Lysosomal Lipid Peroxidation ٹیومر کی قوت مدافعت کو منظم کرتا ہے۔

palmitoyl-protein thioesterase 1 (PPT1) inhibitors جیسے DC661 کے ذریعے حاصل کردہ Lysosomal inhibitors سیل کی موت پیدا کر سکتا ہے، لیکن اس کا طریقہ کار پوری طرح سے سمجھ میں نہیں آیا ہے۔ DC661 کے سائٹوٹوکسک اثر کو حاصل کرنے کے لئے پروگرام شدہ سیل موت کے راستے (آٹوفیگی، اپوپٹوسس، نیکروپٹوسس، فیروپٹوسس، اور پائروپٹوسس) کی ضرورت نہیں تھی۔ کیتھیپسن کی روک تھام، یا آئرن یا کیلشیم کیلیشن، DC661-حوصلہ افزائی سائٹوٹوکسیٹی کو نہیں بچا سکی۔ PPT1 کی روک تھام نے lysosomal lipid peroxidation (LLP) کی حوصلہ افزائی کی، جس کی وجہ سے lysosomal membrane permeabilization اور سیل کی موت واقع ہوئی جسے اینٹی آکسیڈینٹ N-acetylcysteine ​​(NAC) کے ذریعے تبدیل کیا جا سکتا ہے لیکن دوسرے لپڈ پیرو آکسیڈیشن اینٹی آکسیڈنٹس کے ذریعے نہیں۔ این اے سی کی انٹرالیسوسومل ٹرانسپورٹ اور ایل ایل پی کے بچاؤ کے لیے لیزوسومل سیسٹین ٹرانسپورٹر MFSD12 کی ضرورت تھی۔ پی پی ٹی 1 کی روک تھام نے کیلریٹیکولن کی سطح کے اظہار کے ساتھ سیل اندرونی امیونوجنیسیٹی پیدا کی جسے صرف NAC کے ساتھ تبدیل کیا جاسکتا ہے۔ DC661-علاج شدہ خلیات پرائمڈ Nive T سیلز اور بہتر T سیل – ثالثی زہریلا۔ DC کے ساتھ ٹیکے لگائے گئے چوہوں نے علاج شدہ خلیات کو "امیون گرم" ٹیومر میں انکولی قوت مدافعت اور ٹیومر کو مسترد کیا لیکن "امیون سرد" ٹیومر میں نہیں۔ یہ نتائج یہ ظاہر کرتے ہیں کہ LLP لائسوسومل سیل ڈیتھ کو چلاتا ہے، جو سیل کی موت کی ایک منفرد امیونوجینک شکل ہے، جس سے امیونو تھراپی اور لائسوسومل روکنا کے عقلی امتزاج کی طرف اشارہ کیا جا سکتا ہے جس کا کلینیکل ٹرائلز میں تجربہ کیا جا سکتا ہے۔

cistanche tubulosa-antitumor کے فوائد

تعارف

کلینکل ٹرائلز میں حوصلہ افزا سرگرمی کے ساتھ جس میں لائسوسومل انحیبیٹر ہائیڈروکسی کلوروکوئن (HCQ) (1) شامل ہے، palmitoyl-protein thioesterase 1 (PPT1) کی کلوروکین مشتقات کے مالیکیولر ہدف کے طور پر شناخت (2)، اور ناول پی پی ٹی 1 کی شروعات ٹرائلز (3, 4)، اس طریقہ کار کو سمجھنے کی ضرورت ہے جس کے ذریعے لیسوسومل انحیبیٹرز سیل کی موت اور ٹیومر کی قوت مدافعت پر لائسوسومل روک کے اثر کو متاثر کرتے ہیں۔ HCQ کے لیے بیان کردہ lysosomal سیل کی موت کے کینونیکل میکانزم میں lysosomal membrane permeabilization (LMP)، کیتھیپسن کا رساو، اور کیسپیس میڈیٹڈ اپوپٹوس (5, 6) کو چالو کرنا شامل ہے۔ ہم نے پہلے دکھایا ہے کہ lysosomal inhibitor DC661 تیزابی ٹیومر مائیکرو ماحولیات میں خلیات میں گھستا ہے اور HCQ (2, 7) سے زیادہ مؤثر طریقے سے lysosome میں مقامی بناتا ہے۔ DC661 کئی کینسر سیل لائنوں (2) میں طاقتور سیل کی موت پیدا کرتا ہے۔ DC661 PPT1 کو جوڑتا اور روکتا ہے، lysosome کو deacidifies، اور autophagy کو روکتا ہے۔ DC661 LMP کو بھی آمادہ کرتا ہے اور کلیویڈ کیسپیس 3 (2, 7) کی سطح کو بڑھاتا ہے۔ حالیہ برسوں میں، خلیوں کی موت کے نئے میکانزم کی وضاحت کی گئی ہے جن کے امیونوجینک نتائج ہوتے ہیں اور ان میں نیکروپٹوسس، فیروپٹوسس، اور پائروپٹوسس (8) شامل ہیں۔ لائزوزوم پر منحصر آٹوفجی کو MHC کلاس I (9) کے ساتھ ساتھ امیونوپروٹیزوم (10) کے اجزاء کو کم کرنے کے لیے دکھایا گیا ہے، یہ تجویز کرتا ہے کہ آٹوفیجی روکنا اینٹیجن پروسیسنگ کو بڑھا سکتا ہے۔ تاہم، لیسوسومل روکنا اور اس کے نتیجے میں سیل کی موت کے امیونوجینک اثرات کو مکمل طور پر نمایاں نہیں کیا گیا ہے۔ اس نالج گیپ کو دور کرنے کے لیے، ہم نے DC661 کے کیننیکل سیل ڈیتھ میکانزم پر اثرات کی تحقیقات کی تاکہ یہ معلوم کیا جا سکے کہ آیا لائوسوومل سیل ڈیتھ سیل ڈیتھ کی اس کی شکل ہے یا صرف دوسرے قائم کردہ میکانزم میں سے کسی ایک کا پیش خیمہ ہے۔ ہم نے پایا کہ HCQ اور DC661 نے میلانوما پروٹوم میں پروٹین کی صرف ایک چھوٹی سی تعداد میں نمایاں اضافہ کیا اور ان میں سے زیادہ تر آٹوفیجی- اور اپوپٹوسس سے متعلق پروٹین تھے۔ پروگرام شدہ سیل ڈیتھ (اپوپٹوسس، نیکروپٹوسس، فیروپٹوسس، اور پائروپٹوسس) کے روکنے والوں نے DC661 کے ذریعہ لائسوسومل خرابی کے بعد سائٹوٹوکسک اثرات کو کم نہیں کیا۔ Lysosomal lipid peroxidation (LLP) سیل کی سطح پر calreticulin (CALR) اظہار سے وابستہ LMP-حوصلہ افزائی سیل کی موت کا ایک بڑا ڈرائیور ہے۔ سیل کی موت کی اس شکل کو صرف اینٹی آکسیڈینٹ N-acetylcysteine ​​(NAC) کے استعمال سے ہی تبدیل کیا جا سکتا ہے۔ NAC کی سرگرمی lysosomal cysteine ​​importer MFSD12 کی روک تھام سے متاثر ہوئی تھی۔ ایل ایل پی نے ٹی سیل ثالثی قتل کو فروغ دینے والے امیونوجینک فینوٹائپس کو حاصل کیا۔ یہ نتائج یہ ظاہر کرتے ہیں کہ لیوسوومل سیل کی موت امیونوجینک سیل کی موت کی ایک ممکنہ طور پر منفرد شکل ہے۔

