تیز رفتار کاؤنٹر کرنٹ کرومیٹوگرافی کے ذریعے Cistanche Deserticola سے Phenylethanoid Glycosides کی تنہائی اور تطہیر

رابطہ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ای میل:audrey.hu@wecistanche.com

لی اے، بی، رونگ تساؤ بی، *، ریمنڈ یانگ بی، چنمنگ لیو اے، جے کرسٹوفر ینگ بی، ہونگہوئی زو بی

خلاصہ

پانچ phenylethanoid glycosides (PhGs)، echinacoside، cistanoside A، acteoside، isoacteoside اور 20-acetylacteoside، کو الگ تھلگ اور پاک کیا گیا تھا۔Cistanche deserticolaپہلی بار تیز رفتار کاؤنٹر کرنٹ کرومیٹوگرافی (HSCCC) کے ذریعے دو بائفاسک سسٹمز کا استعمال کرتے ہوئے، ایک ethyl acetate-ethanol-water (5:0.5:4.5، v/v/v) پر مشتمل ہے اور دوسرا ethyl acetate–n-butanol–ethanol-water ({{10}}.5:0.5:0.1:1, v/v/v/v)۔ کل 28.5 ملی گرام echinacoside، 18.4 mg cistanoside A، 14.6 mg acteoside، 30.1 mg isoacteoside اور 25.2 mg 20-acetylacteoside کو 1412 mg debolsertic c-n-butol کے ایکسٹریکٹ سے پاک کیا گیا۔ HPLC کی طرف سے مقرر کردہ 92.5 فیصد سے زیادہ پاکیزگی پر۔ ڈھانچے کی شناخت ان کے برقرار رکھنے کے وقت، UV، LC-ESI-MS کے منفی آئن موڈ میں کی گئی تھی، اور NMR تجربات کے ذریعے اس کی تصدیق کی گئی تھی۔ پانچ مرکبات کی خصوصیت LC-ESI-MSn فریگمنٹیشن پیٹرن پر تبادلہ خیال کیا گیا ہے، اور اس اہم دواؤں کے پودے سے PhGs کی ساختی شناخت کے لیے ایک بہت ہی مخصوص اور مفید آلہ پایا جاتا ہے۔

مطلوبہ الفاظ:Cistanche deserticola; Phenylethanoid؛ Echinacoside؛ Cistanoside A؛ ایکٹیوسائیڈ؛ Isoacteoside؛ 20-Acetylacteoside; HSCCC; LC-ESI-MS؛ NMR

1. تعارف

Cistanche deserticola YC Maایک معروف چینی جڑی بوٹیوں کی دوا ہے اور آج کے فنکشنل فوڈ اجزاء یا فوڈ سپلیمنٹس (ونگ، لی، چینگ، اور چن، 2006) کی طرح روایتی تیاریوں میں بڑے پیمانے پر استعمال ہوتی رہی ہے۔ C. deserticola میں اہم حیاتیاتی اجزاء phenylethanoid glycosides (PhGs) ہیں، بشمول echinacoside، acteoside، isoacteoside، 20-acetylacteoside، اور cistanoside A (Kobayashi, Karasawa, & Miyase, 1984; Kobayashi et al. 198)۔ PhGs کو پودوں کی بادشاہی میں وسیع پیمانے پر تقسیم کیا جاتا ہے، اور ان کے مختلف حیاتیاتی افعال جیسے ہیپاٹوپروٹیکٹو (Xiong et al.، 1998)، سوزش مخالف، antinociceptive سرگرمی (Schapoval et al.، 1998)، اور اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمیوں کے لیے وسیع پیمانے پر مطالعہ کیا گیا ہے۔ چینگ، وی، گو، نی، اور لیو، 2005؛ وہ، لاؤ، سو، لی، اور بٹ، 2000؛ لی، وانگ، اور وانگ، 1997؛ لی، وانگ، زینگ، لیو، اور جیا، 1993؛ وانگ، جیانگ، وو، اور وانگ، 2001؛ زیونگ، کڈوٹا، تانی، اور نمبا، 1996)، جنسی فعل کو بہتر بنانا (زی اور وو، 1993؛ زونگ، ہی، وو، اور چن، 1996)، اور سکون آور اثر (لو، 1998) )۔

