محلول اور 200 µL BCA ریجنٹ کو کنویں کی پلیٹوں میں شامل کیا گیا اور 30 ​​منٹ کے لیے 5% CO2 انکیوبیٹر میں 37 ◦C پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ جذب 562 nm پر ماپا گیا۔ پروٹین کی شناخت کا تجزیہ سوڈیم ڈوڈیسائل سلفیٹ (SDS) -پولیاکریلامائڈ جیل (SDS-PAGE) الیکٹروفورسس کے ذریعہ کیا گیا تھا۔ پروٹین لوڈنگ بفر میں پروٹین لیسیٹ شامل کرکے نمونے تیار کیے گئے تھے اور مخصوص پروٹین کا پتہ لگانے کے لیے ویسٹرن بلاٹ تجزیہ کیا گیا تھا۔

2.2.2 Vivo تجزیہ میں

اینیمل ماڈل ڈیزائن: ساٹھ {{0}}ہفتہ پرانے نر Sprague–Dawley (SD) چوہے نیشنل لیبارٹری اینیمل سینٹر (تائی پے، تائیوان) سے خریدے گئے۔ ہر چوہے کو انفرادی طور پر جراثیم کش سٹینلیس سٹیل کے پنجروں میں کنٹرول شدہ درجہ حرارت (23 ± 1 ◦C) اور نمی (40–60%) میں 12 گھنٹے روشنی/12 گھنٹے تاریک سائیکل کے ساتھ رکھا گیا تھا۔ خوراک اور پانی کی اشد ضرورت فراہم کی گئی۔ ہر چوہے کو پہلے ہفتے میں پالا گیا تھا اور اسے لیبارٹری میں چوہا کی خوراک 5001 دی گئی تھی۔ تمام طریقہ کار نیشنل تائیوان اوشین یونیورسٹی، تائیوان کی ادارہ جاتی جانوروں کی دیکھ بھال اور استعمال کمیٹی (IACUC منظوری نمبر 101026) کے معیار پر عمل پیرا ہیں۔ پالنے کے بعد، چوہوں کو دو گروپوں میں تقسیم کیا گیا: کنٹرول گروپ (Con) جسے لیب ڈائیٹ 5001 کھلایا گیا تھا، اور ذیابیطس کا گروپ جسے پورے تجربے کے لیے زیادہ چکنائی والی خوراک (HFD، 40%) کھلائی گئی تھی۔ 4 ہفتوں تک HFD کے ساتھ کھانا کھلانے کے بعد، ذیابیطس کے گروپ کے چوہوں کو ذیابیطس mellitus (DM) دلانے کے لیے streptozotocin (65 mg/kg) (STZ) لگایا گیا۔ STZ انجیکشن لگانے کے 15 منٹ کے اندر، نیکوٹینامائڈ (230 ملی گرام/کلوگرام جسمانی وزن) کا انجکشن لگایا گیا۔ انجیکشن کے ایک ہفتہ بعد، ذیابیطس میلیتس (DM) کی کامیاب شمولیت کا تعین کرنے کے لیے زبانی گلوکوز رواداری ٹیسٹ (OGTT) کیا گیا۔ اس کے بعد، جانوروں کو چھ گروپوں میں تقسیم کیا گیا: کنٹرول (لیب ڈائیٹ 5001 کے ساتھ کھلایا گیا)؛ DM گروپ (DM + 45% HFD); DMR گروپ (DM + rosiglitazone: 0.571 mg/kg BW) + 45% HFD; DME1 گروپ (DM + CTE: 80 mg/kg BW) + 45% HFD; DME2 گروپ (DM + CTE: 160 mg/kg BW) + 45% HFD; اور DME4 گروپ (DM + CTE: 320 mg/kg BW) + 45% HFD۔ Rosiglitazone (RSG) کو مثبت کنٹرول کے طور پر لیا گیا تھا۔ CTE کی تین خوراکیں (80، 160، اور 320 mg/kg) تائیوان فوڈ اینڈ ڈرگ ایڈمنسٹریشن (TFDA) ہیلتھ فوڈ فنکشنل ایویلیوایشن گائیڈ لائنز کی سفارش کے مطابق استعمال کی گئیں۔ تجربے کے اختتام تک علاج دیے گئے۔ تمام تجرباتی چوہوں کو 6 ہفتوں کے بعد قربان کیا گیا۔ چوہوں سے جمع کیے گئے خون کو 3000 rpm پر 15 منٹ کے لیے 4 ◦C پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ مندرجہ ذیل تجزیہ کے لیے سپرنٹنٹ کا معائنہ کیا گیا:

