-Tubulin، Inversin اور اس کا ٹارگٹ منقطع-1 کا اظہار پیٹرن اور عام انسانی گردے کی نشوونما اور بیماریوں میں بنیادی سیلیا کی شکل

edmund.chen@wecistanche.com

خلاصہ:Wnt-signaling پاتھ وے کے ساتھ وابستہ -tubulin، inversion، اور disheveled-1 (DVL-1) پروٹین کے spatiotemporal اظہار کا تجزیہ کیا گیا، اور بنیادی سیلیا مورفولوجیگردے(14ویں تا 38ویں ترقیاتی ہفتے)، صحت مند بعد از پیدائش (15- اور 7-سال کی عمر)، اور پیتھولوجیکل طور پر انسان میں تبدیلیگردے،ملٹی سسٹک ڈیسپلاسٹک سمیتگردے(MCDK)، فوکل سیگمنٹل گلوومیرولوسکلروسیس (FSGS) اور فینیش قسم کا نیفروٹک سنڈروم (CNF)۔ تجزیہ ڈبل امیونو فلوروسینس، الیکٹران مائکروسکوپی، نیم مقداری اور شماریاتی طریقوں سے کیا گیا۔ -ٹوبلین، الٹا، اور DVL-1 کا سائٹوپلاسمک مشترکہ اظہار کا مشاہدہ قربت والے کنولوٹیڈ ٹیوبلز (pct)، ڈسٹل کنولوٹڈ ٹیوبلز (dct)، اور تجزیہ شدہ ٹشوز کے گلومیرولی (g) میں کیا گیا۔ دورانگردہترقی، -ٹبلن، الٹا، اور DVL کا مجموعی اظہار-1کم ہوا، جب کہ پیدائش کے بعد کی مدت میں قدرے اضافہ ہوا۔ -tubulin اور inversion کی خصوصیت والے dct اور g کے سب سے زیادہ اظہار، جبکہ اعلی DVL-1 خصوصیت والے pct۔ - MCDK، FSGS، اور CNF میں ٹیوبلن، الٹا، اور DVL-1 اظہار پیٹرنگردےصحت مند کنٹرول سے نمایاں طور پر مختلف ہے۔ صحت مند کے مقابلے میںگردے، pathologically تبدیلگردےڈیسمورفک پرائمری سیلیا تھا۔ اس دوران -ٹبلن، الٹا، اور DVL-1 کی مختلف اظہار کی حرکیاتگردہترقی اس بات کی نشاندہی کر سکتی ہے کہ کیننیکل اور نان کینونیکل Wnt-signaling کے درمیان سوئچ نارمل کے لیے ضروری ہے۔گردہmorphogenesis. اس کے برعکس، پیتھولوجیکل میں ان کا پریشان اظہارگردےغیر معمولی بنیادی سیلیا کے ساتھ منسلک ہوسکتا ہے، دائمی کی طرف جاتا ہےگردے کی بیماریوں.

مطلوبہ الفاظ:انسانی گردے کی ترقی؛ - tubulin؛ inversin DVL-1; MCDK; FSGS; CNF؛ گردے، گردوں

CISTANCHE گردے/ گردوں کی بیماری کو بہتر کرے گا۔

تعارف 

حتمی یا میٹینیفریک کی ترقیگردےپانچویں حمل کے ہفتے (GW) کے دوران شروع ہوتا ہے، جو پھر مستقل گردے کی تشکیل کے لیے مختلف ہوتا ہے [1,2]۔ metanephric mesenchyme اور ureteric bud کے درمیان سگنلنگ تعاملات کو یقینی بناتا ہےگردہnephrogenesis کے دوران ترقی. مختصراً، ureteric bud mesenchymal-to-epithelial transition (MET) کو metanephric mesenchyme میں اکساتی ہے، جو گاڑھا ہو کر بنتی ہے۔گردوںvesicles، اس کے بعد کوما کی شکل اور S کے سائز کی لاشیں، اور آخر میں glomeruli کی تشکیل کا باعث بنتی ہیں [3]۔ بدلے میں، mesenchyme ureteric بڈ کی مزید شاخوں کو اکساتا ہے۔ انسانی نشوونما کے 11ویں ہفتے میں میٹا نیفرک گردے فعال اخراج کی اکائیاں بن جاتے ہیں۔ تاہم، جنین کی نشوونما کے 34 ویں سے 36 ویں ہفتے کے اندر نیفروجنیسیس مکمل ہو جاتا ہے، جب ایک سے زیادہ شاخوں کے واقعات ختم ہو جاتے ہیں، لیکن گردے کی مزید تفریق کا عمل بعد از پیدائش کے عرصے تک جاری رہتا ہے [4,5]۔ ان پیچیدہ تعاملات کی رکاوٹوں کے نتیجے میں گردے اور پیشاب کی نالی (CAKUT) کی مختلف پیدائشی اسامانیتاوں کی صورت میں نکلتا ہے، بشمول dysplasia، polycystic kidney disease، multicystic dysplasticگردے کی بیماری(MCDK)، نتیجے میں دائمی کی طرف جاتا ہے۔گردے کی بیماری(CKD) [6]۔

اس مطالعے میں، ہم نے بنیادی سیلیا کی ظاہری شکل اور Wnt-signaling پاتھ وے پر توجہ مرکوز کی تھی، جو کہ عام نیفروجنسیس کے دوران ایک اہم کردار ادا کرتا ہے۔گردہمرمت کا عمل، شدید یا دائمی کے بعدگردے کی بیماری[7]۔ nephrogenesis کے دوران بنیادی سیلیا کا وجود اور ترقی کی بڑی تعدادگردہسلیری بیماری کے مریضوں میں پائے جانے والے نقائص اس بات کی نشاندہی کرتے ہیں کہ اصلی پرائمری سیلیا فنکشن معمول کے لیے ضروری ہے۔گردہorganogenesis [8,9]۔ بنیادی سیلیم ایک مائکروٹوبول پر مبنی آرگنیل ہے جو ٹشو ہومیوسٹاسس کے لیے اہم ہے، جہاں -ٹوبولن بنیادی جزو ہے [10]۔ لافانی خلیوں میں -tubulin acetylation کا نقصان اپکلا سے mesenchymal ٹرانزیشن (EMT) کو متحرک کرتا ہے، اس طرح یہ ظاہر ہوتا ہے کہ مائکروٹوبولس [11] کے استحکام میں ایسٹیلیٹیڈ -ٹبلین اہم ہے۔ انسانی نشوونما کے دوران، بنیادی سیلیا ثالثی Wnt پاتھ وے سیل کے پھیلاؤ، تفریق اور ٹشو مورفوجینیسیس [12] کو قابل بناتا ہے۔ پرائمری سیلیا فنکشن اور Wnt-سگنلنگ پاتھ وے میں خلل والے بچوں کی ایک قابل ذکر تعداد CKD تیار کرتی ہے، جہاں پیدائشیگردوںتقریباً نصف معاملات کے لیے عوارض ذمہ دار ہیں [13]۔ بچوں میں سب سے زیادہ عام پیدائشی سسٹک بیماری ملٹی سسٹک ڈسپلاسٹک ہے۔گردے کی بیماری(MCDK) [14]۔ ایک سے زیادہ سسٹ جو بات چیت نہیں کرتے [15] اور نارمل نہیں ہوتےگردوںپیرینچیما MCDK کے لئے خصوصیت خوردبینی نتائج ہیں۔ فوکل سیگمنٹل گلوومیرولوسکلروسیس (FSGS) سب سے زیادہ عام گلوومیرولر بیماریوں میں سے ایک ہے جو اختتامی مرحلے کی طرف جاتا ہے۔گردے کی بیماری[16]۔ شروع میں، FSGS فوکل ہونے کی خصوصیت رکھتا ہے، جس میں گلوومیرولی اور سیگمنٹل کی صرف ایک اقلیت شامل ہوتی ہے، جس میں گلومیرولر دائرے کے صرف ایک حصے میں تبدیلیاں شامل ہوتی ہیں [17]۔ فینیش قسم کا پیدائشی نیفروٹک سنڈروم (CNF) ایک غیر معمولی آٹوسومل ہے جسے وراثت میں ملا ہے۔گردے کی بیماریوسیع پیمانے پر پروٹین کے نقصان [18] کے قبل از پیدائش کے پھیلنے کے ذریعہ نمائندگی کی گئی ہے، جو قربت والے نلیوں کے سیسٹوجنیسیس سے وابستہ ہے [19]۔ پرائمری گلوومیریولر بیماریوں کی بہت سی شکلیں خراب گلوومیرولر فلٹریشن رکاوٹ [20] کے نتیجے میں پروٹینوریا پیدا کرتی ہیں۔ کافی مقدار میں مطالعات سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ پوڈوسائٹس کی چوٹ اور غیر فعال ہونا CKD پروٹینوریا کے روگجنن میں اندرونی کردار رکھتا ہے [21]۔ Vukojevic et al کی طرف سے مطالعہ. CNF [22] میں ciliated اور ناقص تفریق والے پوڈوسیٹس کی بڑھتی ہوئی تعداد کو ظاہر کرتا ہے۔ پچھلے مطالعات نے اشارہ کیا کہ Wnt/ -catenin سگنلنگ پاتھ وے کا پروٹینوریا [23] کے ساتھ پوڈوسیٹ کی خرابی کو اعتدال میں لانے میں بنیادی کردار ہے۔ Wnt-سگنلنگ کے دو اہم راستے ہیں، ایک کو کینونیکل -کیٹنین پر منحصر اور دوسرا نان کینونیکل، -کیٹنین آزاد کے نام سے جانا جاتا ہے۔ ماؤس کے دورانگردہترقی، کیننیکل Wnt-signaling ureteric بڈ ٹپس پر اور S کے سائز والے جسموں میں فعال ہے [24]۔ مزید برآں، کیننیکل سگنلنگ کے ذریعے Wnt کا نیفروجنسیس [25] کے دوران MET کو برقرار رکھنے میں مطابقت ہے۔ یعنی، Wnt پاتھ وے ایکٹیویشن کے لیے ڈی وی ایل پر مشتمل پروٹین کمپلیکس کا پابند ہونا لازمی ہے، جبکہ اس پاتھ وے کے کلیدی اجزا کو غیر فعال کرنے کے نتیجے میں نیفروجینک زون کی عدم موجودگی کی وجہ سے ابتدائی پیدائشی اموات ہوتی ہیں۔گردہ[25]. 