cistanche پلانٹ میں مدافعتی نظام میں اضافہ

نتائج

لائسوسومل روکنا آٹوفجی اور اپوپٹوسس سے وابستہ پروٹوم میں نمایاں تبدیلیاں لاتا ہے۔ lysosomal inhibitors کے cytotoxic اثرات کو قائم کرنے کے لیے، ہم نے A375P میلانوما، RKO کولون کارسنوما، اور MIA PaCa-2 لبلبے کے کینسر کے سیل لائنوں کی عملداری کا اندازہ لگایا جو ویکیولر H+-ATPase inhibitor bafilomycin-A1-A1 کے ساتھ علاج کیا جاتا ہے۔ 00 nM); PPT1 inhibitors DC661 (3 μM) یا HCQ (10 μM یا 30 μM)؛ palmitate mimetic hexadecyl سلفونیل فلورائیڈ (HDSF؛ 60 μM)؛ cathepsin inhibitors pepstatin A (PepA؛ 10 ug/mL)، E64 (PepA؛ 10 ug/mL)، یا PepA+E64؛ اور lysosomal membrane disruptor Leu-Leu methyl ester hydrobromide (20 μM) 48 گھنٹے کے لیے۔ صرف bafilomycin-A1 اور DC661 نے کینسر سیل لائنوں میں سیل کی عملداری میں نمایاں کمی کا باعث بنا (شکل 1A اور ضمنی شکل 1A؛ اس مضمون کے ساتھ آن لائن دستیاب اضافی مواد؛ https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1)، DC661 کے ساتھ bafilomycin-A1 کے مقابلے میں سیل کی عملداری میں زیادہ گہری کمی۔ ان اعداد و شمار اور فارماسولوجیکل دوائیوں کی بنیاد پر – جیسے کلوروکوئن مشتق کی خصوصیات، ہم نے اپنے مطالعہ کو کلوروکوئن ڈیریویٹیوز پر مرکوز کیا تاکہ لائسوسومل سیل ڈیتھ کو سمجھنے کے لیے ٹولز ہوں۔ DC661 (3 μM) یا کم طاقتور HCQ (10 μM یا 30 μM) کے ساتھ 24 گھنٹے تک علاج کیے جانے والے A375P میلانوما خلیوں پر غیر جانبدارانہ عالمی پروٹوم تجزیہ لاگو کیا گیا تھا۔ 4,264 اعلیٰ اعتماد کے مقداری پروٹینوں میں سے، بالترتیب DC661 (3 μM) اور HCQ (30 μM) کے ساتھ صرف 87 اور 55 پروٹین نمایاں طور پر بڑھے تھے۔ مزید برآں، DC661 (3 μM) اور HCQ (30 μM) کے ساتھ بالترتیب 14 اور 15 پروٹینوں میں بالترتیب (2 سے زیادہ کی مطلق گنا تبدیلی؛ q <0.05) DC661 (3 μM) یا HCQ (30 μM) کے ساتھ بالترتیب نمایاں کمی واقع ہوئی۔ ، جب گاڑی کے کنٹرول سے موازنہ کیا جائے۔ HCQ (10 μM) کی نچلی خوراک نے گاڑیوں کے کنٹرول کے مقابلے میں کوئی خاص پروٹین تبدیلیاں نہیں دکھائیں۔ DC661 کے علاج کے بعد نمایاں طور پر بڑھے ہوئے 50 پروٹین بنیادی طور پر آٹوفیجی اور اپوپٹوسس سے وابستہ تھے، اور HCQ (شکل 1B) کی زیادہ خوراک کے لیے بھی اسی طرح کی تبدیلیاں دیکھی گئیں۔ ان وجوہات کی بناء پر، ہم نے زیادہ طاقتور DC661 پر مزید مطالعات پر توجہ مرکوز کرنے کا انتخاب کیا۔ آٹوفیجی اور اپوپٹوس سے وابستہ پروٹین کی کچھ بڑی تبدیلیوں کی مثالیں ٹیکس1-بائنڈنگ پروٹین 1 (TAX1BP1؛ بڑھی ہوئی 15-گنا) تھیں۔ BCL2-تعامل کرنے والا پروٹین 3 (BNIP3؛ بڑھا ہوا 6-گنا)؛ BRCA1 جین 1 پروٹین کا پڑوسی (NBR1؛ اضافہ 12-گنا)؛ sequestosome-1 (SQSTM1/p62؛ بڑھا ہوا 5-گنا)؛ نیوکلیئر ریسیپٹر کو ایکٹیویٹر 4 (NCOA4؛ بڑھا ہوا 3-گنا)؛ اور LC3B (MAP1LC3B؛ بڑھ گیا 3-گنا)۔ Apolipoprotein B-100 (APOB؛ بڑھا ہوا 66-گنا) جنین کے بچھڑے کے سیرم سے اخذ کیا گیا تھا اور اس کا مزید مطالعہ نہیں کیا گیا تھا۔ امیونوبلوٹنگ نے اس بات کی تصدیق کی کہ DC661 یا HCQ کے اس سے زیادہ ارتکاز کے ساتھ علاج سے آٹوفجی کارگو ریسیپٹرز NBR1، TAX1BP1، SQSTM1/p62، اور NCOA4 کے اظہار میں ایک خوراک اور وقت پر منحصر انداز میں نمایاں اضافہ ہوا ہے (ضمنی شکل 1، B اور C)۔ A375P خلیوں میں PPT1 کے CRISPR/Cas9 KO نے ان پروٹینوں پر DC661 کے اثرات کو اپنے WT ہم منصبوں (ضمنی شکل 1D) کے مقابلے میں فینوکوپی کیا۔ تاہم، آٹوفجی کارگو ریسیپٹرز کا اظہار اور DC661 کے علاج کے ذریعے پیدا ہونے والے رشتہ دار اضافہ بڑی آنت کے کینسر، لبلبے کے کینسر، اور دیگر میلانوما سیل لائنوں میں متغیر تھے جن میں DC661 سائٹوٹوکسائٹی (ضمنی شکل 1E) کو ظاہر کرتا ہے۔ اس نے تجویز کیا کہ آٹوفجی کارگو ریسیپٹرز خود، اگرچہ پروٹین کی سطح پر بڑھے ہیں، DC661 کے علاج کے بعد سیل کی موت کے لیے ذمہ دار ہونے کا امکان نہیں ہے۔ اس کی تصدیق کرنے کے لیے، ہم نے آٹوفجی کارگو ریسیپٹرز TAX1BP1 اور BNIP3 پر توجہ مرکوز کی کیونکہ وہ کینسر کے خلیوں میں پروپوپٹوٹک اثرات جانتے ہیں (شکل 1C)۔ TAX1BP1 ایک آٹوفجی کارگو اڈاپٹر ہے (11) اور کینسر کے خلیوں میں پروٹین کی ترکیب روکنے والے یا ڈی این اے کو نقصان پہنچانے والے ایجنٹوں کے ذریعہ پیدا ہونے والے اپوپٹوس کو بھی منظم کرتا ہے (12)۔ SIRNA (Figure 1D) کے ذریعے TAX1BP1 کے ناک آؤٹ نے DC661-کی حوصلہ افزائی سائٹوٹوکسیٹی کو قلیل مدتی (فگر 1E) اور طویل مدتی قابل عمل اسسیس (شکل 1F) میں متاثر نہیں کیا۔ ان نتائج نے ظاہر کیا کہ TAX1BP1 DC661-ثالثی سائٹوٹوکسائٹی میں ضروری کردار ادا نہیں کرتا ہے۔ بی این آئی پی 3 ایک پروپوپٹوٹک پروٹین ہے جو مائٹوکونڈریل بائیو اینرجیٹکس کو خراب کرتا ہے اور مائٹوفگی کو منظم کرتا ہے (13)۔ BNIP3 (فگر 1G) کے مؤثر ناک ڈاؤن نے DC661-حوصلہ افزائی سائٹوٹوکسٹی (اعداد و شمار 1، H، اور I) کو متاثر نہیں کیا۔ ان نتائج سے ظاہر ہوا کہ DC661 کے سائٹوٹوکسک اثرات BNIP3 اظہار سے آزاد ہیں۔ اس کے بعد، ہم نے DC661 کی افادیت پر آٹوفیگوسم پروڈکشن کے لیے درکار کینونیکل آٹوفیجی جینز کے خلیات کو ختم کرنے کے اثرات کا مطالعہ کیا جیسے کہ آٹوفجی ایکٹیویٹ کناز 1 (ULK1) اور آٹوفیجی سے متعلق جین 7 (ATG7) کو گھٹا کر۔ ULK1 یا ATG7 (ضمنی شکل 2, A اور B) کے موثر ناک ڈاؤن نے آٹوفیجک فلوکس (ضمنی شکل 2C) کو روکا لیکن اس نے DC661-حوصلہ افزائی سائٹوٹوکسٹی (شکل 1, J–M) کو متاثر نہیں کیا۔ ان نتائج سے ظاہر ہوا کہ ضروری بنیادی آٹوفیجی مشینری کی عدم موجودگی DC661 کے سائٹوٹوکسک اثرات کو منسوخ نہیں کرتی ہے۔ DC661 کی طرف سے Lysosomal روکنا متعدد پروگرام شدہ سیل موت کے راستوں کو اکساتا ہے۔ کیننیکل نقطہ نظر یہ ہے کہ لیوسوومل سیل کی موت اپوپٹوسس (5) کی وجہ سے ہے۔ امیونوبلوٹنگ نے انکشاف کیا کہ DC661 کے علاج کے نتیجے میں کیسپیس-3، -7، اور -9 کو چالو کیا گیا اور PARP-1 کا کلیویج ہوا، اس بات کی تصدیق کرتا ہے کہ DC661 نے اپوپٹوس کو چالو کیا (شکل 2A)۔ پین-کیسپیس انحیبیٹر Z-VAD-FMK نے DC661 کے ذریعے کیسپیس ایکٹیویشن کو روکا لیکن LC3B اور p62 کے جمع ہونے کو نہیں روکا، یہ ظاہر کرتا ہے کہ اپوپٹوسس ایکٹیویشن اور آٹوفجی ناکہ بندی لیسوسومل انبیبیشن (شکل 2B) کے بعد الگ ہونے والی ہے۔ ZVAD-FMK کے ساتھ apoptosis کو مسدود کرنے سے DC661 cytotoxicity میں اضافہ یا محدود نہیں ہوا، یہ تجویز کرتا ہے کہ apoptosis lysosomal سیل کی موت (شکل 2، C، اور D) کے لیے قابل استعمال ہے۔ DC661 کے سائٹوٹوکسک اثرات بیکس/باک ڈبل-KO پرائمری بون میرو سیلز میں ملتے جلتے تھے جو اپوپٹوس اور ڈبلیو ٹی سیلز (شکل 2E) سے گزرنے کے قابل نہیں تھے۔ اپوپٹوسس کی ناکہ بندی نے بڑی آنت کے کینسر اور لبلبے کے کینسر کے خلیوں میں بھی DC661-کی حوصلہ افزائی سائٹوٹوکسائٹی کو متاثر نہیں کیا (ضمنی شکل 2، D–F)۔ چونکہ ہم نے ڈی سی661-کی حوصلہ افزائی سیل کی موت کے لیے اپوپٹوس کو قابل استعمال پایا، ہم نے تحقیق کی کہ آیا DC661 necroptosis کو دلاتا ہے، پروگرامڈ سیل ڈیتھ کی ایک اور شکل جسے ریسیپٹر-انٹریکٹنگ پروٹین کناز (RIPK) اور مخلوط نسب کناز ڈومین نما پروٹین (RIPK) کے ذریعے منظم کیا جاتا ہے۔ ایم ایل کے ایل)۔ 0.1–1 μM (شکل 2F) سے DC661 کے علاج کے بعد RIPK اور MLKL کی فاسفوریلیٹڈ اور چالو شکلوں کی سطح میں اضافہ کیا گیا تھا۔ 3 μM DC661 میں فاسفوریلیٹڈ RIPK1 کی عدم موجودگی تھی لیکن مستقل فاسفوریلیٹڈ MLKL، یہ تجویز کرتا ہے کہ، اس اعلی حراستی میں، سیل کی موت کی اضافی شکلیں شامل کی جا سکتی ہیں۔ RIPK1 inhibitors necrostatin-1 or necrostatin-1s یا MLKL inhibitor necrosulfonamide کے ساتھ پہلے سے علاج نے میلانوما سیلز (شکل 2G) میں DC661 (1 μM) علاج کے بعد RIPK1 کے فاسفوریلیشن کو روکا لیکن بچاؤ میں ناکام رہا۔ }} میلانوما سیلز (شکل 2H) یا بڑی آنت کے کینسر یا لبلبے کے کینسر کے خلیات (ضمنی شکل 2G) میں سائٹوٹوکسائٹی کی حوصلہ افزائی۔ یہ نتائج بتاتے ہیں کہ نیکروپٹوسس فعال ہے لیکن DC{195}}ثالثی سیل کی موت کے لیے قابل استعمال ہے۔

تصویر 1. لائسوسومل آٹوفجی روکنا اپوپٹوس اور آٹوفجی پروٹین میں اہم تبدیلیاں لاتا ہے۔ (ا)