کل گلوکوز، ٹرائگلیسرائیڈ، اور کولیسٹرول کا تعین: گلوکوز کا تعین گلوکوز انزیمیٹک کٹس کے ذریعے کیا گیا تھا۔ پھر، 20 µL خون کے پلازما کے نمونے ری ایجنٹس میں شامل کیے گئے اور 5 منٹ کے لیے 37 ◦C پر رکھا گیا۔ کل ٹرائگلیسرائڈز اور کل کولیسٹرول کی حراستی کا تعین ٹرائگلیسرائیڈ اور کولیسٹرول انزیمیٹک کٹس کے ذریعے کیا گیا تھا۔ پھر، 10 µL خون کا پلازما ری ایجنٹس میں شامل کیا گیا اور تجربہ کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق کیا گیا۔ جذب 510 nm پر ماپا گیا۔

پلازما کل گلوکوز/ٹرائگلیسرائڈ/کولیسٹرول (mg/dL)=(Asample − ABlank)/(Astandard − ABlank) × 200۔

نمونہ: خون کے نمونوں کا جذب، خالی: نمونہ کے بغیر کٹس کی جاذبیت کی قدر، معیاری: معیاری ری ایجنٹ کی جاذبیت کی قدر، 200: 200 ملی گرام/ڈی ایل کے ارتکاز پر معیاری ری ایجنٹس۔

انسولین، لیپٹین، اور ہومیوسٹیٹک ماڈل اسسمنٹ – انسولین ریزسٹنس (HOMA-IR) کا تعین:انسولین کی سطح کا تعین انسولین ELISA کٹس کے ذریعے کیا گیا تھا۔ یہاں، 25µخون کے پلازما کا ایل میں شامل کیا گیا۔ری ایجنٹس، اور جاذبیت کو 450 nm پر ماپا گیا۔ لیپٹین کے کل مواد کا تعین a کا استعمال کرکے کیا گیا تھا۔لیپٹین انزائم امیونو میٹرک پرکھ کٹ۔پھر، 100µپلازما کے L کا تجزیہ کیا گیا اور جاذبیتELISA ریڈر کا استعمال کرتے ہوئے 450 nm پر ماپا گیا۔ کے مطابق پورا تجربہ کیا گیا۔کارخانہ دار کی ہدایات. HOMA-IR قدر کا تعین ہومیوسٹاسس ماڈل سے کیا گیا تھا۔تشخیصی مساوات=روزہ پلازما انسولین کا ارتکاز (mg/mL)× روزہ پلازما گلوکوزارتکاز (mmol/L)/22.5۔

پلازما لپڈ پیرو آکسیڈیشن: یہاں، {{0}.5 ملی لیٹر خون کے پلازما کو 1 ملی لیٹر ریجنٹ کے ساتھ ملایا گیا تھا (15%، w/v ٹرائکلورواسیٹک ایسڈ 0 میں۔25 N ہائیڈروکلورک ایسڈ (HCl) ) اور 0.375%، w/v thiobarbituric acid in 0.25 N HCl) اور پانی کے غسل میں (Water Bath, BUCHI 461, Zürich, Switzerland) 100 ◦C پر 15 منٹ کے لیے رکھا جائے۔ ٹھنڈا ہونے کے بعد، 1 ملی لیٹر n-butanol شامل کیا گیا، زور سے ہلایا گیا، اور 10 منٹ کے لیے 1500×g پر سینٹری فیوج کیا گیا۔ سپرنٹنٹ کو جمع کیا گیا تھا اور جاذبیت کو 532 nm [12] پر ماپا گیا تھا۔

Malondialdehyde (MDA) ارتکاز (nM/mL)=[(532 nm پر ایک نمونہ − Ablank at 532 nm)/ (532 nm پر ایک معیاری − 532 nm پر خالی)] × 5۔

معیاری 532 nm − Ablank at 532 nm)] × 5. پلازما ٹیسٹوسٹیرون اور Luteinizing ہارمون (LH) کی سطحوں کا تعین: ٹیسٹوسٹیرون ELISA کٹ خون کے پلازما میں ٹیسٹوسٹیرون کی سطح کی پیمائش کے لیے استعمال کی گئی تھی۔ LH حراستی کا تعین کرنے کے لئے RIA کٹ استعمال کی گئی تھی۔ پھر، 50 µL پلازما شامل کیا گیا اور حسابات ہارمون LH-RP-3 (معیاری) کے ارتکاز پر مبنی تھے۔ مزید اقدامات کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق کیے گئے۔