کیننیکل اور نان کینونیکل Wnt سگنلنگ پاتھ ویز کے درمیان مالیکیولر سوئچ کے طور پر اہم ایک پروٹین الٹا پایا گیا [26]۔ اگرچہ الٹا کے ساتھ مختلف پروٹینوں کے تعامل کا پتہ چلا ہے، لیکن اس کا صحیح کام ابھی تک پوری طرح سے واضح نہیں ہوا ہے۔ میںگردوںاپکلا خلیات، الٹا بنیادی سیلیا میں واقع ہے، سلیری پروٹین کے طور پر کام کرتا ہے [27]۔ اس کے علاوہ، الٹا کی ثقافتوں میں tubulin کے ساتھ ایک مستحکم کمپلیکس بناتا ہے۔گردوںخلیات، اور وہ Vivo [27,28] میں جمع ہوتے ہیں۔ ایسا لگتا ہے کہ الٹا ترقی کے دوران پرونفریک سسٹم کی ابتدائی شکل اور بائیں دائیں ہم آہنگی کے تعین میں ایک ضروری کردار ادا کرتا ہے [29,30]۔ سیل کی جھلی میں سائٹوپلاسمک ڈی وی ایل کی بھرتی میں کیننیکل اور نان کینونیکل Wnt سگنلنگ راستوں کے لیے ایک اہم واقعہ۔ چونکہ پچھلی دریافتوں سے پتہ چلتا ہے کہ الٹا اور Dvl گردوں کے اپکلا خلیوں میں جمع ہوتے ہیں، اس لیے یہ قیاس کیا جا سکتا ہے کہ الٹا بھی نان کینونیکل سگنلنگ میں کردار ادا کر سکتا ہے۔ الٹا کے ذریعہ ثالثی Wnt سگنلنگ کی بے ضابطگی نلیوں میں غیر معمولی پھیلاؤ کو متحرک کرتی ہے [31]۔ جینیاتی ٹیسٹوں نے آٹوسومل ڈومیننٹ روبینو سنڈروم کے مریضوں میں DVL-1 تغیر کا انکشاف کیا، جو urogenital سے وابستہ کچھ مریضوں میں متفاوت عوارض پیش کرتا ہے۔گردوںبے ضابطگیوں [32].

CISTANCHE گردے/ رینل ڈائیلاسز کو بہتر کرے گا۔

مختلف جانوروں کے ماڈلز میں -tubulin، inversion اور DVL-1 کے نشوونما کے اظہار کے انداز کی چھان بین کی گئی ہے۔ اس طرح، Xenopus laevis کے pronephros میں ان کے اظہار کی تصدیق intravital microscopy [31] کے ذریعے کی گئی ہے، جبکہ وہ confocal microscopy اور mass spectrometry [33] کا استعمال کرکے murine proximal tubular خلیات سے اخذ کردہ سیل لائنوں میں پائے گئے تھے۔ اس کے علاوہ، ہلکی مائکروسکوپی اور ڈبل امیونو فلوروسینس نے چوہوں کے حصوں میں ان کی موجودگی کا انکشاف کیا۔گردے[34]۔ الٹا ناک آؤٹ چوہوں پر ہونے والے مطالعے میں بتایا گیا ہے کہ میں بڑھے ہوئے، پھیلے ہوئے سسٹگردوںمیڈولا اور پرانتستا سیٹس ویسرل الٹا [35] سے وابستہ ہے۔ انسانوں میں، انفنٹائل نیفرونوفتھیسس کے ساتھ الٹی کی تبدیلی پیش کی گئی تھی جس کی وجہ سے حمل ختم ہو گیا تھا [36]۔ پر متعدد مطالعات کے باوجودگردوں- tubulin، inversion اور DVL-1 اظہار پیٹرن اور فنکشن، ہمارے بہترین علم کے مطابق، انسانی جنین اور بعد از پیدائش انسانی بافتوں میں ان پروٹینوں کے اظہار کے پیٹرن کی ابھی تک تحقیق نہیں کی گئی ہے اور اس کا کوئی تعلق نہیں ہے۔ اس کے علاوہ، ابتدائی انسانی نشوونما میں الٹا اور DVL-1 کے اظہار پر غور کرتے ہوئے کوئی ثبوت نہیں ملا ہے۔ لہذا، اس مطالعہ کا مقصد صحت مند انسان کے جنین اور بعد از پیدائش کے مراحل کے دوران -ٹبلن، الٹا اور DVL-1 کے مقامی اور وقتی اظہار کے پیٹرن کا تجزیہ کرنا ہے۔گردےکے ساتھ ساتھ میںگردہMCDK، FSGS اور CNF کے ٹشوزگردےان اداروں کے درمیان ممکنہ گمشدہ ربط قائم کرنے کے لیے۔ یعنی، ہم تجویز کرتے ہیں کہ -tubulin، inversion اور DVL-1 پروٹین کے ڈسٹربڈ ایکسپریشن پیٹرن بنیادی سیسٹوجنیسیس عمل اور پرائمری سیلیا کا ایک غیر معمولی فعل ہو سکتا ہے جو دائمی بیماری کا باعث بنتا ہے۔گردے کی بیماریوں. 

نتائج

نشوونما اور بعد از پیدائش کا تجزیہگردہٹشوز کو واضح طور پر مختلف ڈھانچے پر انجام دیا گیا تھا۔گردہ:قربت والی کنولیوٹڈ نلیاں (پی سی ٹی)، ڈسٹل کنولیوٹڈ نلیاں (ڈی سی ٹی) اور گلومیرولی (جی)۔ تجزیہ شدہ ترقیاتی مراحل کے دوران اور بعد از پیدائش میںگردہٹشوز، -ٹبلن، الٹا اور DVL-1 نے اظہار کے مثبت نمونے دکھائے لیکن شدت، تقسیم اور مقدار میں فرق کے ساتھ۔ پیتھولوجیکل کا تجزیہگردے کے ٹشوMCDK، FSGS اور CNF کو صحت مند گردے کے ٹشو کنٹرول کے مقابلے میں مثبت خلیوں کی مکمل تصویری گنتی پر انجام دیا گیا۔

2.1 ہلکی مائکروسکوپی، الیکٹران مائیکروسکوپی اور امیونو ہسٹو کیمسٹری (-Tubulin) صحت مند اور پیتھولوجیکل طور پر تبدیل شدہ بعد از پیدائش انسانی گردے کے ٹشو

2.1.1 صحت مند بعد از پیدائش گردے کی روشنی

بعد از پیدائش کی مائکروسکوپیگردہٹشو اچھی طرح سے وضاحت کا مظاہرہ کرتا ہےگردہڈھانچے، میڈولا اور پرانتستا کے درمیان ایک واضح فرق اور کارٹیکل ریجن میں پی سی ٹی، ڈی سی ٹی، اور جی کی تشکیل کے ساتھ۔ -ٹبلن کا امیونو ہسٹو کیمیکل داغ ہر نلی نما خلیے کے apical سیل کی سطح کے بیچ میں اور 0 میں ایک بنیادی سیلیم کی موجودگی کو ظاہر کرتا ہے۔ الیکٹران مائیکروسکوپی صرف ایک بنیادی سیلیم کی موجودگی کو ظاہر کرتی ہے جو نلی کے apical سیل کی سطح پر بیسل جسم سے پیدا ہوتی ہے (شکل 1a)۔

2.1.2 سی این ایف

زیادہ تر تجزیہ شدہ جی چھوٹے اور لوبلیٹڈ (80 فیصد) ہیں، جبکہ اقلیت نارمل سائز یا ہائپر ٹرافک (20 فیصد، n=100) ہیں۔ جی کا سیگمنٹل یا عالمی سکلیروسیس پایا جاتا ہے، جبکہ پی سی ٹی اور ڈی سی ٹی جزوی طور پر پھیلے ہوئے ہیں اور ایٹروفک اپیتھیلیم کے ساتھ لیپت ہیں۔ الٹراسٹرکچرل طور پر، مائیکرویلی کا نقصان اور نیوکلی کے ملٹی فریگمنٹیشن کے ساتھ سیل کی اونچائی میں کمی دیکھی جاتی ہے۔ پوڈوسیٹس میں، پاؤں کے عمل مختلف طریقے سے کھو جاتے ہیں. نلی نما پرائمری سیلیا غیر منظم ہیں، خاص طور پر قریبی نلیوں کے سسٹوں میں، لمبائی اور سائٹوپلاسمک پوزیشن میں تبدیلیاں دکھاتی ہیں (شکل 1b)۔

2.1.3 ایم سی ڈی کے

گردوں کے بافتوں میں، چھٹپٹ ناپختہ اور بالغ جی پایا جا سکتا ہے۔گردہٹشو متعدد بیضوی سسٹوں سے بھرا ہوا ہے۔ کالمی اپکلا خلیات سسٹوں کو ڈھانپتے ہیں اور ڈھیلے کنیکٹیو ٹشو سے گھرے ہوتے ہیں۔ -ٹوبولن پر امیونو ہسٹو کیمیکل داغ لگانا اپکلا خلیوں کی سطح پر متعدد لمبے اور غیر منظم بنیادی سیلیا کو ظاہر کرتا ہے (شکل 1c)۔