مندرجہ بالا اہم بایو ایکٹیویٹیز کی وجہ سے، بڑی مقدار میں خالص مرکبات کی فوری طور پر حوالہ معیار کے طور پر اور روایتی چینی ادویات کے استعمال سے متعلق مختلف ان وٹرو اور ان ویوو مطالعات کے لیے ضرورت ہے۔ پی ایچ جی کی تنہائی، تطہیر، اور ساختی خصوصیات کے لیے موثر طریقے، اس لیے ضروری ہو گئے ہیں۔ تاہم، اس طرح کے کام کے لیے عام طور پر نمونے کی صفائی اور تنہائی کے لیے متعدد کرومیٹوگرافک اقدامات کے استعمال کی ضرورت ہوتی ہے (گراس، لاہلوب، اینکلن، شولٹن، اور اسٹیچر، 1988؛ نشیمورا، ساساکی، اناگاکی، چن، اور متسوہاشی، 1991؛ راون، نشیبی , Sasahara, & Li, 1990; Shoyama, Matsumoto, & Nishioka, 1987), جس کے نتیجے میں علیحدگی کے دوران ٹھوس سپورٹ پر PhGs کے ناقابل واپسی جذب کی وجہ سے عام طور پر کم بحالی کی شرح ہوتی ہے (Lei et al., 2001)۔ اس کے برعکس، تیز رفتار کاؤنٹر کرنٹ کرومیٹوگرافی (HSCCC) پودوں کے نچوڑ سے کچھ PhGs کو الگ کرنے کے لیے روایتی کرومیٹوگرافک تکنیک کا ایک مؤثر متبادل بن گیا ہے (Lei et al.، 2001؛ Li et al.، 2005)۔ Lei et al. کامیابی کے ساتھ ایکٹیوسائیڈ اور 20-ایسیٹیلیکٹیو سائیڈ کو الگ کیا۔Cistanches سالسا(CA Mey.) G. Beck HSCCC (Lei et al.، 2001) استعمال کر کے۔ اس مقالے کے مصنفین نے پہلے HSCCC (Li et al. تاہم، HSCCC کا استعمال کرتے ہوئے C. deserticola سے متعدد PhGs کی علیحدگی اور تطہیر کے بارے میں کوئی رپورٹ شائع نہیں کی گئی ہے۔ معیارات کی کمی کی وجہ سے، LC-MS طریقوں کو تیار کیا گیا ہے اور پودوں کے عرق میں کچھ PhGs کی تیز رفتار خصوصیات اور شناخت کے لیے ایک طاقتور تجزیاتی ٹول کے طور پر استعمال کیا گیا ہے (Li et al., 2005; Wang et al., 2000)۔

اس مقالے میں، ہم ایک ایچ ایس سی سی سی طریقہ کی اطلاع دیتے ہیں جو کہ سی ڈیزرٹیکولا سے echinacoside، cistanoside A، acteoside، isoacteoside اور 20-acetylacteoside کی تیاری کے لیے تیار کیا گیا ہے۔ الگ کیے گئے پانچ PhGs کی خصوصیات اور تجزیہ ان لائن ESI ماس اسپیکٹومیٹری اور NMR تجربات کے ساتھ LC کے استعمال سے مکمل کیا گیا۔ برقرار رکھنے کا وقت، سالماتی وزن، اور پانچ پی ایچ جی کے خصوصیت کے ٹکڑے کے آئنوں کو اس مقالے میں پیش کیا گیا ہے اور اس پر تبادلہ خیال کیا گیا ہے۔ اس تحقیقات میں شناخت شدہ پانچ PhGs کے ڈھانچے کو تصویر 1 میں دکھایا گیا ہے۔

Cistanche deserticola کے موثر اجزاء

2. تجرباتی

2.1 کیمیکل اور ری ایجنٹس

ایکٹیوسائڈ سگما – ایلڈرچ (اوک-وِل، آن) سے خریدا گیا تھا، ایچیناکوسائڈ کو کروما ڈیکس (سانتا انا، سی اے) سے خریدا گیا تھا۔ Isoacteoside P. psyllium L. (Li et al.، 2005) سے الگ تھلگ تھا۔ C. deserticola بیجنگ TongRenTang میڈیسنل اسٹور (چین) سے خریدا گیا تھا۔ تمام سالوینٹس HPLC گریڈ کے تھے اور Caledon Laboratories Ltd. (Georgetown, ON) سے خریدے گئے تھے۔

2.2 نمونے کی تیاری

C. deserticola (20 g) کو کمرے کے درجہ حرارت پر پانچ بار 12 گھنٹے کے لیے نکالا گیا جس میں 100 ملی لیٹر 80 فیصد پانی والی ایتھنول شامل تھی۔ ہر بار نکالنے والے مرکب کو واٹ مین نمبر 1 فلٹر پیپر (واٹ مین انٹرنیشنل لمیٹڈ، میڈ اسٹون، انگلینڈ) کے ذریعے فلٹر کیا جاتا تھا۔ مشترکہ فلٹریٹ کو <40 ڈگری="" پر="" خلا="" میں="" 100="" ملی="" لیٹر="" پر="" مرکوز="" کیا="" گیا="" تھا۔="" نتیجے="" میں="" آنے="" والے="" پانی="" کے="" محلول="" کو="" دو="" بار="" ڈیفیٹ="" کیا="" گیا،="" ہر="" ایک="" کو="" 100="" ملی="" لیٹر="" ہیکسین="" کے="" ساتھ،="" اور="" پھر="" یکے="" بعد="" دیگرے="" پانچ="" بار="" نکالا="" گیا،="" ہر="" ایک="" کو="" 100="" ملی="" لیٹر="" این-بوتانول="" کے="" ساتھ۔="" n-butanol="" کی="" تہوں="" کو="" یکجا="" کیا="" گیا="" تھا="" اور="" vacuo="" میں=""><40 ڈگری="" پر="" خشکی="" پر="" مرکوز="" کیا="" گیا="" تھا،="" جس="" سے="" n-butanol="" کے="" نچوڑ="" کا="" 2.2="" جی="" حاصل="" ہوا۔="" ایچ="" ایس="" سی="" سی="" سی="" کی="" علیحدگی="" سے="" پہلے="" ایکسٹریکٹ="" کو="" -20="" ڈگری="" پر="" اسٹور="" کیا="" گیا="">