ٹیومر نیکروسس فیکٹر (TNF) - اور Interleukin-6 (IL-6) کا تعین: پکڑے گئے اینٹی باڈی کو کوٹنگ بفر میں 250 بار پتلا کیا گیا، ایک 96- میں شامل کیا گیا۔ اچھی پلیٹ (100 µL/اچھا)، اور رات بھر کے لیے 4 ◦C پر رکھا۔ سپرنٹنٹ کو خواہش کی گئی تھی اور اسے واشنگ بفر کے ساتھ پانچ بار دھویا گیا تھا (1 بار پی بی ایس، 0.05٪ ٹوین 20)۔ انکیوبیشن (1 h) کے بعد 200 µg asay diluent کے ساتھ، خلیات کو 5 بار واشنگ بفر سے دھویا گیا اور 100 µL TNF- معیاری محلول یا ٹیسٹ کے نمونے ہر ایک کنویں میں شامل کیے گئے اور 2 گھنٹے تک انکیوبیشن کی گئی۔ دھونے کے بعد، 100 µL IL-6- کا پتہ چلنے والے اینٹی باڈیز کو شامل کیا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ سپرنیٹنٹ کو 5 بار دھویا گیا۔ اس کے بعد، 480 µL انزائم ایوڈن ہارسریڈش پیرو آکسیڈیس (HRP) کو شامل کیا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ سپرنٹنٹ کو خواہش کی گئی تھی اور اسے واشنگ بفر سے پانچ بار دھویا گیا تھا۔ اس کے بعد، 100 µL سبسٹریٹ محلول شامل کیا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 15 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ بعد میں، ہر کنویں میں 50 µL اسٹاپ سلوشن (1M فاسفورک ایسڈ) شامل کیا گیا اور جاذبیت کو 450 nm پر ماپا گیا۔

جنسی فعل کی مرمت کے لیے نیچرل سیسٹینچ ٹیبلوسا PHGS75% ECH 30% ایکٹ 12%

سپرم اور ٹیسٹس پیرامیٹرز کا تجزیہ

نطفہ کے نمونے جمع کرنا: نطفہ کے نمونوں کا مجموعہ اس طریقہ کے مطابق انجام دیا گیا تھا جو پہلے [13] میں رپورٹ کیا گیا تھا۔ سپرنیٹنٹ سے سپرم جمع کیے گئے اور مزید تجزیہ کے لیے استعمال کیے گئے۔

سپرم کی تعداد، نطفہ کی حرکت، اور غیر معمولی نطفہ: سپرم کی تعداد کا حساب ہیموسائٹومیٹر اور ٹریپین بلیو محلول کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ اس کے بعد، 100 µL سپرم مائع کو ٹرپین نیلے محلول کے ساتھ ملایا گیا اور سپرم کی تعداد، حرکت پذیری، اور غیر معمولی نطفہ کا حساب ہیمو سائیٹومیٹر اور مائکروسکوپ [14] کے ذریعے کیا گیا۔

نائٹرو بلیو ٹیٹرازولیئم این بی ٹی کی کمی اور سپرم اور ٹیسٹس کی لپڈ پیرو آکسیڈیشن: لیپڈ پیرو آکسیڈیشن اور این بی ٹی میں کمی کا تجزیہ پلازما تجزیہ کے اسی طریقہ کار کے مطابق کیا گیا۔

سپر آکسائیڈ ڈسمیوٹیز (SOD) اور Catalase سرگرمی کا تعین: RANSEL کٹ کا استعمال کرتے ہوئے Superoxide dismutase (SOD) سرگرمی کا تجزیہ کیا گیا۔ یہاں، {{0}}۔{6}} 1.7 ملی لیٹر ری ایکشن سلوشن (0.05 mM xanthine، 0.025 mM 2-({6}} 5 mL testicular homogenates) {9}}iodophenyl)- 3-(4-nitrophenol)-5-phenyltetrazolium chloride (INT))۔ اختلاط کے بعد، 0.25 mL xanthine oxidase (80 U/L) شامل کیا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 30 سیکنڈ تک رد عمل ظاہر کیا۔ جذب 505 nm پر ماپا گیا۔ ورشن ہوموجنیٹ کے پروٹین کی حراستی کا تعین Bio-Rad DC پروٹین پرکھ کٹ کے ذریعہ کیا گیا تھا اور اس کی مخصوص سرگرمی (U/mg پروٹین) کا حساب لگایا گیا تھا۔ Catalase (CAT) کی سرگرمی کا تعین پہلے بتائے گئے طریقہ [15] کے مطابق کیا گیا تھا۔