2.1.4 ایف ایس جی ایس

90 فیصد جی میں، وسیع سیگمنٹل سکلیروسیس پایا جاتا ہے (n=100)، جو انٹرسٹیشل فائبروسس اور نلی نما نقصان کی علامات سے وابستہ ہے۔ مائکروویلی کے نقصان کے ساتھ اپیٹیلیل خلیوں کی اونچائی میں کمی الیکٹران مائکروسکوپ میں پائی جاتی ہے، جبکہ اینڈوتھیلیل خلیوں اور میسنجیئل علاقوں میں باقاعدہ الٹراسٹرکچر ہوتا ہے۔ الیکٹران خوردبین میں، انتہائی لمبا اور منتشر (وکندریقرت) سیلیم ڈسٹل ٹیوبلر سیل (شکل 1e) کی سطح پر دیکھا جاتا ہے۔ پوڈوکیٹس وسیع پیمانے پر مائکروویلس ٹشو کے ساتھ پاؤں کے عمل کے پھیلنے والے نقصان کو ظاہر کرتے ہیں۔ a-tubulin پر امیونو ہسٹو کیمیکل داغ لگانا اپکلا خلیوں کی سطح پر متعدد لمبے اور غیر منظم بنیادی سیلیا کو ظاہر کرتا ہے (شکل 1c)۔

2.2 心Tubulin، Inversion اور DVL-1- پر امیونو ہسٹو کیمیکل سٹیننگ اور ترقی پذیر اور صحت مند بعد از پیدائش انسانی گردے کا شماریاتی تجزیہ

14ویں، 15ویں اور 16ویں حمل کے ہفتوں میں،گردہٹشو کو نیفران کی تشکیل کے مختلف ترقیاتی مراحل کے ساتھ پیش کیا جاتا ہے: میٹینیفریک کپ سے،گردوںایس کے سائز کے نیفرون کو کمانڈ کرنے کے لیے ویسیکلز مراحل طے کرتے ہیں، اس طرح بیرونی پرانتستا میں نیفروجینک زون بنتا ہے (شکل 2)۔ pct، dct اور g کی تفریق کارٹیکل علاقوں میں قریب دیکھی جا سکتی ہے۔گردہمیڈولا 22ویں GW کے دوران، میڈولا اور پرانتستا کے حصے واضح طور پر مخصوص ہو گئے، جبکہ 38ویں GW میں،گردہڈھانچے انتہائی امتیازی طور پر ظاہر ہوتے ہیں، جس میں pct، dct اور g کی بالغ شکلیں ہوتی ہیں۔

2.2.1 a-Tubulin

ترقی کے دوران، a-tubulin تمام ترقی پذیروں میں مضبوطی سے ظاہر ہوتا ہے۔گردہڈھانچے، بنیادی طور پر بومن کے کیپسول، جی، پی سی ٹی اور ڈی سی ٹی کے parietal اپکلا خلیوں کی سطحوں پر بنیادی سیلیا کی شکل کا تصور کرنا۔ کے اندرگردہٹشو، 82-97 فیصد pct خلیات a-tubulin کا ​​اظہار کرتے ہیں، جبکہ dct میں اظہار 38th GW میں 99 فیصد سے 72 فیصد تک گر جاتا ہے (شکل 3، جدول 1 دیکھیں)۔ ترقی کے مختلف مراحل میں، a-tubulin کا ​​سب سے مضبوط اظہار 16th GW کے g میں پایا جاتا ہے۔گردے93 فیصد مثبت خلیات پر مشتمل ہے۔ lithe 14th, 15th اور 22nd GW (تصویر 3a,b, جدول 1 دیکھیں)، تقریباً 70 فیصد جی سیلز a-tubulin کا ​​اظہار کرتے ہیں، جبکہ سب سے کم اظہار 38th GW میں دیکھا جاتا ہے (p <0.01) 34="" فیصد="" مثبت="" خلیات="" کے="" ساتھ="" (شکل="" 3c)۔="" بعد="" از="" پیدائش="">گردہٹشو (15-سال اور 7-سال پراناگردے)، a-tubulin کے لیے سب سے مضبوط قوت مدافعت pct اور dct (شکل 3d-f) کے apical سیل کی سطح پر دیکھی جاتی ہے۔ a-tubulin اظہار dct کے perinuclear cytoplasm اور Bowman's capsule کے parietal epithelial خلیات میں بھی موجود ہے۔ a-tubulin کے تمام داغگردوںپی سی ٹی میں 50 فیصد مثبت خلیات، ڈی سی ٹی میں 94 فیصد اور جی میں 85 فیصد (شکل 3f) کے ساتھ ڈھانچے۔ ڈی سی ٹی کے داغ pct (p <0.0001) سے="" نمایاں="" طور="" پر="" مختلف="" ہیں۔="" تمام="" تحقیقات="" شدہ="" ڈھانچے="" a-tubulin="" پر="" مثبت="" داغ="" دیتے="" ہیں،="" pct="" میں="" 77="" فیصد="" مثبت="" خلیات،="" 72="" فیصد="" ڈی="" سی="" ٹی="" اور="" 58="" فیصد="" جی="" میں="">

شکل 3. ترقی پذیر اور بعد از پیدائش انسانی گردے کے ٹشوز (a–e) میں -tubulin اور DAPI کا امیونو فلوروسینس سٹیننگ۔ 14th، 15th/16th، 38th GW (a–c) کے گردے؛گردے1۔{1}} اور 7-سال کے بچے (d,e)۔ -ٹوبولن (تیر) کا مثبت داغ پرانتستا کے ہر ڈھانچے میں نشوونما اور بعد از پیدائش کے مراحل (a–e)، قربت والی کنولوٹیڈ نلیاں (pct)، ڈسٹل کنولیوٹڈ نلیاں (dct) اور گلومیرولی (g) کے ذریعے دکھایا گیا ہے۔ pct (d) اور dct (a–c,e) میں پرائمری سیلیا کی تفصیلات کو اعلی میگنیفیکیشن انسیٹس (وائٹ باکس) کے طور پر دکھایا گیا ہے۔ میگنیفیکیشن × 40، اسکیل بار 100 µm۔ ترقی کے مختلف مراحل میں اور بعد از پیدائش کی مدت میں ہر ساخت میں -Tubulin مثبت خلیوں کی تقسیم گراف (f) میں دکھائی گئی ہے۔ گراف (جی) (مشاہدہ ڈھانچے میں پروٹین-مثبت خلیوں کی مجموعی تعداد) نشوونما کے وقت (لکیری ریگریشن) سے متعلق پروٹین کے اظہار کو ظاہر کرتا ہے اور نشوونما اور پختگی (دو طرفہ ANOVA) کے ذریعے -Tubulin سے DVL-1 کے باہمی تعلق کو ظاہر کرتا ہے۔ SIDAK کا پوسٹ ہاک ٹیسٹ)۔ ڈیٹا کو اوسط ± SD کے طور پر دکھایا گیا ہے۔

نشوونما کے مختلف مراحل میں اور بعد از پیدائش کی مدت میں فی ڈھانچے میں -tubulin- مثبت خلیوں کی تقسیم گراف (f) میں دکھائی گئی ہے۔ گراف (جی) (مشاہدہ ڈھانچے میں پروٹین-مثبت خلیوں کی مجموعی تعداد) نشوونما کے وقت (لکیری ریگریشن) سے متعلق پروٹین کے اظہار کو ظاہر کرتا ہے اور نشوونما اور پختگی (دو طرفہ ANOVA) کے ذریعے DVL سے -tubulin کے باہمی تعلق کو ظاہر کرتا ہے۔ سیڈک کا پوسٹ ہاک ٹیسٹ)۔ ڈیٹا کو ± SD کے طور پر دکھایا گیا ہے۔

2.2.2 الٹا اور DVL-1 اور ڈی اے پی آئی نیوکلیئر سٹین پر ڈبل امیونوفل فلوروسینس سٹیننگ ڈیولپنگ اور صحت مند بعد از پیدائش گردے کی ترقی پذیر اور بعد از پیدائش گردے کے ٹشو میں الٹا اظہار

14 ویں، 15 ویں اور 16 ویں GW میں، الٹا g میں مضبوط دانے دار اظہار، اور pct اور dct (شکل 4a، b) کے سائٹوپلازم میں ہلکا دانے دار اظہار ظاہر کرتا ہے، جبکہ 22 ویں اور 38 ویں GW میں (شکل 4c دیکھیں)، مضبوطی سے مثبت اظہار جی (ٹیبل 1) میں دیکھا گیا ہے۔ 14 ویں اور 22 ویں GW کے درمیان، تقریباً 50 فیصد سیل ایکسپریس ورژن ہیں۔ 16 ویں GW میں، pct خلیات 73 فیصد خلیوں میں الٹ کا اظہار کرتے ہیں، جبکہ 38 ویں GW میں 29 فیصد خلیات (p <0.05) تک="" کم="" ہو="" جاتے="" ہیں="" (شکل="" 4f="" دیکھیں)۔="" الٹ="" کا="" مثبت="" اظہار="" جنین="" میں="" تقریباً="" 80-90="" فیصد="" ڈی="" سی="" ٹی="" اور="" جی="" سیلز="" میں="" پایا="" جاتا="">گردہ14th اور 16th GW کے ٹشوز، dct میں 38th GW کے سب سے کم اظہار کے ساتھ (p < 0.05,="" p=""><0.0001، بالترتیب)="" جہاں="" 66="" فیصد="" خلیات="" مثبت="" تھے۔="" بعد="" از="" پیدائش="">گردے، pct apical cell membrane پر مضبوطی سے داغ دیتا ہے، جبکہ dct زیادہ تر بیسل سیل جھلی پر اور perinuclear cytoplasm (شکل 4d,e) میں داغ دیتا ہے۔ اس مرحلے پر، ہم نے تمام تحقیقات میں الٹا اظہار پایاگردوںڈھانچے، بشمول pct، dct اور g، pct کے لیے 92 فیصد، dct کے لیے 88 فیصد اور g کے لیے 90 فیصد کے مثبت خلیات کے اوسط اظہار کے ساتھ (شکل 4f)۔ ہم نے ڈھانچے کے مابین الٹا اظہار کی سگنل کی طاقت میں کوئی خاص فرق نہیں دیکھا۔ الٹ کا سب سے زیادہ اظہار جی میں پایا جاتا ہے، جس کا اوسط 94 فیصد مثبت خلیات ہوتا ہے (شکل 4f)۔ جی (جہاں 94 فیصد خلیات مثبت طور پر داغدار ہوتے ہیں) کا پی سی ٹی سے موازنہ کرتے ہوئے ایک اہم فرق پایا جاتا ہے، جہاں 58 فیصد خلیے مثبت طور پر داغدار ہوتے ہیں (p < 0.01)="" اور="" dct="" سے،="" جہاں="" 49="" فیصد="" خلیات="" ہیں۔="" مثبت="" (p=""><0.0001، شکل="">