2.3۔ HSCCC علیحدگی کا طریقہ کار

HSCCC کی تیاری ایک ماڈل CCC{{0}} تیز رفتار کاؤنٹر کرنٹ کرومیٹوگرافی (فارما ٹیک ریسرچ، بالٹی مور، میری لینڈ USA) میں کی گئی تھی۔ اس اپریٹس میں تین تیاری کنڈلی تھیں، جو سلسلہ میں جڑی ہوئی تھیں (کل حجم، 325 ملی لیٹر)۔ اپریٹس کی انقلاب کی رفتار کو 0 اور 2000 rpm کے درمیان ریگولیٹ کیا جا سکتا ہے۔ HSCCC سسٹم ایک HPLC پمپ (فارما ٹیک ریسرچ، بالٹیمور، میری لینڈ، USA)، ایک ماڈل 450 UV ڈیٹیکٹر (Alltech، USA)، ایک ماڈل L 120 E فلیٹ بیڈ ریکارڈر (Linseis Inc., Princeton Jct,) سے لیس تھا۔ USA)، ایک فریکشن کلیکٹر (Advantec MFS Inc., USA) اور ایک نمونہ انجیکشن والو جس میں 10-mL نمونہ لوپ ہے۔

ethyl acetate-ethanol-water (5:0.5:4.5, v/v/v) کا ایک مرکب الگ کرنے والے فنل میں زور سے ہلایا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر کھڑا رہنے دیا گیا۔ دونوں مراحل HSCCC میں توازن تک پہنچنے کے بعد استعمال کیے گئے۔ پورے کوائلڈ کالم کو پہلے اوپری تہہ سے بھرا گیا تھا، جو کہ سٹیشنری فیز کے طور پر کام کرتا ہے۔ نچلی پرت (موبائل فیز) کو پھر 1.5 ملی لیٹر/منٹ کی بہاؤ کی شرح سے کالم کے سر کے آخر میں پمپ کیا گیا۔ گردش کی رفتار 1050 rpm پر سیٹ کی گئی تھی۔ ایک نمونہ (ہر بار تقریباً 230 ملی گرام) ایتھائل ایسیٹیٹ – ایتھنول-واٹر (5:0.5:4.5، v/v/v) کے مرکب کے 8 ملی لیٹر میں حل ہونے کے بعد اسے انجیکشن والو میں لوڈ کیا گیا جب سسٹم ہائیڈرو ڈائنامک تک پہنچ گیا۔ توازن. اس بائفاسک سالوینٹس سسٹم کا انتخاب پارٹیشن کوفائنٹ (K) کی بنیاد پر کیا گیا تھا، جو بالترتیب ایکٹیوسائیڈ، آئسو ایکٹیوسائیڈ، اور 20 ایسٹیلیکٹیوسائیڈ کے لیے 0.87، 1.11، اور 1.32 تھا۔ K قدر اسی کمپاؤنڈ کی اوپری اور نیچے کی تہوں میں ارتکاز کا تناسب تھا جیسا کہ HPLC (تصویر 2) کے ذریعے طے کیا گیا ہے۔ کالم کے آؤٹ لیٹ سے نکلنے والے مواد کو 254 nm پر UV ڈیٹیکٹر کے ذریعے مسلسل مانیٹر کیا گیا اور ہر ٹیوب کے لیے 4 منٹ پر ایک فریکشن کلیکٹر سیٹ کے ساتھ ٹیسٹ ٹیوب میں جمع کیا گیا۔

2.4 ایل سی کے حالات

جامد آٹو سیمپلر اور ایک فوٹوڈیوڈ اری ڈیٹیکٹر (DAD) کو پی ایچ جی کے تجزیہ کے لیے استعمال کیا گیا تھا C. deserticola کے n-butanol اقتباس اور HSCCC علیحدگی سے جمع کردہ حصوں میں۔ علیحدگی Phenomenex ODS-C18 کالم (250 × 4.6 mm, 5 lm) میں C18 گارڈ کالم کے ساتھ کی گئی تھی۔ بائنری موبائل فیز ایسٹونائٹرائل (سالوینٹ اے) اور پانی پر مشتمل ہوتا ہے جس میں 2 فیصد ایسٹک ایسڈ (سالوینٹ بی) ہوتا ہے۔ تمام سالوینٹس کو ایک کے ذریعے فلٹر کیا گیا تھا۔

{{0}} استعمال کرنے سے پہلے 45 lm فلٹر۔ 25 منٹ کے کل رن ٹائم کے لیے بہاؤ کی شرح کو 1۔{6}} mL/min پر مستقل رکھا گیا۔ سسٹم کو گریڈینٹ پروگرام کے ساتھ چلایا گیا تھا: 0–20 منٹ: 90 فیصد B سے 60 فیصد B؛ 20-22 منٹ: 60 فیصد B سے 0 فیصد B؛ اور 22– 25 منٹ، 0 فیصد B سے 90 فیصد B۔ نمونے کے انجیکشن کا حجم 10 lL تھا۔ ڈی اے ڈی ڈیٹیکٹر کے ذریعہ دلچسپی کی چوٹیوں کی 320 این ایم پر نگرانی کی گئی۔