H&E (Hematoxylin اور Eosin) سٹیننگ

خصیوں کو 24 گھنٹے کے لیے 10% فارملین میں بھگو کر 4◦C پر محفوظ کیا گیا۔ ٹشوز مائیکرو سائز میں تھے اور سلائیڈ سے منسلک تھے۔ درست کرنے کے بعد (95% میتھانول + 5% acetic ایسڈ)، سلائیڈوں کو ہیماتوکسیلین میں 3 منٹ تک ڈبو دیا گیا، بہتے ہوئے پانی سے 5 منٹ تک دھویا گیا، اور پھر انہیں 50%، 70%، اور 90% الکحل کے ساتھ بھگو دیا گیا۔ ایک منٹ. اس کے بعد، سلائیڈوں کو 10 سیکنڈ کے لیے eosin سے داغ دیا گیا اور 100% الکحل میں ایک منٹ تک بھگو دیا گیا جب تک کہ یہ ختم نہ ہو جائے۔ آخر میں، سلائیڈ کو ایک منٹ کے لیے زائلین میں بھگو دیا گیا۔ بعد میں، سلائیڈ کو ہوا سے خشک کر کے سیل کر دیا گیا۔ مورفولوجی کا مشاہدہ کرنے کے لیے داغ والی ٹیوب کو الٹی فیز کنٹراسٹ مائیکروسکوپ (انورٹڈ فیز ڈیفرنس مائکروسکوپ، اولمپس سی کے-2، ٹوکیو، جاپان) میں رکھا گیا تھا۔

ہائپوتھیلمس کا تجزیہ

ماؤس KISS1، G-پروٹین کپلڈ ریسیپٹر (GPR) 54، سائٹوکائن سگنلنگ 3 (SOCS-3) کو دبانے والا، اور sirtuin 1 (SIRT1) جین کے سلسلے کی شناخت NCBI (نیشنل سینٹر فار بائیو ٹیکنالوجی انفارمیشن) جین ڈیٹا بیس سے کی گئی۔ اور ایک مخصوص پرائمر پرائمر 5 کا استعمال کرتے ہوئے ڈیزائن کیا گیا تھا۔{8}} PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA.) تجربے میں استعمال ہونے والے پرائمر ٹیبل 1 میں درج ہیں۔

Hypothalamus سے Ribonucleic acid (RNA) کا اخراج۔ RNeasy Lipid Tissue Mini Kit کا استعمال کرتے ہوئے دماغ کے hypothalamus سے RNA نکالا گیا۔ حاصل کردہ mRNAs کو مقداری طور پر ریورس ٹرانسکرپشن (RT) اور پولیمریز چین ری ایکشن (PCR) سے ماپا گیا۔ RT تجزیہ سے حاصل کردہ تعریفی DNA بعد میں استعمال کے لیے −20 ◦C پر محفوظ کیا گیا تھا۔ نکالے گئے DNA کو Taq پولیمریز کا استعمال کرتے ہوئے پولیمریز چین ری ایکشن (PCR) تجزیہ کیا گیا۔ پھر، پی سی آر پروڈکٹ کا 5 ~ 10 µL لیا گیا اور 1.5٪ ایگر کولائیڈ پر الیکٹروفورسس کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔ یہ تصویر UVP BioDoc-It امیجنگ سسٹم میں لی گئی تھی۔ ریورس ٹرانسکرائب شدہ تکمیلی ڈی آکسیریبونیوکلک ایسڈ (cDNA) لیا گیا اور IQ SYBR گرین سپرمکس کٹ کا استعمال کرتے ہوئے PCR کو انجام دیا گیا۔ بعد میں، iQTM 5 آپٹیکل سسٹم سافٹ ویئر کے ساتھ اس کا تجزیہ کیا گیا۔ پروٹین کو پروٹین نکالنے والے ری ایجنٹ (T-PER) کا استعمال کرکے نکالا گیا تھا۔ پھر، 20 ملی گرام ٹیسکولر ہوموجنیٹ کو 400 μL T-PER میں شامل کیا گیا اور سینٹرفیوجڈ (ہائی سپیڈ سینٹری فیوج، ہیٹیچ سی آر-12، ٹٹلنگن، جرمنی) 4 ◦C (125,000× g) ) 20 منٹ کے لیے۔ مندرجہ ذیل طریقہ وٹرو تجزیہ میں "پروٹین کی شناخت اور مقدار کا تجزیہ" جیسا تھا۔