DVL-1 ترقی پذیر اور بعد از پیدائش گردے کے ٹشو میں اظہار

DVL{{0}} کا ہلکا سے مضبوط اظہار جنین کی مدت میں pct، dct اور g کے سائٹوپلازم میں دیکھا جاتا ہے (دیکھیں شکل 4a–c، جدول 1)۔ pct میں، 76–86 فیصد خلیے 14ویں سے 22ویں GW میں DVL-1 کا اظہار کرتے ہیں، جبکہ 38ویں GW میں، 57 فیصد مثبت خلیات ہیں (شکل 4g)۔ 14ویں اور 15ویں GW کے dct میں، 68–70 فیصد خلیات DVL کا اظہار کرتے ہیں-1، 16ویں اور 22ویں GW میں، مثبت خلیوں کی تعداد کم ہو کر 42–5{{41} } فیصد، جبکہ 38 ویں GW اظہار (p <0.001) میں،="" 19="" فیصد="" ڈی="" سی="" ٹی="" خلیوں="" میں="" دیکھا="" جاتا="" ہے۔="" جنین="" کے="" تمام="" مراحل="" میں="" جی="" میں="" dvl-1="" کا="" اظہار="" بڑھتا="" ہے:="" 14ویں="" gw="" میں،="" یہ="" 6="" فیصد="" ہے،="" جب="" کہ="" 15ویں،="" 16ویں="" اور="" 22ویں="" gw="" میں،="" یہ="" 10="" فیصد="" تک="" بڑھ="" جاتا="" ہے="" (p=""><0.01)۔ 38="" gw="" میں،="" 14="" فیصد="" جی="" سیلز="" dvl-1="" (شکل="" 4="" جی)="" کا="" اظہار="" کرتے="" ہیں۔="" پیدائش="" کے="" بعد="" کی="" مدت="" میں،="" dvl-1="" مدافعتی="" سرگرمی="" pct="" اور="" dct="" دونوں="" کے="" سائٹوپلازم="" (ٹیبل="" 1)="" میں="" منتشر="" ہوتی="" ہے="" (شکل="" 4d،e)۔="" یہ="" سگنل="" تمام="" تفتیش="" شدہ="" ڈھانچے="" میں="" پایا="" جاتا="" ہے="" لیکن="" زیادہ="" تر="" پیرینوکلیئر="" سائٹوپلازم="" میں۔="" dvl-1="" اظہار="" کی="" شدت="" dct="" اور="" g="" (p=""><0.01) کے="" مقابلے="" pct="" میں="" نمایاں="" طور="" پر="" زیادہ="" ہے۔="" pct="" اور="" dct="" میں="" 39-45="" فیصد="" خلیات="" dvl-1="" کا="" اظہار="" کرتے="" ہیں،="" جبکہ="" g="" میں،="" 21="" فیصد="" خلیے="" مثبت="" ہیں="" (شکل="" 4="" جی)۔="" ہمیں="" مختلف="" میں="" مدافعتی="" خلیوں="" کی="" فیصد="" کے="" درمیان="" کوئی="" خاص="" فرق="" نہیں="">گردوںڈھانچے DVL-1 مدافعتی خلیوں کا فیصد بالترتیب پی سی ٹی میں 34 فیصد، ڈی سی ٹی میں 36 فیصد اور جی میں 27 فیصد ہے (شکل 4 جی)۔

شکل 4. ترقی پذیر اور بعد از پیدائش گردے کے ٹشوز میں الٹا (سبز)، DVL-1 (سرخ) اور DAPI (نیلے) کا دوہرا امیونو فلوروسینس داغ }} سال پرانے گردے کے ٹشوز)۔ مثبت داغ (تیر) ہر ڈھانچے میں ترقی کے تمام مراحل (a–c) اور بعد از پیدائش کی مدت (d,e) میں دکھائے جاتے ہیں۔ پرانتستا میں دلچسپی کے ڈھانچے کے ساتھ ضم شدہ مائیکروفونز: قربت کے کنولوٹیڈ ٹیوبلز (pct)، ڈسٹل کنولیوٹڈ ٹیوبلز (dct) اور گلومیرولی (g)۔ الٹا/DVL-1 (تیر کا نشان) کا مجموعہ ضم شدہ مائکرو فوٹوگراف میں دکھایا گیا ہے۔ منفی کنٹرول کے داغ کو الٹا اور DVL-1 (a) پر انسیٹ کے طور پر دکھایا گیا ہے۔ اریتھروسائٹس کو ڈی سی ٹی کے قریب مضبوط داغ والے خلیوں کے طور پر دیکھا جا سکتا ہے۔ تفصیلات کو اعلی میگنیفیکیشن سیٹس کے طور پر دکھایا گیا ہے۔ میگنیفیکیشن × 40، اسکیل بار 100 µm۔ گردے کے ڈھانچے (pct, dct, g) میں الٹا اور DVL-1 کی متحرک مثبت سیل کی تقسیم ترقی پذیر اور بعد از پیدائش کے مراحل میں گراف (f,g) میں دکھائی گئی ہے۔ گراف (h) نشوونما کے وقت (لکیری ریگریشن) سے متعلق پروٹین ایکسپریشن (ڈھانچے میں مثبت خلیوں کی مجموعی تعداد) کو ظاہر کرتا ہے اور ترقی اور پختگی کے ذریعے DVL-1 کے الٹ کا باہمی تعلق (دو طرفہ ANOVA جس کے بعد Sidak کا پوسٹ ہاک ٹیسٹ ہوتا ہے۔ )۔ ڈیٹا کو ± SD کے طور پر دکھایا گیا ہے۔

الٹ اور DVL-1 کا مشترکہ اظہار ترقی کے دوران گردے کے جی، ڈی سی ٹی اور پی سی ٹی کے سائٹوپلازم میں دیکھا جاتا ہے (شکل 4a–c، انضمام دیکھیں)۔ پیدائش کے بعد کی مدت میں، الٹا اور DVL-1 کا مشترکہ اظہار pct اور dct میں نلی نما خلیوں کے مختلف سیلولر حصوں کی خصوصیت کرتا ہے، جب کہ جی میں شریک اظہار الٹا اظہار کے مضبوط پھیلاؤ کی خصوصیت رکھتا ہے (شکل 4d دیکھیں، انضمام )۔ 7-سال کے بعد پیدائش کے گردے میں، الٹا اور DVL کا مشترکہ اظہار-1 dct اور pct کے نلی نما خلیوں میں دیکھا جاتا ہے، اور g میں جہاں DVL کے مقابلے میں الٹا اظہار قدرے غالب ہوتا ہے-1 (شکل 4e، انضمام)۔

2.2.3 مختلف نشوونما کے گردے کے مراحل اور بعد از پیدائش کے گردے کے درمیان -Tubulin، Inversion اور DVL-1 کے اظہار میں فرق

جنین کے گردے کے بافتوں کے pct میں -ٹیوبلین-مثبت خلیوں کی تعداد اعدادوشمار کے لحاظ سے 7-سال کی عمر کے بچوں کے گردے کے ٹشو (13ویں (p < 0)="" کے="" مقابلے="" میں="" زیادہ="" تھی۔{8}}{="" {11}}1)،="" 15ویں="" (p="">< 0۔{25}}001)="" اور="" 16ویں="" (p="">< 0.00001)="" gw)۔="" جنین="" کے="" ابتدائی="" مراحل="" کے="" dct="" (13ویں،="" 15ویں،="" 16ویں="" اور="" 22ویں="" gw)="" میں="" 38ویں="" gw="" اور="" 1{19}}سال="" کے="" بچوں="" کے="" گردے="" کے="" ٹشو="" (p=""><0.0001، بالترتیب،="" شکل="" 3f)="" کے="" مقابلے="" میں="" زیادہ="" مثبت="" خلیات="" تھے۔="" جب="" مختلف="" ترقیاتی="" مراحل="" کا="" موازنہ="" کیا="" گیا،="" تو="" ہمیں="" 13ویں="" (p=""><0.0001)، 15ویں="" (p=""><0.00001)، 22ویں="" (p=""><0.001) اور="" 38ویں="" (p=""><0.0001) gw="" کے="" pct="" میں="" الٹا="" اظہار="" کی="" نچلی="" سطحیں="" ملیں۔="">گردوں1۔{1}}سال کے بچے سے ٹشو۔ dct میں، 16th GW سے 38th GW گردے کے ٹشو (p < 0۔{11}}001)="" کا="" موازنہ="" کرتے="" ہوئے="" الٹا="" کا="" شماریاتی="" لحاظ="" سے="" اہم="" کم="" اظہار="" پایا="" گیا۔="" مزید="" برآں،="" ڈی="" سی="" ٹی="" میں="" الٹ="" کا="" کم="" اظہار="" 7-="" سالہ="" بچے="" کے="" گردے="" کے="" ٹشو="" میں="" دیکھا="" گیا۔="" 13ویں،="" 15ویں="" (p=""><0.001، دونوں)،="" 16ویں="" اور="" 1="" کا="" موازنہ="" کرنا۔="" مختلف="" مراحل="" سے="" گزرتے="" ہوئے="" dvl="" اظہار="" کے="" مشاہدہ="" کردہ="" سگنل="" سے="" پتہ="" چلا="" کہ="" pct="" of="" 13th="" (p=""><0.01), 15th,="" 16th="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">

2.2.4 ترقی پذیر اور بعد از پیدائش گردے کے ٹشو میں -Tubulin اور DVL-1 کے الٹ جانے کے اظہار کے درمیان تعلق