Lysosomes لوہے کے لئے اہم سٹوریج سائٹس میں سے ایک ہیں. غیر منظم انٹرا سیلولر آئرن میٹابولزم کے ساتھ مل کر تخفیف کی صلاحیت میں کمی ناناپوپٹوٹک سیل کی موت کو متحرک کر سکتی ہے جسے فیروپٹوسس کہا جاتا ہے۔ فیروپٹوسس کی ایک پہچان پروسٹگینڈن-اینڈوپیرو آکسائیڈ سنتھیس 2 (PTGS2)، کیشن ٹرانسپورٹ ریگولیٹر ہومولوگ 1 (CHAC1)، اور cysteinyl-tRNA synthetase (CARS) (14) کی اپ گریجشن ہے۔ ان میں سے تمام 3 فیروپٹوسس مارکر کو DC661 علاج (شکل 3A) کے ذریعہ نقلی طور پر اپ گریڈ کیا گیا تھا ، یہ تجویز کرتا ہے کہ لیزوسومل روکنا فیروپٹوسس کو اکساتا ہے۔ DC661 نے C11–BODIPY–علاج شدہ A375P خلیات میں فلوروسینس شفٹ کی حوصلہ افزائی کی، جس سے لیپڈ پیرو آکسیڈیشن کی نشاندہی ہوتی ہے، فیروپٹوسس کی خصوصیت۔ یہ DC661-حوصلہ افزائی کی گئی شفٹ فیروپٹوسس انحیبیٹرز فیروسٹیٹن-1 یا لپ روکسٹاٹین-1 کی موجودگی میں نمایاں طور پر الٹ گئی تھی جو ایک مؤثر ارتکاز (شکل 3B اور ضمنی شکل 3A) میں دی گئی تھی، مزید یہ ظاہر کرتی ہے کہ DC661 حوصلہ افزائی ferroptosis. تاہم، فیروپٹوسس کی روک تھام نے DC661 (شکل 3، C اور D) سے وابستہ سائٹوٹوکسٹی کو نہیں بچایا۔ آئرن چیلیٹر ڈیفیروکسامین (DFO) اور DC661 کے ساتھ کینسر کے خلیوں کے علاج سے DC661 (شکل 3E) کی سائٹوٹوکسٹی کو نہیں بچایا گیا۔ فیروسٹیٹن-1، لپ روکسٹاٹین-1، یا ڈی ایف او کے ساتھ علاج نے میلانوما، بڑی آنت، اور لبلبے کے کینسر کے خلیوں میں DC661 کی قلیل مدتی عملداری یا طویل مدتی کلونجینک نمو کو نہیں بچایا (ضمنی شکل 3، B -E، اور ضمنی شکل 4، A–D)۔ یہ اعداد و شمار ظاہر کرتے ہیں کہ فیروپٹوسس فعال ہے لیکن DC661-ثالثی سیل کی موت کے لیے قابل استعمال ہے۔ ایک پائروپٹوسس پروگرام شدہ سیل کی موت کی ایک شکل ہے جو سوزش کے ردعمل سے منسلک ہوتی ہے جس میں کیسپیسز کو چالو کرنا شامل ہوتا ہے جو گیسٹرن (GSDM) پر عمل کرتے ہیں، جس سے پلازما جھلی پر تاکنا بننے اور نقصان سے وابستہ مالیکیولر پیٹرن کی رہائی کی اجازت ہوتی ہے، جیسے کہ ہائی موبلٹی۔ گروپ باکس 1 (HMGB1)۔ ایک سے زیادہ میلانوما سیل لائنوں (A375P، A375، WM35، اور WM793) میں DC661 کے علاج کے نتیجے میں انیشی ایٹر کیسپیس-8 اور -9 اور ایگزیکیونر کیسپیس-7 کو چالو کیا گیا، جو پائروپٹوسس کے لیے عام ہے، اور تیار کیا گیا ہے۔ مکمل طوالت والے GSDME کی کلیویج، معلوم پائروپٹوسس انڈیسر PLX4720 اور PD0325901 (ضمنی شکل 5A) کی حد تک۔ DC661 نے 1% FBS (15) میں معروف پائروپٹوسس انڈیسر، BRAF، اور MEK کی روک تھام کے مقابلے میں HMGB1 کی مضبوط ایکسٹرا سیلولر ریلیز تیار کی، جو فعال پائیروپٹوسس کے فعال نتیجہ کی عکاسی کرتی ہے۔ اگلا، ہم نے جانچ کیا کہ آیا GSDME KO کے ذریعہ پائروپٹوسس کی روک تھام DC661 کے سائٹوٹوکسک اثرات کو کم کرے گی۔ DC661 علاج نے LC3II اور SQSTM1/p62 جمع کرنے اور کیسپیس ایکٹیویشن کی حوصلہ افزائی کی، لیکن HMGB1 کی رہائی کو GSDME-KO WM35 انسانی خلیوں میں تقریباً مکمل طور پر منسوخ کر دیا گیا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ پائروپٹوسس کو روکنے کا عملی نتیجہ حاصل کیا گیا تھا (شکل 3F)۔ تاہم، DC661 کے علاج نے YUMM1.7 WT، خالی ویکٹر (EV) اور Gsdme KO1 اور KO2 خلیوں میں 10% اور 1% FBS دونوں حالتوں میں مساوی سائٹوٹوکسٹی پیدا کی (شکل 3G اور ضمنی شکل 5B)۔ سیل کی موت کی متعدد شکلوں کا ایک عام نتیجہ LDH کا جاری ہونا ہے۔ DC661 نے LDH کی رہائی میں نمایاں اضافہ کیا، اور اسے apoptosis، necroptosis، یا ferroptosis inhibition (ضمنی شکل 5C) سے تبدیل نہیں کیا جا سکتا۔ ان نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ DC661 سیل کی موت کے متعدد طریقوں کو آمادہ کرتا ہے، بشمول apoptosis اور pyroptosis کے ساتھ ساتھ necroptosis اور ferroptosis، لیکن DC661-کی حوصلہ افزائی سیل کی موت کے لیے ان طریقوں میں سے کسی کی بھی ضرورت نہیں ہے۔ کیتھیپسن کی روک تھام یا کیلشیم کیلیشن لیزوسومل جھلی کے پارمیبلائزیشن سے سیل کی موت کو نہیں روکتی ہے۔ یہ ظاہر کرنے کے بعد کہ کیسپیس ایکٹیویشن (جو apoptosis اور pyroptosis کے لیے ضروری ہے) DC661-حوصلہ افزائی سیل کی موت کے لیے قابل استعمال ہے، ہم نے یہ قیاس کیا کہ کیسپیس پر منحصر سیل کی موت کا سبب بن سکتا ہے۔ کیمیکل (DC661) یا جینیاتی (PPT1 siRNA [siPPT1]) PPT1 کی روک تھام نے lysosomal membrane permeabilization (LMP) پیدا کیا، جبکہ HDSF، PPT1 کا ایک کم طاقتور ناقابل واپسی روکنے والا جو سیل کلچر میں تیزی سے ختم ہو جاتا ہے، LMP کی پیمائش نہیں کر سکتا۔ بذریعہ galectin-3–مثبت پنکٹا (شکل 4A)۔ ایل ایم پی کے نتیجے میں کیتھیپسن اور دیگر لائسوسومل مواد کو سائٹوپلازم میں خارج کیا جاتا ہے اور اسے لائسوسم پر مبنی سیل کی موت کی ایک اہم قربت کی خصوصیت سمجھا جاتا ہے۔ DC661 کے ذریعہ حوصلہ افزائی شدہ LMP سائٹوپلاسمک کیتھیپسن-L سرگرمی میں نمایاں اضافے کے ساتھ وابستہ تھا ، جسے سسٹین پروٹیز انحیبیٹر E64 (شکل 4B) کے ساتھ نمایاں طور پر مسدود کردیا گیا تھا۔ پچھلی رپورٹس میں بتایا گیا ہے کہ فریکچرڈ لائوسومز سے کیتھیپسن کی رہائی کیسپیس ایکٹیویشن کو فروغ دیتی ہے، جس سے اپوپٹوٹک سیل کی موت ہوتی ہے (16–18)۔ مکمل کیتھیپسن کی روک تھام نے کیسپیس کلیویج (فگر 4C) کو نہیں روکا اور میلانوما (شکل 4، D اور E)، بڑی آنت کے کینسر، اور لبلبے کے قلیل مدتی اور طویل مدتی عملداری پرکھوں میں DC661-کی حوصلہ افزائی سائٹوٹوکسٹی کو نہیں بچایا۔ کینسر کے خلیات (ضمنی شکل 6، A–C)۔ یہ نتائج لیسوسومل سیل کی موت کے کیننیکل نقطہ نظر کا مقابلہ کرتے ہیں جیسا کہ کیتھیپسن کی ثالثی سیل کی موت سے ہوتا ہے۔ لیکی لائزوزوم سے کیتھیپسن کے اخراج کے علاوہ، پی پی ٹی 1 کے خراب ہونے پر لائزوزوم سے کیلشیم کا اخراج سیلولر ڈیسفکشن میں ملوث ہوتا ہے (19)۔ DC661 کے علاج کے نتیجے میں وسیع پیمانے پر کیلشیم کا اخراج ہوا، جسے سیل پرمیننٹ کیلشیم (Ca{101}}) چیلیٹر، BAPTA-AM کے پہلے سے علاج کے ذریعے منسوخ کر دیا گیا۔ (شکل 4F)۔ خاص طور پر، BAPTA-AM نے DC661-حوصلہ افزائی LMP (Figure 4G) یا کیسپیس کلیویج (ضمنی شکل 6, D, اور E) کو نہیں روکا اور سب سے اہم بات یہ ہے کہ DC661-حوصلہ افزائی سائٹوٹوکسٹی کو نہیں بچایا ( شکل 4H)۔ یہ نتائج RKO اور MIA PaCa دونوں سیل لائنوں میں بھی دیکھے گئے، جس میں BAPTA-AM اور DC661 (ضمنی شکل 6F) کے ساتھ IC50 اقدار میں کوئی خاص فرق نہیں دیکھا گیا، جس نے تجویز کیا کہ LMP سے وابستہ سیل کی موت کیلشیم یا کیتھیپسن پر منحصر نہیں ہے۔

شکل 2. DC661-حوصلہ افزائی apoptosis اور necroptosis. (ا)

شکل 3. DC661-حوصلہ افزائی فیروپٹوسس اور پائروپٹوسس۔ (ا)