2.3۔ شماریاتی تجزیہ

تجرباتی نتائج کو اوسط ± معیاری انحراف (میان ± SD) کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا اور اعداد و شمار کا شماریاتی مصنوعات اور خدمات کے حل (SPSS) 11 کا استعمال کرتے ہوئے تجزیہ کیا گیا تھا۔{1}} سافٹ ویئر، IBM, Armonk, New York, NY, USA۔ گروپوں کے درمیان اختلافات کا یک طرفہ تجزیہ (ANOVA) کے ذریعے کیا گیا۔ ڈنکن کے ٹیسٹ کے ذریعے p < 0.05 کی قدر پر اہم سطح کے طور پر مختلف گروپوں کے متعدد موازنہوں کا تجزیہ کیا گیا۔

3. نتائج

3.1 وٹرو تجزیہ میں

3.1.1 ECH، CTE، اور RES کی اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمیوں کا موازنہ

طویل مدتی high آکسیڈیٹیو تناؤ اور دائمی سوزش ذیابیطس کی بنیادی وجوہات ہیں۔پیچیدگیاں16] CTEs مختلف پر مشتمل ہے۔phenylethanoid glycosides جیسے echinacoside(ای سی ایچ) اور ایکٹیوسائیڈاینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی کی صلاحیت کے ساتھ17] ڈی پی پی ایچ ریڈیکل اسکیوینگنگپرکھ ECH کی اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی کا جائزہ لینے کے لیے کی گئی تھی۔ Trolox اور resveratrol(3,5,4'-trihydroxystilbene, RES) کو بالترتیب معیاری اور مثبت کنٹرول کے طور پر لیا گیا تھا۔ جیسے دکھایا گیا ہےتصویر میں1، ECH نے بہتر بنیاد پرست سکیوینگنگ سرگرمی دکھائی اور سرگرمی نمایاں طور پر زیادہ تھی۔مثبت کنٹرول (RES) کے مقابلے میں۔

3.1.2 LC-540 اور TM3 Leydig سیلز پر ECH کی سیل وابستگی

ایم ٹی ٹی پرکھ ECH کے مختلف ارتکاز کے سیل کی قابل عملیت کا اندازہ کرنے کے لئے انجام دیا گیا تھا۔ LC-540 Leydig خلیات اور TM3 Leydig خلیات نے ECH (شکل 2) کے ساتھ علاج کے بعد 80 فیصد سے زیادہ قابل عمل ظاہر کیا۔ دیگر ارتکاز کے مقابلے میں، ECH کی ایک 100-µM ارتکاز (2% FBS میں 100 µM کی گھٹائی) نے TM3 Leydig خلیات میں سیل کی بہتر صلاحیت کو ظاہر کیا۔ نتیجہ نے اشارہ کیا کہ ECH کی بڑھتی ہوئی حراستی خلیوں میں کوئی اہم زہریلا حصہ نہیں ڈالتی ہے۔

3.1.3 LC-540 اور TM3 Leydig سیلز میں NBT Assay کے ذریعے AGE-Induced Superoxide کی پیداوار پر ECH کا اثر

AGEs جسم میں گلوکوز کے آکسیڈیشن اور آزاد ریڈیکلز جیسے O2-، ہائیڈروکسیل ریڈیکلز، اور کاربونیل گروپس کی تشکیل کی وجہ سے آکسیڈیٹیو نقصان کا باعث بنتے ہیں [18]۔ 50 ug/mL AGEs کے ساتھ متحرک ہونے کے بعد، LC-540 (شکل 3a) اور TM3 (شکل 3b) خلیوں کا علاج ECH اور RES (5 μM اور 10 μM ہر ایک) کے ساتھ کیا گیا۔ نتائج سے معلوم ہوا کہ کنٹرول گروپ (حوصلہ افزائی AGEs) میں سپر آکسائیڈ anion کی پیداوار میں اضافہ ہوا تھا، لیکن کنٹرول گروپ (حوصلہ افزائی AGEs) کے بعد سپر آکسائیڈ anion کی پیداوار میں کمی واقع ہوئی تھی، لیکن سوپر آکسائیڈ کی پیداوار میں کمی واقع ہوئی تھی اور ان کی حفاظت کی گئی تھی۔ آکسیڈیٹیو نقصان سے خلیات. LC-540 خلیوں کی صورت میں، 10 µM ECH نے عام گروپ کے ساتھ تقریباً ایک جیسی سرگرمی دکھائی۔ ECH اور RES دونوں کے ارتکاز میں اضافے کے ساتھ دونوں خلیوں میں سپر آکسائیڈ کی پیداوار میں کمی واقع ہوئی۔