-Tubulin اور inversion expressions کا موازنہ DVL-1 اظہار سے پورے ترقیاتی مراحل اور بعد از پیدائش گردے کے ٹشو میں کیا گیا۔ DVL-1 (p < 0۔{8}}01،="" شکل="" 3g)="" کے="" اظہار="" کے="" مقابلے،="" تمام="" مشاہدہ="" شدہ="" مراحل="" میں="" ٹیوبلین="" کا="" اعدادوشمار="" کے="" لحاظ="" سے="" زیادہ="" اظہار="" تھا۔="" تمام="" مشاہدہ="" شدہ="" مراحل="" کے="" ذریعے،="" dvl-1="" (p=""><0.0001، شکل="" 4="" h)="" کے="" مقابلے="" میں="" الٹا="" اظہار="" زیادہ="">

2.2.5 -Tubulin، ورژن اور DVL-1- سے امیونو ہسٹو کیمیکل سٹیننگ کا موازنہ اور پیتھولوجیکل طور پر بدلے ہوئے گردے کے ٹشو (MCDK, CNF, FSGS) کا شماریاتی تجزیہ -Tubulin MCDK، FSGS اور CNF میں -tubulin سٹیننگ کا فرق شماریاتی لحاظ سے اہم تھا۔ صحت مند بعد از پیدائش گردے کے ٹشو کو بطور کنٹرول گروپ (p < 0.0001،="" بالترتیب)۔="" dysplastic="" گردے="" کے="" ؤتکوں="" میں="" کنٹرول="" گروپ="" کے="" مقابلے="" میں="" نمایاں="" طور="" پر="" زیادہ="" اظہار="" ہوتا="" ہے،="" جبکہ="" fsgs="" اور="" cnf="" نے="" صحت="" مند="" کنٹرول="" کے="" مقابلے="" میں="" -tubulin="" کا="" ​​نمایاں="" طور="" پر="" کم="" اظہار="" دکھایا="" (شکل="">

الٹا

الٹ کا اظہار ایم سی ڈی کے کے غیر منظم اپکلا خلیوں اور نلیوں کے سائٹوپلازم میں ہوتا ہے (شکل 5a)۔ CNF میں، الٹا اظہار g اور dct کی خصوصیت کرتا ہے، جبکہ یہ pct cysts میں کم شدت سے ظاہر ہوتا ہے (شکل 5b)۔ FSGS میں، الٹنے کا سختی سے g اور dct میں اظہار کیا جاتا ہے لیکن pct cysts میں کم شدت سے (شکل 5c)۔ الٹ کے مقامی اظہار نے MCDK، FSGS اور CNF (p < 0.0001،="" بالترتیب)="" کے="" مقابلے="" میں="" صحت="" مند="" گردے="" کے="" ؤتکوں="" (شکل="" 5g)="" میں="" اعدادوشمار="" کے="" لحاظ="" سے="" اہم="" زیادہ="" داغدار="" ہونے="" کی="" شرح="" ظاہر="">

شکل 5. MCDK (a)، CNF (b) اور FSGS (c) میں پیتھولوجیکل کڈنی ٹشوز میں الٹا (سبز)، DVL-1 (سرخ) اور DAPI (نیلے) کا دوہرا امیونو فلوروسینس سٹیننگ: نلیاں (t) , glomeruli (g), pct cyst (c), pct اپکلا خلیات کی اونچائی (*). الٹا اور DVL-1 (تیر کے نشان) کی ساخت اور سیل کو-لوکلائزیشن کو اعلی میگنیفیکیشن سیٹس میں تفصیلات کے ساتھ ضم شدہ حصوں میں دکھایا گیا ہے۔ منفی کنٹرول کے داغ کو الٹا اور DVL-1 (a) پر انسیٹ کے طور پر دکھایا گیا ہے۔ میگنیفیکیشن ×40، اسکیل بار 10{{20}} µm۔ MCDK، FSGS اور CNF میں DVL-1 اظہار سے -tubulin (d) اور الٹا (e) کا رشتہ (دو طرفہ ANOVA جس کے بعد SIDAK کا پوسٹ ہاک ٹیسٹ ہوتا ہے)۔ صحت مند کنٹرول کے مقابلے FSGS، CNF اور MCDK pct کے اپکلا سیل کی اونچائی (f) میں فرق (ایک طرفہ ANOVA جس کے بعد Tukey کا پوسٹ ہاک ٹیسٹ، n=50)۔ صحت مند کنٹرول (g–i) کے مقابلے میں MCDK، CNF اور FSGS میں -tubulin، inversion اور DVL-1 کے مجموعی مثبت خلیات فیصد میں فرق، ایک طرفہ ANOVA کے بعد Tukey کا پوسٹ ہاک ٹیسٹ)۔ ڈیٹا کو ± SD کے طور پر دکھایا گیا ہے۔ اہم فرق p-value (* p <0.05, **="" p=""><0.01, ****="" p=""><0.0001) سے="" ظاہر="" ہوتے="" ہیں۔="" dvl-1="" dvl-1="" بہت="" ہلکے="" سے="" صرف="" mcdk="" کی="" غیر="" منظم="" نلیاں="" میں="" ظاہر="" ہوتا="" ہے،="" جبکہ="" cnf="" میں،="" اس="" کا="" اظہار="" dct="" اور="" g="" (شکل="" 5a,b)="" کی="" خصوصیت="" رکھتا="" ہے۔="" fsgs="" میں،="" dvl-1="" کو="" g،="" dct="" اور="" pct="" میں="" ہلکے="" رد="" عمل="" کے="" طور="" پر="" دیکھا="" جاتا="" ہے="" (شکل="" 5c)۔="" dvl-1="" پر="" داغ="" دار="" گردے="" کے="" صحت="" مند="" ٹشوز="" نے="" mcdk="" اور="" fsgs="" (p=""><0.0001، دونوں)="" کے="" مقابلے="" میں="" نمایاں="" طور="" پر="" زیادہ="" داغدار="" ہونے="" کی="" شرح="" (شکل="" 5="" h)="" ظاہر="" کی،="" جبکہ="" cnf="" کے="" لیے="" کوئی="" خاص="" فرق="" نہیں="" پایا="">

2.2.6 پیتھولوجیکل طور پر تبدیل شدہ گردے کے ٹشو (MCDK، CNF، FSGS) میں -Tubulin اور DVL کے الٹنے کے اظہار کے درمیان تعلق-1MCDK، FSGS اور CNF میں، -tubulin DVL-1 (p < 0="" 0001،="" بالترتیب،="" شکل="" 5d)="" سے="" نمایاں="" طور="" پر="" زیادہ="" داغدار="" ہے۔="" mdck="" (p=""><0.0001) اور="" fsgs="" (p=""><0.01، شکل="" 5e)="" میں="" dvl-1="" کے="" مقابلے="" میں="" الٹا="" داغ="" نمایاں="" طور="" پر="" زیادہ="">

2.2.7 صحت مند کنٹرول اور پیتھولوجیکل طور پر بدلے ہوئے گردے کے ٹشو (MCDK، CNF، FSGS) کے درمیان قربت والے کنولوٹیڈ نلیوں کی اپیتھیلیل سیل کی اونچائی میں فرقpct اپکلا خلیات کی اونچائی (n {{0}} فی گروپ) کا موازنہ گردے کے صحت مند ٹشوز میں ٹیوبول سیلز اور پیتھولوجیکل طور پر تبدیل شدہ گردے کے ٹشوز (شکل 5b,c,f) کے درمیان کیا گیا۔ HC میں اوسط اپیٹیلیل سیل کی اونچائی 12.91 µm ± 1.847 µm تھی اور CNF اور FSGS (p < 0.0001،="" بالترتیب)="" کے="" مقابلے="" میں="" نمایاں="" طور="" پر="" زیادہ="" تھی۔="" cnf="" pct="" میں="" سیل="" کی="" اوسط="" اونچائی="" 9.011="" µm="" ±="" 1.453="" µm="" تھی،="" جبکہ="" fsgs="" میں="" 8.114="" µm="" ±="" 0.9248="" µm="" تھی۔="" mcdk="" کے="" pct="" اپکلا="" خلیوں="" نے="" hc="" کے="" مقابلے="" میں="" اونچائی="" (12.17="" µm="" ±="" 1.476="" µm)="" میں="" نمایاں="" تبدیلیاں="" نہیں="">

2.2.8 صحت مند کنٹرول اور پیتھولوجیکل طور پر تبدیل شدہ گردے کے ٹشو (MCDK، CNF، FSGS) کے درمیان بنیادی سیلیا کی لمبائی میں فرق

بنیادی سیلیم کی لمبائی (n= 50 فی گروپ) کا موازنہ HC اور پیتھولوجیکل طور پر تبدیل شدہ گردے کے ٹشوز (شکل 6c) کے درمیان کیا گیا۔ صحت مند گردے کے ٹشوز اور MCDK کو -tubulin سے داغ دیا گیا تھا تاکہ -tubulin cilium staining (شکل 6a, b) کی خصوصیت کو یقینی بنایا جا سکے۔ صحت مند گردے کے ؤتکوں میں، بنیادی سیلیم 5.065 µm ± 1.229 µm لمبا تھا، جب کہ MCDK میں، CNF اور FSGS نمایاں طور پر لمبا تھا (p<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>