2.5 LC-ESI-MS تجربات

LC-MS تجربات فنیگن LCQ DECA آئن ٹریپ ماس اسپیکٹومیٹر (تھرمو فنیگن، سان جوس، CA، USA) کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے جو الیکٹرو سپرے آئنائزیشن (ESI) ذریعہ سے لیس ہے۔ نمونوں کا تجزیہ اسی کرومیٹوگرافک حالت میں کیا گیا۔ ڈیٹا اکٹھا کرنے کے لیے منفی ماڈل استعمال کیا گیا۔ میان گیس اور معاون بہاؤ کی شرحیں بالترتیب 96 اور 7 (صوابدیدی یونٹ) پر رکھی گئی تھیں۔ کیپلیری وولٹیج 29 V پر سیٹ کیا گیا تھا اور اس کا درجہ حرارت 350 ڈگری پر کنٹرول کیا گیا تھا۔ انٹرنس لینس وولٹیج 40 V پر طے کیا گیا تھا اور ملٹی پول RF طول و عرض 540 V پر سیٹ کیا گیا تھا۔ ESI سوئی وولٹیج کو 4.5 kV پر کنٹرول کیا گیا تھا۔ ٹیوب لینس کا آفسیٹ 16 V تھا، ملٹی پول لینس 1 کا آفسیٹ 8.20 V تھا اور ملٹی پول لینس 2 کا آفسیٹ 10.5 V تھا۔ آئن کا پتہ لگانے کے لیے الیکٹران ملٹی پلیئر وولٹیج 980 V پر سیٹ کیا گیا تھا۔

2.6۔ شناخت کے لیے NMR

NMR سپیکٹرا ایک Bruker Avance-600 سپیکٹرومیٹر (Bruker BioSpin Ltd., Milton, Canada) پر ریکارڈ کیا گیا تھا۔ صرف مرکبات 2 اور 5 (کوئی معیار دستیاب نہیں) کو NMR تجربات کا نشانہ بنایا گیا۔ نمونے CD3OD میں تحلیل کر دیے گئے۔

cistanche کے فعال اجزاء: echinacoside اور acteoside

3. نتائج اور مباحثہ

ایک کامیاب HSCCC علیحدگی کا انحصار زیادہ تر ایک مناسب دو فیز سالوینٹ سسٹم پر ہوتا ہے جو مطلوبہ کمپاؤنڈ کے لیے 1 کے ارد گرد ایک مثالی پارٹیشن گتانک (K) فراہم کرتا ہے۔ اس طرح کے بائفاسک نظام کو مناسب طور پر مختصر طے کرنے کا وقت بھی ملنا چاہیے (چن، گیمز، اور جونز، 2003؛ فوکولٹ اور شیولوٹ، 1998؛ اوکا، اوکا، اور ایتو، 1991)۔ اپنے تجربے میں، ہم نے C. deserticola میں ہدف مرکبات کی حل پذیری کے مطابق سالوینٹ سسٹمز کی چار سیریز کا انتخاب کیا۔ HPLC کا استعمال ہر مرحلے میں ارتکاز کی پیمائش کے لیے کیا گیا تھا، جس سے ہدف مرکبات کی K اقدار کا حساب لگایا گیا تھا۔ دو نظام، ethyl acetate– n-butanol–ethanol-water (4:0.6:0.6:5, v/v/v/v) اور ethyl acetate–water (1:1, v/v)، پہلے استعمال ہو چکے ہیں۔ HSCCC کو ایکٹیوسائیڈ اور 20-ایسٹیلیکٹیو سائیڈ سے الگ کرنا ہے۔

C. سالسا، اور P. Psyllium سے ایکٹیوسائیڈ اور آئسو ایکٹیوسائیڈ،

بالترتیب (Lei et al., 2001; Li et al., 2005)۔ اگرچہ پہلے نظام میں نسبتاً کم وقت طے کیا گیا تھا، لیکن اس کی C. deserticola کے PhGs کو الگ کرنے میں ناقص کارکردگی تھی، جس کی وجہ مرکبات 1 اور 2 کے لیے K قدریں کم تھیں، اور مرکبات 3–5 کے لیے K قدریں زیادہ تھیں۔ دوسرے نظام میں مرکبات 1–4 کے لیے K کی قدریں بہت کم تھیں، لیکن مرکب 5 (ٹیبل 1) کے لیے بہت زیادہ تھیں۔ ایک ترمیم شدہ نظام جس میں ethyl acetate-ethanol-water (5:0.5:4.5, v/v/v) ہے، نے مرکبات 3–5 کے لیے بالترتیب 0.87، 1.11، اور 1.32 پر ایک مثالی K قدر دی، اور اس کے نتیجے میں اچھی علیحدگی ہوئی۔ ان تین مرکبات میں سے (تصویر 3A اور B)۔ تاہم، اس نظام نے پیدا کیا