جنسی فعل کو بہتر بنانے کے لیے نیچرل سیسٹینچ ٹیبلوسا PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.1.4 AGE-Stimulated LC-540 Leydig Cells میں H2O2 کی پیداوار پر ECH کا اثر

آکسیڈیٹیو پرجاتیوں کی موجودگی کا پتہ لگانے کے لئے DCFH-DA پرکھ کو پھانسی دی گئی تھی۔ خلیات میں داخل ہونے کے بعد، فلوروسینٹ ڈائی DCFH-DA کو انٹرا سیلولر H2O2 کے ذریعے آکسائڈائز کیا جاتا ہے اور ڈائی کلوروفلوورسین (DCF) بناتا ہے۔ جیسا کہ شکل 4 میں دکھایا گیا ہے، AGE محرک گروپ (کنٹرول) میں انٹرا سیلولر H2O2 کی پیداوار میں نمایاں اضافہ ہوا ہے جبکہ 10 µM ECH اور RES کے اضافے نے خلیوں میں H2O2 کی پیداوار کو نمایاں طور پر کم کر دیا ہے۔ 10 µM ECH کے انتظام کے نتیجے میں H2O2 کی پیداوار کا صرف 47.1% ہوا، جو کہ کنٹرول گروپ کے مقابلے میں نمایاں طور پر کم ہے۔

3.1.5 AGE-Stimulated LC-540 Leydig Cells میں RAGE اور NF-κB پروٹین ایکسپریشن لیول پر ECH کا اثر

LC-540 Leydig خلیات میں RAGE کی موجودگی کی تصدیق کے لیے ویسٹرن بلاٹ تجزیہ کیا گیا۔ RAGE (شکل 5a) اور NF-κB (شکل 5b) پر ECH کا اثر AGEs سے محرک Leydig خلیوں میں پروٹین کے اظہار کی سطح پر دکھایا گیا ہے۔ LC-540 Leydig خلیات میں κB اظہار اور ECH اور RES کے 10 µM ارتکاز نے RAGE اور NF-κB کے اظہار کو نمایاں طور پر کم کیا۔ RAGE مخالفوں کے مقابلے RES اور ECH میں NF-κB کا اظہار نمایاں طور پر کم تھا۔ لہذا، نتائج نے تصدیق کی کہ ECH نے RAGE اور NF-κB کی سطح کو کم کرکے سوزش کی سطح کو کم کیا۔

3.1.6 AGE-Stimulated LC-540 Leydig خلیات میں ٹیسٹوسٹیرون کی ترکیب کے راستے پر ECH کا اثر۔

نطفہ اور مردانہ بانجھ پن کا عمل ٹیسٹوسٹیرون کی موجودگی پر منحصر ہے۔ جیسا کہ شکل 6 میں دکھایا گیا ہے، ستارہ (فگر 6a)، CYP11A1 (شکل 6b)، CYP17A1 (شکل 6c)، اور HSD17 3 (شکل 6d) پروٹین کے تاثرات AGE-stimulated LC میں نمایاں طور پر کم ہوئے تھے{11 }} Leydig خلیات (کنٹرول گروپ)۔ جب RAGE مخالف، RES، اور ECH کو شامل کیا گیا تو STAR، CYP11A1، CYP17A1، اور HSD17 3 پروٹین کے اظہار میں نمایاں اضافہ ہوا۔ سٹار اور سی وائی پی 11 اے 1 پروٹین کا بڑھتا ہوا اظہار ECH- اور RES دونوں گروپوں میں دیکھا گیا۔ CYP17A1 کی اظہار کی سطح RES اور ECH گروپوں میں تقریبا ایک جیسی تھی۔ ECH-علاج شدہ Leydig خلیوں میں HSD17 3 پروٹین کے تاثرات RES اور RAGE مخالف-علاج شدہ خلیوں سے بہت زیادہ تھے۔ STAR، CYP11A1، CYP17A1، اور HSD17 3 پروٹین کے بڑھتے ہوئے اظہار نے ٹیسٹوسٹیرون کی عام پیداوار کی نشاندہی کی۔