بحث

ہمارے مطالعے کا مقصد جنین میں a- Tubulin، inversion اور DVL-1 کے امیونو ہسٹو کیمیکل اظہار کی تحقیقات کرنا تھا۔گردوںٹشو اور بعد از پیدائش گردے کے ٹشو۔ مزید برآں، ہم یہ دریافت کرنا چاہتے تھے کہ کیا صحت مند کنٹرول کے مقابلے میں a-tubulin، inversion اور DVL-1 کے اظہار اور داغدار ہونے کا نمونہ گردے کی مختلف بیماریوں میں خراب ہوتا ہے۔ یعنی، گردے کی نشوونما کے دوران a-tubulin، inversion اور DVL-1 کے کردار پر دوسرے محققین کی وسیع دلچسپی کے باوجود، زیادہ تر پچھلے مطالعات میں جانوروں یا وٹرو تجرباتی ماڈلز کا استعمال کیا گیا ہے۔ جہاں تک ہم جانتے ہیں، یہ پہلا مطالعہ ہے جس نے جنین اور بعد از پیدائش انسانی گردوں میں الٹا اور DVL-1 کے ساتھ a-tubulin کے اظہار اور لوکلائزیشن کو دکھایا تھا، اور اس نے گردے میں مذکور پروٹین کے اظہار کو دریافت کیا تھا۔ بیماریاں، جیسے MCDK، FSGS اور CNF۔ ہم نے روشنی اور الیکٹران مائکروسکوپی کے ذریعہ سیلیا کی لمبائی اور ظاہری شکل میں ہونے والی تبدیلیوں کا بھی تجزیہ کیا، جیسا کہ ہمارا پچھلا مطالعہ پہلے ہی اس بات کا اشارہ دے چکا ہے کہ FSGF اور CNF [19] میں سلیری ڈسٹربنس کا تعلق سیسٹوجنیسیس سے ہوسکتا ہے۔

کیننیکل Wnt-signaling پاتھ وے میں، Wnt ligands کا رسیپٹرز کو پابند کرنا Dvl [37] کو بھرتی کرتا ہے۔ گردے کے مورفوجینیسیس کے ابتدائی مراحل کے دوران MET اور پلانر سیل پولرٹی پاتھ وے کے عمل کو Wnt سگنلنگ کے ذریعے کنٹرول کیا جاتا ہے۔ Wnt پاتھ وے میں ثالثی کرتے ہوئے، بنیادی سیلیا کنٹرول سیل کے پھیلاؤ، تفریق اور ٹشو مورفوگنیسیس [12] کو منظم کرنے کے ذریعے سیل cytoskeleton اور سیل کی واقفیت کے ساتھ ساتھ نلی نما ساخت کی لمبائی [2,38]۔ ہمارے مطالعے میں، -ٹبلن، الٹا اور DVL-1 سبھی گردے کے ڈھانچے میں موجود تھے، اور یہ سب نہ صرف جنین کے گردے کی نشوونما کے دوران بلکہ 15- اور {{9 سے گردے کے بافتوں میں بھی موجود تھے۔ }} سالہ بچے۔ یہ نتائج Wnt-signaling پاتھ وے کو چالو کرنے کے ساتھ متفق ہیں جو پہلے ہی tubulogenesis کے دوران ثابت ہوا تھا [39]۔ مزید برآں، ہمارے نتائج نے انکشاف کیا ہے کہ -tubulin اور inversion کا اظہار باہمی طور پر DVL-1 سے متعلق ہے اور یہ کہ وہ اپنے اظہار کے نمونوں کے درمیان شماریاتی لحاظ سے اہم فرق ظاہر کرتے ہیں۔ یہ تجرباتی ماڈلز سے تعلق رکھتا ہے، کیونکہ چوہوں میں مکمل Dvl پروٹین فیملی کی تبدیلی کے نتیجے میں گیسٹرولیشن کے عمل کی کمی ہوتی ہے، جب کہ تغیرات جن میں پروٹین کا پورا خاندان شامل نہیں ہوتا ہے، اعضاء کے نقائص کے ساتھ نوڈل سیلیا پلیسمنٹ میں نقائص ظاہر کرتا ہے [40] . پچھلے نتائج نے تجویز کیا کہ الٹا Xenopus pronephros میں سیل کی منتقلی میں ایک کردار ہے. چونکہ یہ طبقہ ہینلے اور ڈسٹل ٹیوبلز کے ممالیہ لوپ سے تعلق رکھتا ہے، اس لیے یہ انسانوں میں بھی گردے کی نشوونما کے دوران الٹ جانے کی اہمیت کی نشاندہی کر سکتا ہے [41]۔ اس بنیاد کے ساتھ اتفاق کرتے ہوئے، پچھلے مطالعات نے انکشاف کیا کہ الٹا جین کی تبدیلی کے نتیجے میں نیفرونوفتھیسس ٹائپ 2 ہو سکتا ہے، جو کہ غیر معمولی DVL-1 اظہار [42] کے ذریعے ثالثی کی جاتی ہے۔ Wnt-signaling پاتھ وے کے ریگولیشن میں پرائمری سیلیم کے کردار کے متنازعہ ہونے کے باوجود، ہم نے پایا کہ تجزیہ شدہ گردے کے نمونوں میں -tubulin inversion اور DVL-1 کے ساتھ جمع ہے۔ مزید برآں، پچھلے مطالعات نے نشاندہی کی کہ الٹا کے ساتھ بنیادی سیلیم Wnt-signaling پاتھ وے [43] کو متاثر کر کے Dvl کے انحطاط کو کنٹرول کرتا ہے۔ سسٹس کی نشوونما سے وابستہ انسانی گردے کی بیماریوں میں، پرائمری سیلیا کی غیر معمولی لوکلائزیشن اور فنکشن کا مشاہدہ کیا گیا ہے [19]۔ اسی طرح، موجودہ مطالعہ نے پیتھولوجیکل حالات جیسے CNF، FSGS اور MCDK میں بنیادی سیلیا کی تشکیل کی مورفولوجیکل تبدیلیوں کی بھی تصدیق کی ہے۔ پچھلے نتائج نے تسلیم کیا کہ گردے کو پہنچنے والے نقصان کے بعد کیننیکل Wnt راستے کی زیادہ سرگرمی گردے کے ٹشو کی ناقابل واپسی ساختی تبدیلیوں کا باعث بنتی ہے [44]۔ اس کے برعکس، پرائمری سیلیم کو معاونت میں کینونیکل سے نان کینونیکل Wnt پاتھ وے میں تبدیل کرنے کا کردار دیا گیا تھا۔گردوںمرمت مزید برآں، ٹرانسپلانٹڈ کڈنی ٹشوز میں کیننیکل Wnt پاتھ وے کی ضرورت سے زیادہ ایکٹیویشن کو گردے کے فبروسس [45] کی طرف مثبت پیشن گوئی کی قدر ملی۔ اگر کینونیکل Wnt کا راستہ نان کینونیکل کی قیمت پر غالب رہتا ہے، تو یہ گردے کے فبروسس کے نظریہ کو نتیجہ کے طور پر سپورٹ کرتا ہے۔ سی این ایف اور ایف ایس جی ایس میں کم ٹیوبلین اور الٹا اظہار کے بارے میں ہماری دریافتیں نان کینونیکل وینٹ پاتھ وے کی غیرفعالیت کو ظاہر کرتی ہیں، خاص طور پر چونکہ دونوں حالات اختتامی مرحلے کی طرف لے جاتے ہیں۔گردوں کی بیماری.یعنی، یہ خیال کیا جاتا ہے کہ پرائمری سیلیم کا نارمل لوکلائزیشن اور فنکشن باقاعدہ Wnt پاتھ وے کو برقرار رکھنے کا ایک عنصر ہو سکتا ہے اور اس وجہ سے، معمول کی نشوونما کے لیے ایک شرط ہے۔ اس کے برعکس، اگر Wnt پاتھ وے کو بڑھایا جاتا ہے، تو اس کے نتیجے میں خلیے کے غیر منظم پھیلاؤ اور تفریق پیدا ہو سکتی ہے جس کے نتیجے میں سرطان پیدا ہوتا ہے [46]۔ جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے، MET کے آغاز اور نیفران کی تشکیل کے لیے کیننیکل Wnt کا راستہ لازمی ہے، جبکہ اس میں خلل پڑ سکتا ہے۔گردوںhypoplasia [47]. ہمارے نتائج صحت مند کنٹرول کے مقابلے میں MCDK میں -tubulin کے اعلی ترین اظہار کے ساتھ DVL-1 کے سب سے کم اظہار کو ظاہر کر کے اس خیال کی حمایت کرتے ہیں۔ یہ نتائج کیننیکل Wnt پاتھ وے کی سب سے کم ایکٹیویشن کا اشارہ دے سکتے ہیں، جو نیفران کی تشکیل کی عدم موجودگی کی بنیادی وجہ ہو سکتی ہے۔ اس کے برعکس، سب سے کم DVL-1 اظہار کے ساتھ سب سے زیادہ -ٹبلین ایکسپریشن ایک سے زیادہ سسٹوں کے نتائج کی وضاحت کر سکتا ہے کیونکہ نان کینونیکل Wnt پاتھ وے کے ذریعہ کوئی منظم لمبا اور سیل پولرائزیشن نہیں ہے۔ پچھلے مطالعات نے یہ بھی دکھایا تھا کہ الٹا ڈی وی ایل کو انحطاط کے لیے نشانہ بنا کر کیننیکل Wnt سگنلنگ پاتھ وے کو روکتا ہے [26]۔ ان کے تعامل میں یہ قدم عام نلی نما لمبائی اور پوزیشننگ کی دیکھ بھال میں کیننیکل Wnt-signaling کو روکنے کے لئے ضروری پایا گیا تھا۔ الٹا اتپریورتن کے نتیجے میں کیننیکل Wnt سگنلنگ کو بڑھاوا دیا جاتا ہے، جس نے بعد میں نلی نما خلیوں میں غیر معمولی پھیلاؤ کو اکسایا۔ یہ مرحلہ cystogenesis [42] میں انتہائی اہم ثابت ہوا ہے، جبکہ چوہوں میں الٹنے کی ناک آؤٹ پولی سسٹک گردے کی بیماری [48] کا باعث بنتی ہے۔ کے نظریہ کے مطابقگردوںcystogenesis، الٹ کو ایک "مائکوپروٹین" سمجھا جاتا ہے، کیونکہ اس کے بنیادی سیلیا میں مقامی ہونے کی وجہ سےگردوںنلی نما خلیات ہمارے مطالعے میں، تجزیہ کیے گئے تمام مراحل میں پرائمری سیلیا نلی نما خلیات کے apical سیل کی سطح پر موجود تھے، جبکہ جنین کے مراحل کے دوران، -tubulin کا ​​اظہار بعد از پیدائش کی مدت کے مقابلے میں زیادہ مضبوط تھا۔