LLP LMP چلاتا ہے۔ یہ قائم کرنے کے بعد کہ خلیوں کی موت کے بڑے راستوں (اپوپٹوس، نیکروپٹوسس، فیروپٹوسس، اور پائروپٹوسس)، کیتھیپسن (پی پی اے اور ای 64)، اور آئن چیلیٹرس (BAPTA-AM [Ca2+] اور DFO [Fe{{3} }]) نے DC661 کے ذریعہ سیل کی موت کو نہیں روکا اور C-11-BODIPY کے ذریعہ لپڈ پیرو آکسیڈیشن کے ثبوت تلاش کرنے سے، ہم نے DC661 کے علاج کے 2 اور 4 گھنٹے بعد ایک عالمی لپڈوم تجزیہ کیا۔ DC661 نے لائسو فاسفولیپڈ (شکل 5A) کے ہر طبقے میں ابتدائی اور مسلسل 3- سے 10-گنا اضافہ کیا۔ اس کے برعکس، فاسفولیپڈ کلاسوں میں کم سے کم یا کوئی تبدیلیاں نہیں دیکھی گئیں، جن میں فاسفیٹائیڈیلچولین، فاسفیٹائیڈیلتھانولامین، فاسفیٹائڈیلسرین، فاسفیٹائیڈلینوسیٹول، فاسفیٹائڈیلگلیسرول، اور فاسفیٹیڈک ایسڈ (ضمنی شکل 7A) شامل ہیں۔ Lysophospholipid پرجاتیوں کو ROS کے ذریعے پیدا کیا جا سکتا ہے، جو سیچوریٹڈ فیٹی ایسڈ چین کو آکسائڈائز کرتا ہے جسے فاسفولیپیسس (20) کے ذریعے بند کر دیا جاتا ہے۔ اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا اینٹی آکسیڈنٹس ROS-ثالثی لپڈ کو پہنچنے والے نقصان کو روک سکتے ہیں، ہم نے پین-ROS اسکیوینجر N-acetylcysteine ​​(NAC) (21, 22) اور پوٹیٹیو لپڈ پیرو آکسیڈیشن روکنے والے Trolox (23) کی موجودگی میں DC661-کی حوصلہ افزائی سائٹوٹوکسٹی کی تحقیقات کی۔ ) اور وٹامن سی (ایسکوربک ایسڈ) (24، 25)۔ اب تک جانچے گئے کسی بھی دوسرے ایجنٹ کے برعکس، NAC کے ساتھ علاج نے متعدد سیل لائنوں (شکل 5B اور ضمنی شکل 7B) میں DC661- سے وابستہ سائٹوٹوکسیٹی کو بچایا۔ طویل مدتی CFU اسسیس نے ظاہر کیا کہ NAC، تمام سیل ڈیتھ انحیبیٹرز، ion chelators، اور cathepsin inhibitors کے برعکس، A375P، RKO، MIA PaCa-2، B16F10، اور 33MC سیلز میں DC661 کے سائٹوٹوکسک اثرات کو روکتا ہے۔ شکل 5C اور ضمنی شکل 7C)۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ ٹرولوکس اور وٹامن سی نے انسانی میلانوما، کولوریکٹل کینسر، لبلبے کے کینسر کے خلیات اور مورین میلانوما اور کولوریکٹل کینسر کے خلیات (شکل 5D اور ضمنی شکل 7، D–H) میں DC661 سائٹوٹوکسائٹی کو نہیں بچایا۔ اس تفاوت نے ہمیں جانچنے پر آمادہ کیا کہ آیا NAC، Trolox، اور وٹامن C نے LMP کو متاثر کیا۔ ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ NAC واحد اینٹی آکسیڈنٹ تھا جس نے DC661-حوصلہ افزائی LMP (Figure 5E) کو نمایاں طور پر کم کیا۔ ہم نے یہ قیاس کیا کہ LLP LMP کی پیداوار کو DC661 کے ذریعے چلاتا ہے، جسے NAC کے ذریعے تبدیل کیا جا سکتا ہے لیکن Trolox اور وٹامن C کے ذریعے نہیں۔ LLP کے عمل کا مطالعہ کرنے کے لیے ہم نے فلوروسینٹ پروب FOAM-LPO (26) کا استعمال کیا، جو خاص طور پر lysosome کو مقامی بناتا ہے اور پیدا کرتا ہے۔ لپڈ پیرو آکسائیڈز کے سامنے آنے پر 586 سے 512 nm (سرخ سے سبز) کی اسپیکٹرل شفٹ۔ ہم نے پایا کہ کنٹرول (شکل 5F) کے مقابلے میں DC661 نے ایل ایل پی کی حوصلہ افزائی کی۔ NAC نے DC661-علاج شدہ میلانوما خلیات کے لائسوسومز میں لپڈ پیرو آکسیڈیشن کو کم کیا، جبکہ Trolox اور وٹامن C LLP (شکل 5F) کو کم کرنے میں ناکام رہے۔ NAC، Trolox، اور وٹامن C کا اپنے طور پر لپڈ پیرو آکسیڈیشن پر کوئی خاص اثر نہیں ہوا۔ PPT1 (ضمنی شکل 8A) کی ناک آؤٹ، یا HCQ (ضمنی شکل 8B) کے اعلی ارتکاز کے ساتھ علاج نے بھی LMP کی حوصلہ افزائی کی جسے NAC کے ذریعے تبدیل کیا جا سکتا ہے، جبکہ ULK1 کی کیمیائی روکنا LMP (ضمنی شکل 8C) کو متاثر نہیں کرتا ہے۔ اہم بات یہ ہے کہ siPPT1 کے دستک ڈاؤن میں LLP بھی شامل ہے جسے NAC (ضمنی شکل 8D) کے ساتھ تبدیل کیا جا سکتا ہے ان نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ PPT1 روکنا LLP کو آمادہ کرتا ہے جسے NAC کے ذریعے بچایا جا سکتا ہے اور یہ ممکنہ طور پر PPT1- کی روک تھام سے منسلک LMP کی وجہ ہے۔ مزید، ان نتائج نے تجویز کیا کہ ایل ایل پی لیزوسومل سیل کی موت کے لئے اہم ہے۔

چینی جڑی بوٹی سیستانچ پلانٹ - اینٹیٹیمر

ایم ایف ایس ڈی 12 کے ذریعہ لیزوزوم میں سیسٹین کی درآمد لائسوسومل سیل کی موت کو کم کرتی ہے۔ 3 لپڈ پیرو آکسیڈیشن روکنے والوں میں سے، صرف NAC نے LLP کو روکا۔ ایک حالیہ رپورٹ سے پتہ چلتا ہے کہ 12 (MFSD12) پر مشتمل بڑا سہولت کار سپر فیملی ڈومین لائسو سومز اور میلانوسومز (27) کے لیے سسٹین امپورٹر کا ایک لازمی جزو ہے۔ ہم نے استدلال کیا کہ NAC، یا اس کا میٹابولائٹ سسٹین، MFSD12 کے ذریعے لائوسووم میں منتقل کیا جاتا ہے، جہاں سسٹین اپنے ڈسلفائیڈ، سسٹین میں آکسائڈائز ہو جاتا ہے۔ اس مفروضے کو جانچنے کے لیے، ہم نے siNT اور siMFSD12 A375P-hGal3-EGFP خلیات میں DC661 سائٹوٹوکسیٹی کو بچانے کے لیے NAC کی صلاحیت کا موازنہ کیا۔ ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ NAC نے siNT سیلز میں DC661-کی حوصلہ افزائی LMP کو بچایا لیکن siMFSD12 سیلز میں LMP کو نہیں بچایا (شکل 6A)۔ NAC نے DC کے LLP کو کم کیا661-علاج شدہ siNT-A375P سیلز لیکن siMFSD12 سیل نہیں۔ DMSO یا NAC کے ساتھ علاج کیے گئے siMFSD12 خلیوں میں siNT خلیوں کے مقابلے بیسل LLP (شکل 6B) میں اضافہ ہوا ہے۔ جب کہ NAC نے siNT خلیات میں DC661 cytotoxicity کو بچایا، NAC کی DC661 cytotoxicity کو بچانے کی صلاحیت siMSFD12 خلیات (شکل 6C) میں مکمل طور پر منسوخ کر دی گئی۔ اس سے ظاہر ہوا کہ MFSD12 ناک ڈاؤن DC661 کے خلاف NAC کے cytoprotective اثرات کو روکتا ہے۔ NAC سائٹوسول (28) میں acylase کی طرف سے deacetylated ہے. اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا NAC کا علاج lysosomes کے اندر cysteine ​​یا cystine کا ذخیرہ پیدا کرتا ہے، ہم نے lysosomal immunoprecipitation (Lyso-IP) تکنیک (29) کو DMSO اور NAC سے علاج شدہ A375P خلیات (شکل 6D اور ضمنی Fig) سے پاک کرنے کے لیے استعمال کیا۔ NAC اور متعلقہ میٹابولائٹس کی مقدار درست کرنے کے لیے ہدف شدہ میٹابولومکس۔ جیسا کہ توقع کی گئی تھی، NAC کا پتہ NAC سے علاج شدہ پورے سیل lysate اور اس سے وابستہ انباؤنڈ فریکشنز میں پایا گیا تھا۔ NAC سے علاج شدہ لائزوزوم کے اندر L-cysteine ​​کی سطح میں کافی اضافہ ہوا تھا۔ L-cystine صرف NAC سے علاج شدہ lysosomes کے اندر ہی قابل شناخت تھا۔ حیرت انگیز طور پر، ہمیں NAC کے زیر علاج گروپس (شکل 6E) میں گلوٹاتھیون (کم ہوا) میں نمایاں اضافہ نہیں ملا۔ یہ حیران کن تھا کیونکہ عام طور پر یہ خیال کیا جاتا ہے کہ NAC علاج گلوٹاتھیون کی پیداوار میں اضافہ کرتا ہے، ریڈوکس توازن کو درست کرتا ہے۔ یہ نتائج بتاتے ہیں کہ ایم ایف ایس ڈی 12 امپورٹر کے ذریعے لائزوزوم میں درآمد کیا جانے والا سیسٹین ایل ایل پی، ایل ایم پی، اور لیسوسومل سیل کی موت کو بچانے کے لیے اہم ہے۔ ایل ایل پی امیونوجینک ہے۔ DC661 (pyroptosis، necroptosis، ferroptosis) کی وجہ سے ریگولیٹڈ سیل ڈیتھ کی کچھ شکلوں کی شناخت امیونوجینک کے طور پر کی گئی ہے۔ اس سے پہلے، خصوصیت کی بنیاد پر کیموتھریپی ادویات کے لیے امیونوجینک سیل کی موت بیان کی گئی ہے، جس میں نقصان سے وابستہ مالیکیولر پیٹرن کا ڈسپلے شامل ہے، بشمول CALR کا سیل سطح کا اظہار اور HMGB1 پروٹین اور اڈینوسین ٹرائی فاسفیٹ (ATP) (30) کی رہائی۔ CALR سیل کے تناؤ کے دوران سیل کی سطحوں کے سامنے آنے پر "eat-me" سگنل کے طور پر کام کرتا ہے۔ HMGB1 اور ATP کی ایکسٹرا سیلولر ریلیز ایک "فائنڈ می" سگنل کے طور پر کام کرتی ہے جسے فگوسائٹک سیلز کے ذریعے پہچانا جاتا ہے۔ ہم نے دو ماڈلز کا موازنہ کیا: B16F10 خلیات، جو کہ syngeneic ٹیومر ماڈلز میں ٹیومر میں دراندازی کرنے والے لیمفوسائٹس سے تقریباً مکمل طور پر خالی ہوتے ہیں، اور MC38 خلیات، جو syngeneic ٹیومر کے ماڈلز میں ٹیومر دراندازی لیمفوسائٹس ہوتے ہیں۔ سب سے پہلے، ہم نے یہ ظاہر کیا کہ DC661 یا siPpt1 کا علاج نمایاں طور پر سطحی CALR اظہار کی حوصلہ افزائی کرتا ہے جسے MC38 خلیوں میں NAC cotreatment کے ساتھ مکمل طور پر منسوخ کیا جا سکتا ہے (اعداد و شمار 7، A، اور B)۔ اسی طرح کے نتائج B16F10 خلیات (شکل 7C) میں دیکھے گئے۔ سیل کی موت کے بڑے راستوں (اپوپٹوسس، نیکروپٹوسس، فیروپٹوسس، اور پائروپٹوسس) کے روکنے والے CALR (شکل 7D) کی سطح کے اظہار کو روکنے میں ناکام رہے۔ اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا DC661 کے ذریعے پیدا ہونے والی امیونوجینک سیل کی موت MHC کلاس I کی اپ گریجولیشن کی وجہ سے ہے، B16F10 اور MC38 خلیوں کا 24 گھنٹے تک DC661 (3 μM) یا DMSO کے ساتھ علاج کیا گیا۔ ہم نے پایا کہ DC661 کے علاج سے MHC کلاس I اور امیونو پروٹیزوم اپ گریجولیشن (شکل 7E اور ضمنی شکل 9، B اور C) کے اظہار میں اضافہ نہیں ہوا۔