مرکبات 1 اور 2 کے لیے K قدر بہت چھوٹی ہے، جس کی وجہ سے دو مرکبات سالوینٹ فرنٹ کے قریب ایک دوسرے سے الگ ہوجاتے ہیں (تصویر 3A میں حصہ 1)۔ سسٹم میں مزید تبدیلی v) کمپاؤنڈ 1 اور 2 کے لیے K کی قدروں کو بالترتیب 0.52 اور 0.92 تک بڑھا دیا، اور مکمل علیحدگی (تصویر 3C) کا باعث بنا۔ تصویر 3A ایک کی HSCCC علیحدگی کو ظاہر کرتا ہے۔ نمونہ جس میں C. deserticola کے n-butanol کے نچوڑ کے 230 mg پر مشتمل ہے ethyl acetate–ethanol-water (5:0.5:4.5, v/v/v)۔ ایسے حصے جن کی تصدیق کی گئی تھی۔ HPLC کی طرف سے صرف مرکبات 3، 4، یا 5 کو الگ الگ جوڑ دیا گیا تھا، اور جو مرکبات 3 اور 4 پر مشتمل تھے ان کو جمع کیا گیا تھا، منجمد کر کے خشک کیا گیا تھا، اور مزید علیحدگی کے لیے HSCCC کو دوبارہ تابع کیا گیا تھا (تصویر 3B)۔ دو قدم اوپر بیان کردہ HSCCC علیحدگی سے 1412 mg n-butanol extract سے کل 14.6 mg، 30.1 mg، اور 25.2 mg مرکبات 3–5 حاصل ہوئے۔ تصویر 3C مرکبات 1 پر مشتمل نمونے کی HSCCC علیحدگی کو ظاہر کرتا ہے۔ اور 2 (پہلی علیحدگی میں حصہ 1) ethyl acetate–n-butanol–ethanol-water (0.5:0.5:0.1:1, v/v/ v/v) کا استعمال کرتے ہوئے۔ کل 28.5 اور 1 8.4 ملی گرام مرکبات 1 اور 2 حاصل کیے گئے۔ منجمد خشک مرکبات 1–5 کی کرومیٹوگرافک پیوریٹیز 92.5 فیصد سے زیادہ تھیں، جو براہ راست LC-ESI-MS اور NMR تجزیہ کے لیے استعمال ہوتی تھیں۔

مرکبات 1، 3، اور 4 کی عارضی شناخت مستند echinacoside، acteoside، اور isoacteoside (تصویر 2) کے ساتھ مطابقت پذیر برقرار رکھنے کے اوقات اور UV سپیکٹرل ڈیٹا کے ذریعے حاصل کی گئی تھی۔ مرکبات 2 اور 5 نامعلوم تھے، تاہم، تمام پانچ مرکبات کا UV سپیکٹرا انتہائی مماثل تھا، جو کہ اسی طرح کی ساختی خصوصیات کی نشاندہی کرتا ہے۔

ان پانچ مرکبات کے ڈھانچے کی مزید چھان بین کے لیے، LC-ESI-MSn تجربات کرنے کی کوشش کی گئی اور نتائج تصویر 4 اور جدول 2 میں دکھائے گئے ہیں۔ تصویر 2 میں چوٹیوں (1–5) سے متعلق مرکبات نے شدید deprotonated مالیکیولر آئنوں کی نمائش کی۔ [MH] — بالترتیب m/z 785، 799، 623، 623، اور 665 پر، منفی موڈ میں۔ Dimeric [2M H]— تصویر 2 میں چوٹیوں 1–4 کے لیے بھی آئنوں کا مشاہدہ کیا گیا۔ ان سے چوٹیوں 1–5 کے مالیکیولر وزن بالترتیب 786، 800، 624، 624 اور 666 ہونے کی تصدیق ہوئی۔ LC-MSN ڈیٹا (ٹیبل 2) نے پانچ PhGs کے لیے انتہائی مفید ساختی معلومات فراہم کیں، جیسے کہ تجرباتی طریقہ کار کا غیر جانبدار نقصان: ہر نمونے کے تقریباً 1 ملی گرام کا وزن 10 ملی لیٹر ٹیسٹ ٹیوب میں کیا گیا جس میں ہر مرحلے کا 1 ملی لیٹر پہلے سے متوازن دو فیز سالوینٹ سسٹم کو شامل کیا گیا تھا۔ ٹیسٹ ٹیوب کو بند کیا گیا تھا اور 1 منٹ کے لیے زور سے ہلایا گیا تھا، اور اسے اس وقت تک کھڑا رہنے دیا گیا جب تک کہ یہ مکمل طور پر الگ نہ ہو جائے۔ ہر پرت میں سے 100 lL کا ایک ایلی کوٹ نکالا گیا اور اسے خالی جگہ پر خشک ہونے کے لیے الگ سے بخارات بنا دیا گیا۔<40 °c.="" the="" residue="" was="" dissolved="" in="" 10="" ll="" methanol="" and="" analyzed="" by="" hplc="" for="" determining="" the="" partition="" coefficient="" (k)="" of="" compounds="" 1–5.="" the="" k="" value="" was="" expressed="" as="" the="" peak="" area="" of="" the="" target="" compound="" in="" the="" upper="" phase="" divided="" by="" that="" in="" the="" lower="">

چوٹی 1 کا LC-ESI-MS تصویر 4A میں دکھایا گیا ہے۔ ڈیپروٹونیٹڈ مالیکیولر آئن [MH] — m/z 785 پر ایک اعلی کثرت اور ایک dimeric deprotonated molecular کے ساتھ۔ion [2M H] — m/z 1571 پر منفی موڈ میں دیکھا گیا، جو کہ 786 کے مالیکیولر وزن کی تجویز کرتا ہے، جو کہ echinacoside کے برابر تھا۔ m/z 785 آئنوں کے LC-MS2 تجربے میں مزید تفتیش سے m/z 623 (تصویر 4B) پر ایک اہم بیٹی آئن حاصل ہوا جو براہ راست m/z 785 سے کیفیوئل موئیٹی یا ہیکسوز موئیٹی کے نقصان سے پیدا ہوا 162 H] —۔ m/z 623 کے LC–MS3 سپیکٹرم نے m/z 477 اور 461 پر دو بڑے آئنوں کی نمائش کی اور m/z 315 اور 179 پر دو چھوٹے آئنوں کی نمائش کی (تصویر 3C، جدول 2)۔ m/z 623 اور fragment ions m/z 477 اور 461 کے درمیان بڑے پیمانے پر فرق بالترتیب 146 اور 162 تھا، جو کہ ایک rhamnose یونٹ اور گلوکوز moiety یا caffeoyl moiety [M 162 H] — کے نقصان کے مطابق تھا۔ m/z 623 آئنوں نے بھی m/z 315 آئن پیدا کرنے کے لیے ایک کیفیوئل موئیٹی اور ایک rhamnose moiety کھو دیا۔ m/z 179 پر آئن cafeoyl moiety کے کلیویج سے تیار کیا گیا تھا، جس میں cafeoyl moiety کے حصے پر منفی چارج باقی تھا۔ LC-ESI-MSN مستند echinacoside پر تجربے نے اسی ٹکڑے کرنے کا نمونہ دکھایا۔ لہذا چوٹی 1 کے ایچیناکوسائڈ ہونے کی تصدیق کی گئی۔