CISTANCHE گردے/ گردوں کے درد کو بہتر کرے گا۔

پچھلے مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ پرائمری سیلیا کا فنکشن نشوونما کے دوران -ٹبلن کی بے ضابطگی سے متاثر ہوسکتا ہے، جو بچپن میں سیسٹوجنیسیس، گردے کی غیر معمولی نشوونما اور ممکنہ دائمی گردے کی بیماری کا باعث بن سکتا ہے [31,49]۔ یہ MCDK میں مشاہدہ کردہ مختصر اور ڈیسمورفک پرائمری سیلیا کے بارے میں ہمارے نتائج کے مطابق ہے یا صحت مند کنٹرول کے مقابلے میں CNF اور FSGS کے خستہ حال نلیوں میں پائے جانے والے متعدد اور انتہائی لمبا یا منتشر سیلیا کے ساتھ ہے۔ اس حقیقت کی حمایت کرنے کے لیے کہ پرائمری سیلیا کے ذریعے ریگولیٹ کیے جانے والے کینونیکل اور نان کینونیکل Wnt-سگنلنگ پاتھ ویز کو گردے کی عام نشوونما کے لیے لازمی سمجھا جاتا ہے، ہمیں صحت مند کنٹرول کے مقابلے میں MCDK میں الٹا اور DVL-1 کے نمایاں طور پر کم داغ ملے۔ [31,49]۔ گردے کی نشوونما کے مختلف مراحل میں -tubulin، inversion اور DVL-1 کی مختلف ایکسپریشن پیٹرن ڈائنامکس گردے کی عام شکل کے دوران کینونیکل اور نان کینونیکل Wnt-signaling پاتھ وے کے درمیان سوئچنگ کی نشاندہی کر سکتی ہیں۔ ہم تجویز کرتے ہیں کہ ان کا تبادلہ غیر کینونیکل سگنلنگ پاتھ وے میں گردے کی نشوونما کے دوران کیننیکل پاتھ وے یا سیل ہجرت اور پولرائزیشن کے آرڈر میں نقل کا تعین کرتا ہے۔ تمام تحقیقات شدہ گردے کے ڈھانچے میں ان کا توازن اور اظہار گردے کی عام نشوونما میں ان کے اہم کردار کو ظاہر کرتا ہے۔ گردے کی عام نشوونما کے دوران (13th GW سے 38th GW تک)، -tubulin، inversion اور DVL-1 کا مجموعی اظہار کم ہوتا جا رہا ہے کیونکہ گردے کے ٹشو بالغ مورفولوجی حاصل کرتے ہیں۔ 1۔{15}} اور 7-سال پرانے گردے کے ٹشوز، -ٹوبلین اور الٹنے میں اظہار میں معمولی اضافہ ہوا جو اس حقیقت کی تائید کرتا ہے کہ پیدائش کے بعد غیر کینونیکل Wnt راستہ فعال رہتا ہے۔ اس کے برعکس، DVL-1 کم اظہار کے پیٹرن کے ساتھ برقرار رہتا ہے جو اس نتیجے پر پہنچ سکتا ہے کہ صحت مند گردے کے بافتوں میں کینونیکل Wnt راستہ خاموش ہے۔ گردے کے پیتھولوجیکل حالات کے نتیجے میں، گردے کے اپکلا خلیے EMT اور فبروسس [50] کے دوبارہ ظاہر ہونے کے ساتھ رد عمل ظاہر کر سکتے ہیں جو کینونیکل Wnt پاتھ وے [44] کے دوبارہ فعال ہونے سے وابستہ ہیں۔ لہذا، بیمار گردے میں پائے جانے والے -ٹوبولن، الٹا اور DVL-1 کی خرابی بنیادی پیتھولوجیکل میکانزم ہو سکتی ہے اور ترقی پذیر گردے میں غیر کینونیکل سے کینونیکل Wnt راستے میں بدلنے کا نتیجہ ہو سکتا ہے جو کہ ناقابل واپسی سے ناقابل واپسی گردے کے درمیان سوئچ کی طرف اشارہ کرتا ہے۔ نقصان مزید برآں، ان کے قبل از پیدائش اور بعد از پیدائش میں تبدیلیاںگردوںاظہار کا نمونہ جوانی میں گردے کے فعل کی خرابی سے منسلک ہو سکتا ہے، جس سے پیدائشی بیماریاں اور دائمی گردے کی ناکامی ہوتی ہے۔

4. مواد اور طریقے

4.1 انسانی نمونے

جنین کے گردے کے ٹشو کے نمونے 14ویں، 15ویں، 16ویں، 22ویں اور 38ویں GW میں یونیورسٹی ہسپتال سنٹر اسپلٹ کے شعبہ امراض نسواں اور پرسوتی میں حمل ضائع ہونے کے بعد جمع کیے گئے۔ تمام حاصل شدہ جنین کے مواد کی جانچ ایک پیتھالوجسٹ کے ذریعہ کی گئی تھی، اور مطالعہ کے لیے صرف ان ٹشوز کا استعمال کیا گیا تھا جن میں اسامانیتاوں، میکریشنز یا انٹرا یوٹرائن موت کی علامات نہیں تھیں اور عام کیریوگرام کے ساتھ استعمال کیا گیا تھا۔ نمونے جمع کرنے سے پہلے ماؤں کے طبی ریکارڈ کی جانچ کی گئی اور صحت کے مسائل کی صورت میں جو حمل کے نتائج کو متاثر کر سکتے ہیں، گردے کے ٹشوز کو مطالعہ سے خارج کر دیا گیا تھا۔ پختگی کا تعین سر کے طواف، پیٹ کے طواف اور فیمر کی لمبائی [51] سے مریضوں کے ماہواری کیلنڈروں کے ساتھ تعلق میں کیا جاتا تھا۔ حادثاتی موت کے بعد 15- اور 7- سال پرانے گردے کے ٹشو کے نمونے جمع کیے گئے۔ یہ نمونے یونیورسٹی ہسپتال سنٹر سپلٹ کے شعبہ پیتھالوجی سے حاصل کیے گئے۔ ملٹی سسٹک ڈسپلاسٹک کڈنی ٹشوز (MCDK) کے نمونے حمل کے نقصان کے بعد حاصل کیے گئے تھے، فوکل سیگمنٹل گلوومیرولوسکلروسیس (FSGS) اور فینیش قسم کے نیفروٹک سنڈروم (CNF) نیفریکٹومی کی وجہ سے حاصل کیے گئے تھے۔ تمام حاصل شدہ مواد کی جانچ پڑتال اور تشخیص ایک پیتھالوجسٹ کے ذریعہ کی گئی تھی، جس نے تشخیص کی درجہ بندی کی تھی۔ اسٹڈی پروٹوکول کو یونیورسٹی آف اسپلٹ اسکول آف میڈیسن کی اخلاقیات کمیٹی (20 مئی 2016) نے ہیلسنکی اعلامیہ اور اس کے اپ ڈیٹس (درجہ بندی نمبر: 003-08/16-03/0001) کے مطابق منظور کیا تھا۔ رجسٹری نمبر: 2181-198-03-04-16-0024، 20 مئی 2016) [52]۔

4.2 امیونو ہسٹو کیمسٹری

جمع شدہ بافتوں کے نمونے کے تعین پر 22 ◦C پر 24 گھنٹے کے لیے فاسفیٹ بفرڈ نمکین (PBS) میں 4 فیصد پیرافارمیلڈہائیڈ کے ساتھ کارروائی کی گئی۔ 100 فیصد ایتھنول میں پانی کی کمی کے بعد، نمونے پیرافین میں شامل کیے گئے، جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [53]۔ مائکروٹوم کا استعمال کرتے ہوئے نمونوں کو 5 µm موٹی حصوں میں کاٹا گیا اور بعد میں مائکروسکوپ سلائیڈوں پر لگایا گیا۔ بافتوں کے تحفظ کی تصدیق کے لیے، ہر 10ویں حصے پر ہیماتوکسیلین اور eosin [54] سے داغ دیا گیا تھا۔ ڈپارٹمنٹ فیمنائزیشن اور امیونو ہسٹو کیمسٹری انجام دی گئی جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [2,55,56]۔ پی بی ایس میں کلی کرنے کے بعد، مائیکروسکوپ سلائیڈز کو 22 ◦C پر مرطوب چیمبر میں پرائمری اینٹی باڈیز کے ساتھ راتوں رات انکیوبیٹ کیا گیا (StainTray سلائیڈ اسٹیننگ سسٹم؛ سگما-الڈرچ، سینٹ لوئس، MO، USA)۔ استعمال ہونے والی بنیادی اینٹی باڈیز خرگوش مونوکلونل اینٹی الفا ٹیوبلین اینٹی باڈی تھیں (ڈیلیوشن 1:1000؛ ab179484، Abcam، Cambridge, UK)، Rabbit Polyclonal Anti-Inversion antibody (dilution 1:100؛ ab65187، Abcam، Cambridge، UK)، ماؤس monoclonal -1 اینٹی باڈی (1:150 کم کرنا؛ sc-8025، سانتا کروز بائیو ٹیکنالوجی، ڈلاس، TX، USA) اور خرگوش پولی کلونل اینٹی گاما ٹیوبلین اینٹی باڈی (الفا- کے ساتھ بنیادی سیلیا کے مخصوص داغ کی تصدیق کرنے کے لیے۔ tubulin, 1:500 dilution; ab11321, Abcam, Cambridge, UK)۔ پی بی ایس میں کلی کرنے کے بعد، ثانوی اینٹی باڈیز کو ایک گھنٹے کے لیے دیا گیا جیسا کہ درج ہے: گدھا اینٹی خرگوش IgG H&L، Alexa Fluor 488 (dilution 1:400؛ ab150073، Abcam، Cambridge، UK) اور بکری اینٹی ماؤس IgG H&L، TRITC 1:400؛ ab6786, Abcam, Cambridge, UK) 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) نیوکلی کے داغ کے لیے استعمال کیا گیا تھا اور 2- منٹ کے انکیوبیشن کے بعد، سلائیڈز پی بی ایس میں دھوئے گئے اور بڑھتے ہوئے میڈیم اور کور سلپس کے ساتھ اوڑھے گئے۔ بنیادی اینٹی باڈی کی درخواست سے پہلے پروٹین بلاک (ab64226؛ Abcam، کیمبرج، UK) کا استعمال کرکے غیر مخصوص داغ کو روکا گیا تھا۔ منفی کنٹرول کے طور پر، ایک پری جذب ٹیسٹ کیا گیا تھا، جبکہ ثانوی اینٹی باڈیز کی مخصوصیت کو داغ لگانے کے طریقہ کار سے بنیادی اینٹی باڈیز کو چھوڑ کر جانچا گیا تھا۔