شکل 4۔ کیتھیپسن کی روک تھام یا کیلشیم کیلیشن ڈی سی661-کی حوصلہ افزائی سیل کی موت کو نہیں روکتی ہے۔ (ا)

T سیل پرائمنگ پر آٹوفجی انحبیشن کے اثرات کو سمجھنے کے لیے، ہم نے C57BL6/J splenocytes کا استعمال کرتے ہوئے وٹرو پرائمنگ اور کوکلچر تجربہ کیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے (31)۔ پرائمنگ کے لیے، ہم نے splenocytes کو DC661- یا DMSO سے علاج شدہ B16F10 یا MC38 سیلز سے بے نقاب کیا۔ اگلا، ان پرائمڈ اسپلینوسائٹس کو براہ راست B16F10 یا MC38 خلیوں کے ساتھ مہذب کیا گیا تھا، اور سائٹوٹوکسٹی کی پیمائش کی گئی تھی (شکل 8A)۔ DC661-علاج شدہ B16F10 خلیات کے ساتھ پرائمڈ Splenocytes نے IFN- میں DMSO سے علاج شدہ B16F10 خلیوں کے سامنے آنے والے splenocytes کے مقابلے میں نمایاں اضافہ کیا۔ DMSO-primed splenocytes (شکل 8، B اور C) کے مقابلے میں DC661-پرائمڈ اسپلینوسائٹس میں پرائمڈ ٹی سیل – پھیلنے والے B16F10 خلیوں کی ثالثی قتل میں نمایاں اضافہ ہوا تھا۔ DC661 کے ساتھ علاج کیے گئے MC38 خلیوں نے B16F10 خلیات (شکل 8، D، اور E) کے مقابلے میں اور بھی زیادہ IFN- اور پرائمڈ T سیل سائٹوٹوکسیٹی پیدا کی۔ DC661 کے ساتھ NAC cotreatment splenocytes اور blunt primed T سیل cytotoxicity (شکل 8، F، اور G) سے IFN کی رہائی کو مکمل طور پر منسوخ کرنے کے قابل تھا۔ MC38 سیلز (ضمنی شکل 9D) میں siCalr کے ذریعے کیلریٹیکولن کے دستک نے DC661 علاج کی بنیادی افادیت کو منسوخ کر دیا اور نمایاں طور پر پرائمڈ T-سیل سائٹوٹوکسیٹی (شکل 8، H، اور I) کو کم کر دیا۔ ایک ساتھ مل کر، یہ اعداد و شمار اینٹیٹیمر سیل ٹی سیل استثنیٰ کو فروغ دینے میں LLP سے وابستہ CALR اپ گریجولیشن کے میکانکی کردار کی حمایت کرتے ہیں۔ اگلا، ہم نے ان وٹرو فائنڈنگز کو ان ویوو اینٹیٹیمر ویکسینیشن اسٹڈی میں امیونوکمپیٹنٹ اور امیونوڈیفیشینٹ چوہوں کے ماڈلز تک بڑھا دیا۔ اس پرکھ کے لیے، ان وٹرو منجمد پگھلنے والے یا DC661-علاج شدہ B16F10 یا MC38 خلیوں کو بائیں جانب انجکشن لگایا گیا تاکہ مدافعتی صلاحیت C57BL/6 یا NOD/SCID چوہوں کو دوبارہ چیلنج سے بچایا جا سکے۔ 7 دن بعد دائیں طرف (شکل 9A)۔ DC661-علاج شدہ B16F10 خلیات وٹرو اسسیس کے باوجود ٹیومر کو مسترد ہونے سے روکنے میں ناکام رہے، یہ تجویز کرتا ہے کہ DC661 نے امیونوجینک سیل کی موت کو متاثر کیا (شکل 9B اور ضمنی شکل 9E)۔ اس کے برعکس، DC661-علاج شدہ MC38 سیلز کے ساتھ ایک فلانک کو ٹیکہ لگانے سے مخالف فلانک پر لگائے گئے لائیو MC38 سیلز کے مکمل رد کو فروغ دیا گیا (شکل 9C اور ضمنی شکل 9F)۔ اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا MC38 ٹیومر کے ساتھ DC661 ویکسین اثر کے لیے انکولی قوت مدافعت اہم تھی، ہم نے NOD/SCID چوہوں میں تجربہ دہرایا۔ حیرت انگیز طور پر، ہم نے پایا کہ DC661-علاج شدہ MC38 خلیوں نے مدافعتی NOD/SCID چوہوں (Figure 9D اور Supplemental Figure 9G) میں دوبارہ چیلنج ٹیومر کو مسترد نہیں کیا، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ مشاہدہ شدہ ویکسین کے اثر کے لیے انکولی قوت مدافعت کی ضرورت تھی۔ اس تلاش کی مضبوطی کو جانچنے کے لیے، ہم نے ایک اور معروف امیونوجینک ماؤس کینسر سیل لائن، CT26 کا انتخاب کیا، اور اوپر کی طرح ویکسینیشن کا تجربہ کیا۔ جیسا کہ توقع کی گئی تھی، ماؤس کے ایک کنارے میں DC661-علاج شدہ CT26 خلیوں کی امپلانٹیشن نے ایک ویکسین جیسا اثر پیدا کیا اور دوسرے کنارے پر لگائے گئے لائیو CT26 خلیوں کے بڑھنے کو روکا (شکل 9E اور ضمنی شکل 9H)۔ ہماری دریافتوں نے تجویز کیا کہ DC661-حوصلہ افزائی LLP LMP کی ثالثی امیونوجینک سیل کی موت کے لئے اہم ہے، جو lysosomal ٹرانسپورٹر MFSD12 (Figure 9F) کے ذریعہ cysteine ​​کی lysosome میں درآمد سے الٹ جاتا ہے۔