چوٹی 2 کے لیے، LC–ESI-MS نے m/z 799 کو deprotonated molecular ion [MH] — اور m/z 1599 کو اس کے dimeric ion کے طور پر دکھایا، جو کہ 800 کے مالیکیولر ماس کی تجویز کرتا ہے۔ MS2 تجربات کے دوران، m/z 799 آئنوں نے m/z 637، 623، اور 475 (ٹیبل 1) میں تین بیٹیاں بنائیں۔ m/z 637 پر آئن براہ راست m/z 799 کے پیرنٹ آئن سے دوبارہ کیفیوئل [M—162—H] — یا گلوکوز کی موئٹی [M—162—H] — کے غیر جانبدار نقصان کی وجہ سے پیدا ہوا تھا۔ m/z 623 پر آئن کا نتیجہ CH2 ریڈیکل کے نقصان سے ہوا۔ m/z 475 پر آئن کیفیوئل موئیٹی [M 162 H] — اور پیرنٹ آئن سے گلوکوز موئیٹی دونوں کے غیر جانبدار نقصان سے تشکیل پایا تھا۔ m/z 637 پر MS3 کے تجربے نے m/z 619, 491, اور 475 پر تین آئن تیار کیے، جو بالترتیب ایک پانی، ایک rhamnose یونٹ، اور ایک گلوکوز موئیٹی کے نقصانات کے مطابق ہیں۔ m/z 623 بیٹی آئن نے MS3 کے مطالعہ میں m/z 461 اور 315 پیدا کیے، جس نے اسی طرح کے ٹکڑے کرنے والے راستے کی پیروی کی جیسا کہ اوپر زیر بحث آیا۔ LC- ESI-MSN ڈیٹا نے چوٹی 2 کے لیے cistanoside A کے طور پر ایک عارضی شناخت کی حمایت کی۔ دونوں چوٹیوں نے ایک ہی [MH] — آئن m/z 623 پر اور dimer m/z 1247 پر منفی موڈ (ٹیبل 1) کو ظاہر کیا۔ وہ ممکنہ طور پر ایک ہی سالماتی وزن کے ساتھ isomers ہیں۔

624، ایکٹیوسائیڈ اور آئسو ایکٹیوسائیڈ کی طرح۔ [MH]— آئنوں کے MS2 سپیکٹرا نے m/z 461 کا ایک ہی بیٹی آئن بھی دکھایا، جس نے پیرنٹ آئن m/z 623 (ٹیبل 1) سے کیفیوئل موئیٹی کے نقصان کی نشاندہی کی۔ اسی طرح کے MS3 سپیکٹرا دونوں مرکبات کے لیے حاصل کیے گئے تھے۔ چوٹی 3 کے لیے، m/z 461 پر آئن کے MS3 سپیکٹرم نے m/z 315، 161، اور 135 پر تین آئن بنائے۔ m/z 315 rhamnose کھونے کے بعد بنتا ہے جیسا کہ پہلے بتایا گیا ہے۔ آئن m/z 161 cafeoyl moiety کے درار سے پیدا ہوا، جس کے بعد ایک پانی کا مزید نقصان ہوا۔ چارج cafeoyl moiety کے حصے پر رہا. m/z 135 [aglycone 18 H] پر آئن C1 پوزیشن پر گلائکوسیڈک بانڈ کے کلیویج سے ایک پانی کے اضافی نقصان کے ساتھ پیدا ہوا، چارج کو ایگلی کون موئیٹی کے حصے پر چھوڑ دیا۔ چوٹی 4 کے MS3 سپیکٹرم نے چوٹی 3 کے طور پر اسی فریگمینٹیشن پاتھ وے کی پیروی کی سوائے m/z 135 پر غائب آئن کے۔ ان دو مرکبات کے مالیکیولر آئن اور فریگمینٹیشن پیٹرن ایکٹیوسائیڈ اور آئسو ایکٹیوسائیڈ پر لٹریچر ڈیٹا کے ساتھ مطابقت رکھتے ہیں (وانگ ایٹ ال۔ ., 2000)، اگرچہ ایک اضافی آئن m/z 153 پایا گیا تھا اور cistanoside A اور 20-acetylacteoside کے Proton NMR ڈیٹا کو [aglycone H] کے طور پر تفویض کیا گیا تھا — Wang et al. (Wang et al.، 2000)۔ یہ آئن ہمارے تجربے میں m/z 135 دینے کے لیے غیر مستحکم اور پانی کھو سکتا ہے۔ MS ڈیٹا اور معیارات کے ساتھ چوٹیوں 3 اور 4 کے ہم آہنگ برقرار رکھنے کے اوقات کی بنیاد پر، اس لیے ان کی شناخت بالترتیب ایکٹیوسائیڈ اور آئسو ایکٹیوسائیڈ کے طور پر کی جاتی ہے۔