4.3 الیکٹران مائکروسکوپی

کا تعینگردہٹشوز کو 24 گھنٹے کے لیے 4 فیصد پیرافارمیلڈہائیڈ میں انجام دیا گیا، اس کے بعد 1 فیصد اوسمیم ٹیٹرو آکسائیڈ میں 1 گھنٹے کے لیے پوسٹ فکسیشن کی گئی۔ پانی کی کمی کا عمل ایتھنول سیریز کے ساتھ انجام دیا گیا تھا اور LX 112 رال [22] میں سرایت کے ساتھ ختم ہوا تھا۔ ایک مائیکرو میٹر پتلے حصوں کو ٹولیوڈین نیلے رنگ کا استعمال کرتے ہوئے داغ دیا گیا تھا اور الٹراتھن حصوں کو منتخب کرنے کے لیے مطالعہ کیا گیا تھا۔ 0.05 مائیکرو میٹر کی موٹائی والے الٹراتھن حصوں کو یورینیل ایسیٹیٹ اور لیڈ سائٹریٹ سے داغ لگانے کے بعد جانچا گیا۔ مائکرو فوٹوگرافس حاصل کرنے کے لیے JEOL 1200 EX مائکروسکوپ کا استعمال کیا گیا۔

4.4 جینیاتی تجزیہ

جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [19]، پردیی خون سے لیوکوائٹس کا استعمال کرتے ہوئے، جینومک ڈی این اے نکالا گیا تھا۔ NPHS1 جین میں ایک ہم جنس غلط فہمی اتپریورتن پایا گیا (c.1096A > C; p.Ser366Arg) جس نے فینیش قسم (CNF) [57] کے پیدائشی نیفروٹک سنڈروم کی تشخیص کی تصدیق کی۔

CISTANCHE گردے/ گردوں کے انفیکشن کو بہتر بنائے گا۔

4.5 ڈیٹا تجزیہ

سیکشن تجزیہ FL فلوروسینس مائکروسکوپ پر 3 FL فلوروسینس چینلز (اولمپس BX51، ٹوکیو، جاپان) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ تصاویر ڈیجیٹل کیمرے DP71 (Olympus, Tokyo, Japan) کے ذریعے ہائی پاور (×40) میگنیفیکیشن پر لی گئیں۔ صرفگردوںپراکسیمل کنولیوٹڈ نلیاں (پی سی ٹی)، ڈسٹل کنولیوٹڈ ٹیوبلز (ڈی سی ٹی) اور گلومیرولی (جی) پر مشتمل پرانتستا دلچسپی کا باعث تھے۔ اس کے بعد امیج جے سافٹ ویئر (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA, https://imagej.nih.gov/ij/ (15 اکتوبر 2018 کو رسائی حاصل کی گئی)، 1997–2021 کے ذریعے تصاویر پر کارروائی کی گئی۔ ) اور Adobe Photoshop (Adobe Inc., San Jose, California, USA) مزید تشخیص کے لیے۔ سیل گنتی سے پہلے، اسپلٹ چینلز امیج جے ٹول استعمال کیا جاتا تھا۔ اس کے بعد، سگنل کے رساو کو روکنے کے لیے امیج کیلکولیٹر امیج جے ٹول کا استعمال کرتے ہوئے سرخ یا سبز چینل (اس پر منحصر ہے کہ اصل چینل کیا تھا) کے ذریعے اصل امیونو فلوروسینس مائکروسکوپک تصویر کو گھٹا دیا گیا۔ حد کی سطح 50 کے نیچے کی قدروں کو منفی سمجھا جاتا تھا۔ ہم نے کم از کم 20 ڈھانچے (pct، dct یا g) فی اسٹیج یا ملٹی سسٹک ڈسپلاسٹک کی مائکرو فوٹو فی سیلز کی مجموعی مثبت تعداد کے خلیوں میں مدافعتی سگنل شمار کیےگردہٹشو، FSGS اور CNF. ہم نے خلیوں کی درجہ بندی مثبت کے طور پر کی ہے اگر امیونو فلوروسینس سگنل جھلی، سائٹوپلازم یا نیوکلئس کی کسی بھی سطح پر جمع ہو جائے جس کی قیمت 50 سے اوپر کی امیج جے سافٹ ویئر پر تھریشولڈ کمانڈ کا استعمال کرتے ہوئے ماپا جاتا ہے۔ منفی خلیوں کو کسی بھی مدافعتی سرگرمی کی عدم موجودگی کے ساتھ خلیوں کے طور پر درجہ بندی کیا گیا تھا۔ دو آزاد تفتیش کاروں نے ڈیٹا کا تجزیہ کیا۔

4.6 نیم مقداری تجزیہ

امیج جے سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے دو آزاد محققین کے ذریعہ -tubulin، inversion اور DVL-1 سٹیننگ سگنل کی شدت کا اندازہ لگایا گیا۔ تصویر کو 8-بٹ قسم میں سیٹ کرنے کے بعد مجموعی طور پر سگنل کی شدت کی پیمائش کی گئی۔ اس کے بعد، ساخت کے خاکہ شدہ علاقے کی پیمائش کرکے مارکر کے داغ کی شدت کا اندازہ 20 pct، dct اور g میں کیا گیا۔ اگر جائزہ لینے والوں کے درمیان نتائج مختلف تھے، تو تیسرے آزاد محقق نے شک کو واضح کیا۔ -tubulin کے لیے سگنل کی زیادہ سے زیادہ شدت 84.125 ± 3.214 SD تھی، الٹنے کے لیے 71.50 ± 2.715 SD تھی اور DVL-1 80.916 ± 1.875 SD کے لیے۔ مائکروسکوپ تصویروں پر سگنل کے رنگ کی سب سے زیادہ سنترپتی کو 3 (مجموعی سگنل امیج کی شدت کا 66.66–99.99 فیصد) کے طور پر نشان زد کیا گیا، اس کے بعد سگنل کی درمیانی شدت کے لیے 2 (33.33–66.66 فیصد) اور 1 (0.33 فیصد –33.33 فیصد) کم سگنل کی شدت کے لیے (ٹیبل 1.)

4.7 شماریاتی تجزیہ

مراحل اور ڈھانچے کے درمیان فرق کے تعین کے لیے، کرسکل-والس ٹیسٹ کیا گیا، اس کے بعد گراف پیڈ پرزم سافٹ ویئر (گراف پیڈ سافٹ ویئر انکارپوریٹڈ، سان ڈیاگو کیلیفورنیا، USA، www.graphpad.com) کا استعمال کرتے ہوئے پوسٹ ہاک کیا گیا (15 اکتوبر کو رسائی ہوئی۔ 2018۔))۔ مثبت خلیوں کی تعداد کو فیصد میں اوسط قدر ± معیاری انحراف (SD) کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا، جبکہ شماریاتی اہمیت کو p <0.05 پر="" تسلیم="" کیا="" گیا="" تھا۔="" تجزیہ="" شدہ="" ڈھانچے="" کی="" تعداد="" 35="" نمونوں="" میں="" 4200="" تھی،="" جن="" کی="" مجموعی="" تعداد="" 135,256="" سیلز="" کی="" گئی="" تھی۔="" ہم="" نے="" 2-طریقہ="" anova="" کو="" sidak="" کے="" پوسٹ="" ہاک="" ٹیسٹ="" کے="" ساتھ="" استعمال="" کیا="" تاکہ="" مختلف="" ترقیاتی="" مراحل="" میں="" -tubulin،="" inversion="" اور="" dvl="" کے="" اظہار="" میں="" فرق="" کو="" جانچیں۔="" ترقیاتی="" وقت="" سے="" متعلق="" پروٹین="" کے="" اظہار="" کا="" مطالعہ="" کرنے="" کے="" لیے،="" ہم="" نے="" لکیری="" رجعت="" کا="" استعمال="" کیا۔="" ٹوکی="" کے="" پوسٹ="" ہاک="" ٹیسٹ="" کے="" بعد="" یک="" طرفہ="" anova="" کو="" صحت="" مند="" میں="" -tubulin،="" inversion="" اور="" dvl-1="" کے="" اظہار="" کے="" فرق="" کو="" تلاش="" کرنے="" کے="" لیے="" استعمال="" کیا="" گیا="">گردہMCDK، FSGS اور CNF کے ٹشوز کے مقابلے ٹشو۔ MCDK، FSGS اور CNF کے درمیان پروٹین کے اظہار میں فرق کی جانچ 2-طریقہ ANOVA سے کی گئی جس کے بعد Sidak کے پوسٹ ہاک ٹیسٹ ہوئے۔ ٹوکی کے پوسٹ ہاک ٹیسٹ کے بعد یک طرفہ انووا کا استعمال صحت مند کنٹرول اور پیتھولوجیکل کے درمیان پی سی ٹی کے سیلیا کی لمبائی اور اپیتھیلیل سیل کی اونچائی میں فرق کو جانچنے کے لیے کیا گیا تھا۔گردہٹشوز اعداد و شمار کو پی < 0.05="" پر="" تسلیم="" شدہ="" شماریاتی="" فرق="" کے="" ساتھ="" اوسط="" قدر="" ±="" معیاری="" انحراف="" (sd)="" کے="" طور="" پر="" دکھایا="" گیا="">