بحث

Lysosomal روکنا preclinical مطالعہ میں ایک امید افزا علاج کا طریقہ معلوم ہوتا ہے، اور HCQ کلینیکل ٹرائلز نے حوصلہ افزا لیکن ملے جلے نتائج پیدا کیے ہیں (1، 32)۔ PPT1 HCQ کا سالماتی ہدف ہے، اور زیادہ طاقتور PPT1 روکنے والے، جیسے DC661 (2) اور GNS561 (3)، وٹرو میں LMP کی ثالثی سیل کی موت کو آمادہ کرتے ہیں۔ لیسوسومل سیل کی موت کا صحیح طریقہ کار اور ٹیومر امیونوجنیسیٹی میں اس کے کردار کو پوری طرح سے واضح نہیں کیا گیا ہے۔ اینٹی ٹیومر استثنیٰ کو بڑھایا جاتا ہے جب آٹوفجی روکنا کو امیونو تھراپی کے ساتھ ملایا جاتا ہے (9, 10, 31)۔ آٹوفجی کی روک تھام کے بعد سیل کے اندرونی امیونوجنیسیٹی کے مجوزہ طریقہ کار میں MHC کلاس I اور امیونوپروٹیزوم اپ گریجولیشن شامل ہیں، جو دونوں بہتر اینٹیجن پروسیسنگ اور پریزنٹیشن کی حمایت کرتے ہیں۔ اس کے علاوہ، ڈینڈریٹک خلیات میں MHC کلاس I کی سطح کی سطح کو بڑھا کر کلوروکوئن اگمنٹڈ CD8+ T سیل کے ردعمل کے ذریعے آٹوفجی پروٹین کا نقصان یا آٹوفجی روکنا (33)۔ ہم نے پہلے دکھایا تھا کہ سیسٹیمیٹک PPT1 روکنا M2 سے M1 فینوٹائپ تک میکروفیج کو دوبارہ پولرائز کرسکتا ہے۔ پی پی ٹی 1 روکنے والے STING کی سطح کو بڑھا سکتے ہیں، جس کے نتیجے میں IFN کی رہائی اور T سیل کی ثالثی کی وجہ سے میلانوما ماڈلز میں قتل (31) ہوتا ہے۔ یہاں، ہم نے یہ ظاہر کیا کہ ایل ایل پی خود ایک ٹیومر سیل پیدا کرتا ہے – سیل کی موت کی اندرونی امیونوجینک شکل۔ ہم نے پایا کہ لیسوسومل روکنا کینسر کے خلیوں میں بہت کم پروٹین کی تبدیلیوں کی حوصلہ افزائی کرتا ہے، اور سب سے نمایاں طور پر بلند پروٹینوں میں آٹوفجی کارگو ریسیپٹرز اور اپوپٹوس ریگولیٹرز شامل ہیں۔ افعال میں ان میں سے کچھ جینوں کو نشانہ بنانے والے ہمارے نقطہ نظر نے یہ ظاہر کیا کہ منشیات سے متاثرہ پروٹین ممکنہ طور پر سیل کی موت کے اہم ریگولیٹرز نہیں تھے۔ ULK1 یا ATG7 کی جینیاتی روک تھام نے بھی DC661 cytotoxicity کو نہیں بچایا۔ ہم نے یہ ظاہر کیا کہ لائسوسومل روکنا پروگرام شدہ سیل کی موت کی متعدد شکلوں کو متحرک کرتا ہے ، بشمول اپوپٹوس ، نیکروپٹوسس ، فیروپٹوسس اور پائروپٹوسس ، لیکن ان میں سے ہر ایک منشیات کی حوصلہ افزائی سائٹوٹوکسائٹی کے لئے قابل استعمال تھا۔ قابل ذکر بات یہ ہے کہ پروگرام شدہ سیل ڈیتھ میکانزم اوورلیپ ہو سکتے ہیں اور متعدد سیل ڈیتھ میکانزم کی کوٹارگٹنگ لائسوسومل میمبرین پارمیبلائزیشن کے بعد سیل ڈیتھ کے خلاف سائٹو پروٹیکشن فراہم کر سکتی ہے۔ ہمارے کام نے لیوسوومل سیل کی موت کے لئے کیتھیپسن اور کیلشیم پر منحصر میکانزم کو مسترد کردیا ہے اور سیل کی موت کے اہم عامل کے طور پر ایل ایل پی کی اہمیت کو اجاگر کیا ہے۔ ہمیں ایل ایل پی کے ایسے شواہد ملے جو ایک اینٹی آکسیڈینٹ کے ذریعے الٹنے کے قابل تھا جسے لائسوسم، این اے سی میں منتقل کیا گیا تھا اور یہ لائسوسومل میمبرین پارمیبلائزیشن اور سائٹوٹوکسٹی کے لیے اہم تھا۔ NAC واحد ایجنٹ تھا جو DC661-کی حوصلہ افزائی سیل کی موت کو کم کرنے یا ریورس کرنے کے قابل تھا، اور یہ صلاحیت لیسوسومل سیسٹین ٹرانسپورٹر MFSD12 کی موجودگی پر منحصر تھی۔ lysosomal دخول کی کمی کا امکان ہے کہ دوسرے پوٹیٹیو لپڈ پیرو آکسائڈریشن روکنے والے، Trolox اور وٹامن C، DC661 cytotoxicity کو روکنے میں ناکام رہے۔ NAC کو سسٹین میں تبدیل کیا جاتا ہے، جو لائوسومز میں درآمد کیا جاتا ہے اور اس کی ڈسلفائیڈ شکل، سسٹین میں آکسائڈائز ہوتا ہے۔ سیسٹین کو ایک اور لائسوسومل ٹرانسپورٹر، cystinosis کے ذریعہ cytosol میں برآمد کیا جاتا ہے، جہاں اسے cysteine ​​تک کم کیا جاتا ہے جو اندرونی غذائیت کے ذرائع کو دوبارہ متحرک کرتا ہے، rapamycin کمپلیکس 1 کے ہدف کو دوبارہ متحرک کرتا ہے، اور آٹوفجی (34) کو فروغ دیتا ہے۔ سسٹین سے سسٹین (لائسوزوم) اور بیک ٹو سسٹین (سائٹوسول) کی یہ آکسیڈیشن کم کرنے والی سائیکلنگ DC661 سائٹوٹوکسیٹی یا دیگر بیماریوں کے سیاق و سباق میں زیادہ عام لائسوسومل چوٹ کے خلاف NAC کا ممکنہ ریسکیو میکانزم ہو سکتا ہے جہاں NAC علاج کے لحاظ سے مفید ثابت ہوا ہے (35) . NAC نے نہ صرف DC661-حوصلہ افزائی LLP اور LMP کو تبدیل کیا بلکہ امیونوجینک سیل ڈیتھ مارکر کیلریٹیکولن کا سطحی اظہار بھی۔ CALR پروٹین کا سیل سطح کا اظہار DC661-پرائمڈ اسپلینوسائٹس کے ذریعہ حوصلہ افزائی شدہ T سیل – ثالثی سائٹوٹوکسائٹی کے لئے ضروری تھا، یہ ظاہر کرتا ہے کہ lysosomal inhibition سیل کے اندرونی امیونوجنیسیٹی کی ایک مخصوص شکل پیدا کرتا ہے۔

اگرچہ پچھلے مطالعات نے یہ ثابت کیا ہے کہ لائسوسومل روکنا قائم فلانک ٹیومر (9، 31) میں مدافعتی چیک پوائنٹ کی روک تھام کی اینٹی ٹیومر سرگرمی کو بڑھا سکتا ہے، ہمارا مطالعہ ہمارے علم میں پہلا ہے جس نے MC38 ٹیومر کے لئے ویکسین جیسا اثر ظاہر کیا ہے لیکن B16 ٹیومر میں نہیں۔ امپلانٹیشن سے پہلے ٹیومر کے خلیات DC661 کے ساتھ پہلے سے علاج کیے گئے تھے۔ اس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ لیسوسومل سیل کی موت سیل کے اندرونی امیونوجنیسیٹی کو آمادہ کر سکتی ہے، لیکن یہ تبدیلیاں بذات خود ایک "امیون سرد" ٹیومر مائکرو ماحولیات کو "امیون گرم" ٹیومر مائیکرو ماحولیات میں تبدیل کرنے کے لیے کافی نہیں ہیں۔ "امیون کولڈ" ٹیومر مائیکرو ماحولیات ماڈلز B16 اور BRafCA PtenloxP Tyr: CreERT2 جینیاتی طور پر انجنیئرڈ ماؤس ماڈلز (31) میں ہمارے پچھلے مطالعات نے یہ ظاہر کیا کہ سیسٹیمیٹک lysosomal inhibition نے ٹیومر سے وابستہ میکروفیجز اور myeloid cell - پر اثر پیدا کیا ہے جو کہ سیلز کے لیے مائیلائڈ سیل پر اثر ڈالتے ہیں۔ امیونو تھراپی کی افادیت یہ معاملہ ہو سکتا ہے کہ ان مدافعتی کولڈ ٹیومر میں سیل کی اندرونی امیونوجنیسیٹی بھی ایک کردار ادا کرتی ہے جو لائسوسومل انحبیشن کے بعد آئی سی ڈی کے لیے زیادہ جوابدہ ہو جاتے ہیں۔ کنٹرول شدہ لیبارٹری کے ماحول میں مشاہدہ کیا گیا لائسوسومل انحبیشن کا ویکسین جیسا اثر کلینک میں ترجمہ کر سکتا ہے یا نہیں، لیکن یہ وضاحت کر سکتا ہے کہ ڈیبرافینیب، ٹرامیٹینیب، اور ایچ سی کیو کے ساتھ علاج کیے جانے والے کچھ مریضوں کا پہلے علاج شدہ BRAF میوٹینٹ میلانوما میں اتنا گہرا اور پائیدار کیوں تھا۔ اس طرز عمل کا جواب (32)۔ یہ سمجھنے کے لیے مزید مطالعہ کی ضرورت ہے کہ کس طرح PPT1 روکنا lysosomal ROS اور lipid peroxidation پیدا کرتا ہے۔ PPT1-V-ATPase اور lysosomal acidification کا منحصر ضابطہ کافی وضاحت نہیں ہے کیونکہ bafilomycin lysosomal acidification کو روکتا ہے لیکن LMP پیدا نہیں کرتا (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا)۔ ان نتائج کے مضمرات یہ بتاتے ہیں کہ ٹیومر سیل – اندرونی امیونوجنیسیٹی کو بڑھانے والے لیسوسومل انابیٹرز کو عقلی طور پر علاج کے ساتھ ملایا جا سکتا ہے جو ٹی سیل ایکٹیویشن، یا ٹیومر مائیکرو ماحولیات میں دراندازی کو بڑھاتے ہیں، ممکنہ طور پر ہم آہنگی کے اثرات پیدا کرتے ہیں۔

شکل 5. N-acetyl cysteine ​​DC661-کی حوصلہ افزائی سیل کی موت کو روکتا ہے۔ (ا)

طریقے

سیل کلچر۔ انسانی A375P (CRL-3224)، RKO (CRL-2577)، DLD-1 (CCL- 221)، MIA PaCa-2 (CRL-1420 )، A549 (CRM-CCL-185)، اور ماؤس B16F10 (CRL-6475) سیل لائنیں ATCC سے خریدی گئیں۔ انسانی A375 (CRL-1619، ATCC)، WM35، WM793، اور ماؤس YUMM1.7 (WT, Gsdme EV، اور Gsdme KO1 اور KO2) لائنیں اندرون ملک حاصل کی گئیں۔ ماؤس MC38 اور CT26 سیل اینڈی من، یونیورسٹی آف پنسلوانیا نے فراہم کیے تھے۔ FL5.12 اور IL-3–انحصار Bax−/−Bak−/− (Bax/Bak DKO) بنیادی بون میرو سیلز کیتھرین ای ویلن، یونیورسٹی آف پنسلوانیا سے حاصل کیے گئے تھے۔ انسانی Panc-1 (CRL-1469, ATCC) سیل لائن بین Z. Stanger، یونیورسٹی آف پنسلوانیا نے فراہم کی تھی۔ ماؤس YUMMER 1.7 سیل لائن Xiaowei (Jeorge) Xu، یونیورسٹی آف پنسلوانیا سے حاصل کی گئی تھی۔ تمام سیل لائنوں کا مائکوپلاسما کے لیے سالانہ طور پر یونیورسٹی آف پنسلوانیا کور سہولیات کے ذریعے تجربہ کیا گیا اور وِسٹار انسٹی ٹیوٹ جینومکس کور کے ذریعے شارٹ ٹینڈم ریپیٹ فنگر پرنٹنگ کا استعمال کرتے ہوئے تصدیق کی گئی۔ A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12, اور Bax/ Bak DKO سیل لائنوں کو RPMI 1640 (انویٹروجن، 11875) میں کلچر کیا گیا تھا۔ A375، MIA PaCa-2، Panc-1، B16F10، اور MC38 سیل لائنوں کو DMEM (انویٹروجن، 11995) میں کلچر کیا گیا تھا۔ اور YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV، اور Gsdme KO1 اور KO2) خلیات (15) کو DMEM/F12 50/50 (کارننگ، 10-092-CV) میں کلچر کیا گیا تھا۔ کلچر میڈیا کو 10 فیصد فیٹل بوائن سیرم (12306C، ملی پور سگما) اور 1× اینٹی بائیوٹک اینٹی مائکوٹک حل (گبکو، 15140-122) کے ساتھ پورا کیا گیا تھا۔ FL5.12 اور Bax/Bak DKO سیل لائنوں کو 50 μM -mercaptoethanol (Life Technologies, 21985-023)، 10 mM HEPES (H3537, MilliporSigma)، اور 0.35 ng/mng اور 0.35 ng/mng کے ساتھ مکمل RPMI میڈیا میں برقرار رکھا گیا تھا۔ /mL IL-3، بالترتیب۔ YUMMER1.7 اور YUMM1.7 (WT, Gsdme EV، اور Gsdme KO) سیل لائنوں کو 1× MEM NEAA (Gibco, 11140-050) کے ساتھ مکمل میڈیا میں برقرار رکھا گیا تھا۔ WM35 اور WM793 خلیوں کو MCDB میڈیا 153 (MilliporSigma, M7403) میں کلچر کیا گیا تھا، جس میں 1× Leibovitz L-15 میڈیم (کارننگ، 10-045-CV) میں 10% FBS، 7.5% w/v سوڈیم بائی کاربونیٹ ( کارننگ، 25-035-CI)، 1× اینٹی بائیوٹک antimycotic محلول (Gibco, 15140-122)، اور 5 ug/mL انسولین (MilliporSigma, I0516)۔ خلیات 5% CO2 کی موجودگی میں 37 ڈگری پر بڑھے تھے۔ کیمیکل اور ری ایجنٹس۔ خریدے گئے کیمیکلز میں HCQ سلفیٹ (سپیکٹرم کیمیکل، 747-36-4) اور DC661 (Selleckchem, S8808) شامل ہیں۔ Fluo-4, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) کا استعمال کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق کیلشیم کے لیے خلیات پر داغ لگانے کے لیے کیا گیا تھا۔ اینٹی باڈیز اور روکنے والوں کی فہرست ضمنی جدول 1 اور ضمنی جدول 2 میں فراہم کی گئی ہے۔