چوٹی 5 کا LC-ESI-MS ڈیٹا ٹیبل 2 میں دکھایا گیا ہے۔ ایک ڈیپروٹونیٹڈ مالیکیولر آئن [MH] — (m/z 665) واحد آئن تھا جو منفی موڈ میں پایا گیا، جس کا ایک سالماتی ماس 666 ہے۔ تین بیٹی آئن MS2 تجربہ (ٹیبل 2) میں m/z 623، 503، اور 461 پر مشاہدہ کیا گیا۔ m/z 623 اور 503 پر بیٹی آئن بالترتیب COCH2 گروپ اور ایک cafeoyl moiety کے نقصان سے براہ راست پیرنٹ آئن سے تشکیل پائے تھے۔ m/z 461 پر آئن کیفیوئل اور COCH2 moiety [M 162 42 H]— دونوں کے نقصان سے آیا ہے۔ MS تجربے میں، m/z 623 نے m/z 461 پیدا کیا، اور m/z 503 نے m/z 485، 461، اور 315 پر تین آئن پیدا کیے۔ بیٹی آئن m/z 461 کے MS3 سپیکٹرم نے 443 پر دو آئن دیے۔ اور 315۔ چوٹی 5 کے LC– MSN فریگمینٹیشن پیٹرن کا اس مطالعے میں رپورٹ کردہ دیگر مرکبات کے ساتھ اور دیگر رپورٹ کردہ (Li et al. R3 پوزیشن پر COCH3 یونٹ ہونے کے واحد فرق کے ساتھ ایکٹیوسائیڈ کے لیے۔ اس لیے چوٹی 5 کو ایک عارضی شناخت 20-ایسٹیلیکٹیو سائیڈ (تصویر 1) کے طور پر دی گئی تھی۔

دو عارضی طور پر شناخت شدہ مرکبات، چوٹی 2 (بطور cistanoside A) اور چوٹی 5 (بطور 20-acetyl-acteoside) کے ڈھانچے کو 1H NMR کے ذریعے ان کے ڈھانچے کی تصدیق کی گئی تھی۔ مرکبات 2 اور 5 میں تمام پروٹونوں کی کیمیائی تبدیلیاں اور جوڑنے والے مستقل، جیسا کہ جدول 3 میں دکھایا گیا ہے۔، بالترتیب cistanoside A اور 20-acetylacteoside کے لیے اطلاع کردہ NMR ڈیٹا سے مماثل ہے (Kobayashi et al., 1984, 1987) . موجودہ مطالعہ میں 2D NMR تجربات (لمبی رینج COSY، ROESY، اور CH ارتباط) بھی کیے گئے اور انہوں نے مزید شناخت کی تصدیق کی (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا)۔

Cistanche deserticola سے ایکٹیوسائیڈ

4. نتائج

موجودہ مقالے میں، ایچ ایس سی سی سی کو کامیابی کے ساتھ سی ڈیزرٹیکولا کے n-butanol ایکسٹریکٹ سے echinacoside، cistanoside A، acteoside، isoacteoside، اور 20-acetylacteoside کی تنہائی اور تطہیر کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ لہٰذا یہ بائیو ایکٹیو کی نیم تیاری سے علیحدگی کا ثابت شدہ ذریعہ ہے۔ دریں اثنا، C. deserticola میں پانچ PhGs کے ڈھانچے کی LC-ESI-MSN کے ذریعے چھان بین کی گئی ہے۔ PhGs کی کچھ خصوصیتیں پائی گئیں، جنہوں نے ہمیں ڈھانچے میں فعال گروپوں کا تعین کرنے کی اجازت دی۔ لہذا LC-ESI-MSN طریقہ C. deserticola کے نچوڑ میں phenylethanoids اور ان کے glycosides کی تیزی سے شناخت کے لیے ایک طاقتور ٹول ہے، خاص طور پر جب NMR ڈیٹا کے ذریعے ثابت کیا جائے۔

اعتراف

مصنفین NMR تجربات میں مدد کے لیے نیوکلیئر میگنیٹک ریزوننس سینٹر، یونیورسٹی آف گیلف، اونٹاریو، کینیڈا کے جون گو کا شکریہ ادا کرنا چاہیں گی۔ اس منصوبے کو جزوی طور پر صوبہ جیلین، چین (نمبر 20060904) کی طرف سے فنڈنگ ​​سے تعاون حاصل تھا۔

حوالہ جات

چن، ایل جے، گیمز، ڈی ای، اور جونز، جے (2003)۔ تیز رفتار کاؤنٹر کرنٹ کرومیٹوگرافی کے ذریعہ اوروکسیلم انڈیکم کے بیجوں سے چار فلاوونائڈ اجزاء کی تنہائی اور شناخت۔ جرنل آف کرومیٹوگرافی اے، 988، 95–105۔

چینگ، ایکس وائی، وی، ٹی، گو، بی، نی، ڈبلیو، اور لیو، سی زیڈ (2005)۔ Cistanche deserticola cell suspension cultures: Phenylethanoid glycosides bio-synthesis and antioxidant activity. عمل بایو کیمسٹری، 40، 3119–3124۔