شکل 6. NAC LLP کو MFSD12-منحصر انداز میں ریورس کرتا ہے۔ (A-C)

مائع کرومیٹوگرافی کے لیے پروٹین کا اخراج اور عمل انہضام – پروٹومکس کے لیے ٹینڈم ماس اسپیکٹومیٹری تجزیہ۔ {{0}}.7 × 106 A375P میلانوما سیلز 60 ملی میٹر کلچر ڈشز میں کلچر کیے گئے تھے۔ خلیوں کا علاج DMSO (کنٹرول)، DC661 (3 μM)، HCQ (10 μM)، یا HCQ (3{{70} μM) کے ساتھ 24 گھنٹے تک تقریباً 5{{ پر کیا گیا تھا۔ 112}% سنگم۔ منجمد سیل چھروں کو 50 mM Tris pH 7.4، 1% SDS، 150 mM NaCl، 1 mM EDTA، 0.15 mM PMSF، 1 ug/mL pepstatin، اور 1 ug/mL لیوپیپٹن۔ واضح شدہ لائسیٹس (1 ہر 0.5 سینٹی میٹر جیل لین کو ٹریس (2-carboxyethyl) فاسفائن کے ساتھ کم کیا گیا، کم کیا گیا، iodoacetamide کے ساتھ الکائیلیٹڈ، اور ٹرپسن کے ساتھ ہضم کیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے (36)۔ ڈائجسٹ (1 ug) کا تجزیہ مائع کرومیٹوگرافی – ٹینڈم ماس اسپیکٹومیٹری (LC-MS/MS) کے ذریعہ Q-Exactive Plus ماس اسپیکٹومیٹر (تھرمو فشر سائنٹیفک) پر ایک nanoAQUITY UPLC (واٹرس) کے ساتھ کیا گیا۔ تجزیاتی علیحدگی 1.7 μm × 250 mm Peptide BEH C18 کالم (Waters, 186003546) پر پانی میں 0.1% فارمک ایسڈ (موبائل فیز A) اور acetonitrile (بطور موبائل فیز B) کے ساتھ 245- منٹ گریڈینٹ کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا تھا۔ : 225 منٹ پر 5%–30% B، 5 منٹ پر 30%–80% B، 15-منٹ 80% B پر ہولڈ، اور ابتدائی حالات پر واپس جائیں۔ مکمل ایم ایس سپیکٹرا 70،000 ریزولوشن پر حاصل کیا گیا، اسکین رینج 400–2،000 m/z، 3 × 106 آئنوں کا ایک خودکار گین کنٹرول ہدف، اور زیادہ سے زیادہ انجیکشن ٹائم 50 ملی سیکنڈ۔ ڈیٹا پر منحصر MS2 سپیکٹرا 17,500 ریزولیوشن میں ٹاپ 20 سب سے زیادہ پرچر آئنوں کے لیے حاصل کیا گیا تھا، جس کی الگ تھلگ چوڑائی 1.5 m/z، 5 × 104 آئنوں کا خودکار گین کنٹرول ہدف، اور زیادہ سے زیادہ انجیکشن ٹائم 50 ملی سیکنڈز تھا۔ پیپٹائڈ میچ کو ترجیحی پر سیٹ کیا گیا تھا، اور غیر تفویض شدہ اور اکیلے چارج شدہ آئنوں کو مسترد کر دیا گیا تھا (37)۔ خام MS ڈیٹا کا تجزیہ MaxQuant 1.6.5.0 (https://maxquant.net/perseus/) کے ساتھ یونی پروٹ ہیومن سیکوینس ڈیٹا بیس (10 اکتوبر 2019 کو حاصل کیا گیا) اور ایک عام آلودہ ڈیٹا بیس کے ساتھ کیا گیا، بشمول ٹرپسن، کیراٹین، بوائین پروٹین، اور مائکوپلاسما (38)۔ زیادہ سے زیادہ 2 مس شدہ کلیویجز کے ساتھ ٹریپٹک پیپٹائڈ کی خصوصیت، سسٹین پر فکسڈ ترمیم (کاربامیڈومیتھیلیشن)، اور متغیر میتھیونین آکسیڈیشن یا این ٹرمینل ایسٹیلیشن کو تلاش میں استعمال کیا گیا (39)۔ پیپٹائڈس اور پروٹین کے لیے 1% FDR کا کٹ آف استعمال کیا گیا تھا۔ رنز کے درمیان میچ کو فعال کیا گیا تھا۔ لیبل فری مقدار (40) کا استعمال کرتے ہوئے پروٹین کی مقدار درست کی گئی۔ پرسیئس 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41، 42) کا استعمال کرتے ہوئے شماریاتی تجزیہ کیا گیا۔ پروٹین کو کم از کم 3 منفرد پیپٹائڈس کے ذریعہ شناخت کرنے کی ضرورت تھی اور نمونے کے گروپ میں 3 درست قدریں (غیر صفر مقدار) ہوں، اور ڈیٹا سیٹ سے آلودگی اور ریورس پروٹین کو فلٹر کیا گیا تھا۔ گمشدہ اقدار کو عام تقسیم سے لگایا گیا تھا۔ حالات کے درمیان جوڑے کے لحاظ سے موازنہ پروٹین کی سطح پر s0=0.1 اور 250 رینڈمائزیشن کے ساتھ ترتیب پر مبنی FDR کے ساتھ ایک 2-ٹیلڈ اسٹوڈنٹ کے ٹی ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ نمایاں تبدیلیوں کی تعریف 5% سے کم کی FDR اور 1.5 یا 2.0 سے زیادہ کی مطلق تبدیلی، جیسا کہ بیان کیا گیا ہے۔ Lyso-IP۔ A375P خلیات pLJC5-Tmem192-3xHA lentivirus سے متاثر ہوئے تھے اور 1 mg/mL puromycin (MilliporeSigma, P4512) کا استعمال کرتے ہوئے منتخب کیے گئے تھے۔ تقریباً 3 × 106 HA- ٹیگ والے A375P خلیوں کا علاج 10 mM NAC یا واٹر وہیکل کنٹرول کے ساتھ 24 گھنٹے تک کلچر کے حالات میں پہلے بیان کیا گیا تھا۔ علاج کے بعد، خلیات کو پی بی ایس میں دھویا گیا، 0.5 ملی لیٹر کولڈ کے پی بی ایس میں کاٹا گیا، اور 2 ملی لیٹر ڈاؤنس ہوموجنائزر میں 20 اسٹروک کا استعمال کرتے ہوئے آہستہ سے ہم آہنگ کیا گیا۔ ہوموجنیٹ کا تقریباً 2.5% پورے خلیے کے لیسیٹ کے تجزیہ کے لیے مختص کیا گیا تھا، اور بقیہ کو سیل کی جھلی کے ملبے کو ہٹانے کے لیے 4 ڈگری پر 2 منٹ کے لیے 3،{120}g پر سینٹرفیوج کیا گیا تھا۔ ہوموجنیٹ سپرنٹنٹ کو پھر ایک صاف 1.5 ملی لیٹر ٹیوب میں منتقل کیا گیا اور 50 μL اینٹی HA موتیوں (پیئرس، 88836) یا اینٹی ڈی ڈی کے/فلیگ موتیوں (اوریجین، ٹی اے 150042) کے ساتھ 4 ڈگری پر 15 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ اس کے بعد نمونوں کو ڈائنا میگ (تھرمو فشر سائنٹیفک، 12321D) پر ٹیوبیں لگا کر تیار کیا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 2 منٹ تک ہلکے سے ہلایا گیا۔ سپرنٹنٹ کو غیر باؤنڈ فریکشن تجزیہ کے لیے مخصوص کیا گیا تھا۔ IP کو 3 بار KPBS کے ساتھ دھویا گیا جس میں 8 mM CaCl2 ہے۔ میٹابولومکس تجزیہ کے لیے Lyso-IP کو 80% MeOH میں نکالا گیا تھا۔ گلوبل لپڈوم کے لیے LC-MS/MS کا استعمال کرتے ہوئے لپڈ نکالنا اور تجزیہ کرنا۔ میلانوما A375P خلیوں کو 60 ملی میٹر ڈشوں میں 0.7 × 106 سیل فی ڈش میں سیڈ کیا گیا تھا۔ جب خلیے تقریباً 50% سنگم پر تھے، تو ان کا علاج DMSO (کنٹرول)، DC661 (3 μM) یا HCQ (30 μM) سے 24 گھنٹے تک کیا جاتا تھا۔ سیلز کو HBSS کے ساتھ 2 بار دھویا گیا، آئس کولڈ میتھانول میں کھرچ دیا گیا، اور کلوروفارم/میتھانول/0.88% NaCl (2:1:1) کے ساتھ لپڈ نکالنے کے لیے شیشے کی ٹیوبوں میں منتقل کیا گیا جس میں EquiSPLASH اندرونی لپڈ اسٹینڈرڈ (Avanti Polar Lipids) تھا۔ نمونوں کو گھمایا گیا اور پھر برف پر 5 منٹ کے لئے پانی سے غسل کیا گیا۔ 40 ڈگری پر 15 منٹ کے لیے 500 گرام پر سینٹرفیوگریشن کے بعد، نچلے حصے کو شیشے کی دوسری ٹیوب میں منتقل کر دیا گیا۔ اوپری مرحلے کو مصنوعی نچلے مرحلے کا استعمال کرتے ہوئے دوبارہ نکالا گیا تھا۔ سونیکیشن اور سینٹرفیوگریشن کے بعد، نچلے مرحلے کو پہلے نچلے مرحلے کے مجموعہ کے ساتھ ملایا گیا تھا۔ نمونوں کو نائٹروجن کے نیچے خشک کیا گیا، 10% کلوروفارم/90% میتھانول میں دوبارہ معطل کیا گیا، اور شیشے کی LTQ شیشیوں میں منتقل کر دیا گیا۔ لپڈ کے نمونوں کا تجزیہ تھرمو فشر سائنٹیفک QExactive HF-X ماس سپیکٹرومیٹر اور وینکویش ہورائزن UHPLC سسٹم پر کیا گیا۔ تجزیاتی علیحدگی میں 50:50 acetonitrile/water اور 88:10:2 isopropanol/acetonitrile/water کے ساتھ Accucore C30 کالم (2.1 mm × 150 mm، Thermo Fisher Scientific) استعمال کیا گیا، ہر ایک میں 5 mM امونیم اور %1 امونیم فارمیٹ ہوتا ہے۔ LC-MS/MS ڈیٹا کو مندرجہ ذیل آلے کے پیرامیٹرز کے ساتھ مثبت اور منفی قطبین میں الگ الگ حاصل کیا گیا تھا: MS1 اسکین 120،000 ریزولوشن؛ ڈیٹا پر منحصر MS2 15،000 ریزولوشن پر سرفہرست 20 سب سے زیادہ وافر آئنوں پر؛ 0.4 m/z تنہائی کی چوڑائی؛ اور 20:30:40 (43) کی ایک مرحلہ وار نارمل ٹکراؤ توانائی۔