فوکو، اے پی، اور شیولوٹ، ایل (1998)۔ کاؤنٹر کرنٹ کرومیٹوگرافی: انسٹرومینٹیشن، سالوینٹ سلیکشن، اور قدرتی پروڈکٹ پیوریفیکیشن کے لیے کچھ حالیہ ایپلی کیشنز۔ جرنل آف کرومیٹوگرافی اے، 808، 3–22۔

G.-A., Lahloub, MF, Anklin, C., Schulten, H.-R., & Sticher, O. (1988)۔ Teucrioside، Teucrium Chamaedrys سے ایک phenylpropanoid glycoside. فائٹو کیمسٹری، 27، 1459–1463۔

He, ZD, Lau, KM, Xu, HX, Li, PC, & But, PPH (2000)۔ برینڈیسیا چانسز سے فینی لیتھانائڈ گلائکوسائیڈز کی اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی۔ جرنل آف ایتھنوفارماکولوجی، 71، 483–486۔

Kobayashi, H., Karasawa, H., & Miyase, T. (1984). Cistanchis Herba کے اجزاء پر مطالعہ. III نئے فینیلپروپینائڈ گلائکوسائیڈز کی تنہائی اور ساخت، سیستانوسائیڈ اے اور بی۔ کیمیکل اینڈ فارماسیوٹیکل بلیٹن، 32، 3009–3014۔

Kobayashi, H., Oguchi, H., Takizawa, N., Miyase, T., Ueno, A., Usmanghani, K., et al. (1987)۔ Cistanche tubulosa (Schrenk) Hook سے نئے phenylethanoid glycosides۔ ایف آئی کیمیکل اینڈ فارماسیوٹیکل بلیٹن، 35، 3309–3314۔

Lei, L., Yang, FQ, Zhang, TY, Tu, PF, Wu, LJ, & Ito, Y. (2001)۔ کاؤنٹر کرنٹ کرومیٹوگرافی کے ذریعے Cistanches salsa (CA Mey) G. Beck سے ایکٹیوسائیڈ اور 2'-ایسٹیل ایکٹیوسائیڈ کی تیاری کو الگ تھلگ اور پیوریفیکیشن۔ جرنل آف کرومیٹوگرافی اے، 912، 181–185۔

Li, L., Tsao, R., Liu, ZQ, Liu, SY, Yang, R., Young, JC, et al. (2005)۔ تیز رفتار کاؤنٹر کرنٹ کرومیٹوگرافی کے ذریعہ پلانٹاگو سائیلیم ایل سے ایکٹیوسائڈ اور آئسو ایکٹیوسائیڈ کو الگ تھلگ اور صاف کرنا۔ جرنل آف کرومیٹوگرافی اے، 1063، 161–169۔

لی، ایل ایل، وانگ، ایکس ڈبلیو، اور وانگ، ایکس ایف (1997)۔ اینٹی لیپڈ پیرو آکسائڈریشن اور ہربا سیستانچس میں گلائکوسائڈز کی اینٹی ریڈیکل کارروائی۔ چائنا جرنل آف چائنیز میٹیریا میڈیکا، 22، 364–367۔

لی، جے، وانگ، پی ایف، زینگ، آر ایل، لیو، زیڈ ایم، اور جیا، زیڈ جے (1993)۔ وٹرو میں oxidative hemolysis کے خلاف Pedicularis سے phenylpropanoid glycosides کا تحفظ۔ پلانٹا میڈیکا، 59، 315–317۔

لو، ایم سی (1998)۔ Cistanche deserticola کے سکون آور اثر پر مطالعہ۔ جرنل آف ایتھنوفارماکولوجی، 59، 161–165۔

نشیمورا، ایچ.، ساساکی، ایچ.، انگاکی، این، چن، ایم، اور مٹسوہاشی، ایچ (1991)۔ Stachys szeboldzz سے نو فینیتھائل الکحل گلائکوسائیڈز۔ فائٹو کیمسٹری، 30، 965-969۔

اوکا، ایف، اوکا، ایچ، اور ایتو، وائی (1991)۔ تیز رفتار کاؤنٹر کرنٹ کرومیٹوگرافی کے لیے موزوں دو فیز سالوینٹ سسٹمز کی منظم تلاش۔ جرنل آف کرومیٹوگرافی، 538، 99-108۔

Ravn, H., Nishibe, S., Sasahara, M., & Li, X. (1990). پلانٹاگو ایشیاٹیکا سے فینولک مرکبات۔ فائٹو کیمسٹری، 29، 3627–3631۔

Schapoval, EES, Winter de Vargas, MR, Chaves, CG, Bridi, R., Zuanazzi, JA, & Henriques, AT (1998). Stachytarpheta cayenensis کے نچوڑ اور الگ تھلگ مرکبات کی سوزش اور اینٹی نوسیسیپٹیو سرگرمیاں۔ جرنل آف ایتھنوفارماکولوجی، 60، 53-59۔

Shoyama, Y., Matsumoto, M., & Nishioka, I. (1987). Rehmannia glutinosa Var کی بیمار جڑوں سے فینولک گلائکوسائیڈز۔ پورپوریا۔ فائٹو کیمسٹری، 26، 983–986۔

Wang, XW, Jiang, XY, Wu, LY, & Wang, XF (2001)۔ Cistanche deserticola کے گلائکوسائیڈز کا فری ریڈیکلز پر اثر اور وٹرو میں OH-حوصلہ افزائی ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کے خلاف اس کا تحفظ۔ جرنل آف چائنیز فارماکولوجی، 36، 29-31۔