شکل 7. N-acetyl cysteine ​​DC661-کیلریٹیکولن سطح کے اظہار کو روکتا ہے۔ (A-D)

LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific) کا استعمال کرتے ہوئے Lipids کی شناخت اور مقدار کا تعین کیا گیا۔ شناخت شدہ لپڈ پرجاتیوں کو کلاس کی بنیاد پر متوقع عادی اور شناختی گریڈ کے ذریعہ فلٹر کیا گیا تھا۔ چوٹی کے علاقوں کو معاون کلاسوں کے لیے EquiSPLASH معیارات کے مطابق معمول بنایا گیا تھا اور سیل نمبر میں تغیر کے لیے درست کرنے کے لیے ہر نمونے کے کل رقبے کی بنیاد پر مزید نارمل کیا گیا تھا۔ پرسیئس 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42) کا استعمال کرتے ہوئے لاگ ٹرانسفارمڈ ڈیٹا پر شماریاتی تجزیہ کیا گیا۔ میٹابولون کے لیے LC-MS/MS کا استعمال کرتے ہوئے میٹابولائٹ نکالنا اور تجزیہ۔ پولر میٹابولائٹس کو 80% میتھانول کا استعمال کرتے ہوئے پورے خلیوں، Lyso-IP ان باؤنڈ فریکشنز، اور Lyso-IP پابند نمونوں سے نکالا گیا تھا اور مائع کرومیٹوگرافی سے پہلے –8{{30}} ڈگری پر محفوظ کیا گیا تھا۔ ماس سپیکٹرو میٹری (LC-MS) تجزیہ۔ اقتباسات کا تجزیہ LC-MS نے تھرمو سائنٹیفک Q-Exactive HF-X ماس سپیکٹرومیٹر کا استعمال کرتے ہوئے HESI II پروب کے ساتھ تھرمو وینکویش ہورائزن UHPLC سسٹم کے ساتھ کیا تھا۔ LC علیحدگی ZIC-HILIC کالم (2.1 mm × 150 mm، 5 μm پارٹیکل سائز، EMD ملی پور) کے ساتھ ZIC-HILIC گارڈ کالم (2.1 mm × 20 mm، EMD ملی پور) کے ساتھ 45 ڈگری پر بہاؤ کی شرح کے ساتھ کی گئی تھی۔ 0.2 ملی لیٹر فی منٹ۔ کرومیٹوگرافی تیزابی حالات میں تھیول گروپس کی رد عمل کو کم کرنے کے لیے کی گئی تھی۔ موبائل فیز A پانی تھا اور B acetonitrile تھا، دونوں میں 0.1% فارمک ایسڈ تھا۔ LC گریڈینٹ 2 منٹ کے لیے 85% B، 15 منٹ کے دوران 85% B سے 20% B، 0.1 منٹ کے دوران 20% B سے 85% B، اور 8.9 منٹ کے لیے 85% B تھا۔ آٹو سیمپلر کو 4 ڈگری پر رکھا گیا تھا، اور ہر نمونے کا 4 μL فی تجزیہ لگایا گیا تھا۔ درج ذیل MS پیرامیٹرز استعمال کیے گئے: میان گیس کے بہاؤ کی شرح، 40 AU؛ معاون گیس کے بہاؤ کی شرح، 10 AU؛ جھاڑو گیس کے بہاؤ کی شرح، 2 AU؛ معاون گیس ہیٹر درجہ حرارت، 350 ڈگری؛ سپرے وولٹیج، مثبت موڈ کے لیے 3.75 kV اور منفی موڈ کے لیے 3.5 kV؛ کیپلیری درجہ حرارت، 375 ڈگری؛ اور فنل آر ایف لیول، 40%۔ تمام نمونوں کا تجزیہ پولرٹی سوئچنگ کے ساتھ مکمل MS کے ذریعے کیا گیا۔ مکمل MS اسکینز 65 سے 975 m/z تک 120،000 ریزولیوشن میں 1 × 106 آئنوں کے خودکار گین کنٹرول ہدف اور 100 ملی سیکنڈ کے زیادہ سے زیادہ انجیکشن ٹائم کے ساتھ حاصل کیے گئے۔ ٹریس فائنڈر 4.1 (تھرمو فشر سائنٹیفک) کا استعمال کرتے ہوئے خام ڈیٹا کا تجزیہ کیا گیا۔ ہدف شدہ میٹابولائٹس کی شناخت تجزیاتی معیارات کی بنیاد پر ان کی ترجیحی قطبیت میں درست ماس ​​اور برقرار رکھنے کے وقت سے کی گئی۔ چوٹی کا پتہ لگانے میں ICIS الگورتھم کو 1 کی ہموار کرنے کے ساتھ استعمال کیا گیا۔ ایک مربوط چوٹی کے علاقے کا استعمال کرتے ہوئے رشتہ دار مقدار کا تعین کیا گیا، اور ان اقدار کو فی نمونہ کی کل رقم (کل چوٹی کے علاقے کے طور پر بیان کیا گیا) میں درست کیا گیا۔ PPT1-CRISPR/Cas9 ترمیم۔ A375P PPT1-غیر ہدف اور KO سیل تیار کیے گئے تھے جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا (44)۔ pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) Feng Zhang (Addgene plasmid, 48139) کی طرف سے ایک تحفہ تھا۔ گائیڈ آر این اے اولیگوس (IDT) کو اینیل کیا گیا، فاسفوریلیٹ کیا گیا، اور پھر BbsI ہضم شدہ اور dephosphorylated pX459 پلاسمڈ میں ژانگ لیب پروٹوکول کے بعد جو کہ ایڈجین کے ذریعے دستیاب ہے۔ Ligated plasmids Stbl3 خلیات (انویٹروجن) میں تبدیل ہو گئے تھے۔ پلازمیڈ پریپس کی ترتیب نے مطلوبہ گائیڈ آر این اے کی ترتیب کی موجودگی کی تصدیق کی۔ A375P خلیات کو Lipofectamine 3000 (Invitrogen, L3000015) کا استعمال کرتے ہوئے منتقل کیا گیا، جس کے بعد puromycin کا ​​انتخاب ہوا۔ سرویئر اسسز نے CRISPR/Cas9 کے ذریعے PPT1 جین میں ترمیم کی تصدیق کی، اور PPT1 ناک ڈاؤن کی تصدیق PPT1 اینٹی باڈی (Origene) کے ساتھ ویسٹرن بلوٹنگ سے ہوئی۔ گائیڈ RNA oligos کے سلسلے درج ذیل ہیں: نان ٹارگٹ گائیڈ RNA فارورڈ (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT)، نان ٹارگٹ گائیڈ RNA ریورس (AAACACGCCGGACGACGTTCGCTAC)، ہیومن PPT1 گائیڈ RNA 1 فارورڈ (CACCGTTTTGGACTCCGATGCTGTCGCAAAReverse گائیڈ) انسانی PPT1 گائیڈ RNA 3 فارورڈ (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC)، اور انسانی PPT1 گائیڈ RNA 3 ریورس (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC)۔ اس مقالے میں استعمال ہونے والے واحد خلیات سے اگائے گئے کلون میں درج ذیل شامل ہیں: کلون C8 انسانی رہنما 1 ہے اور کلون B5 انسانی رہنما ہے 3۔ Immunoblotting۔ 10 سینٹی میٹر ڈش میں 10 لاکھ سیل چڑھائے گئے، اور اگلے دن علاج دیا گیا۔ خلیات کو سکریپنگ کے ذریعے جمع کیا گیا تھا۔ ایس ڈی ایس لیسس بفر کا استعمال کرتے ہوئے پورے سیل لائسیٹس تیار کیے گئے تھے۔ پیئرس بی سی اے پروٹین آسے کٹ (تھرمو فشر سائنٹیفک، 23225) کا استعمال کرتے ہوئے پروٹین کی حراستی کی پیمائش کی گئی۔ 30-50 ug پروٹین SDS-PAGE کے لئے استعمال کیا گیا تھا اور اسے PVDF جھلی (Bio-Rad، 1620177) میں منتقل کیا گیا تھا۔ اس جھلی کو 5% BSA یا 5% سکمڈ دودھ کا استعمال کرتے ہوئے، موزوں حالات کے مطابق بلاک کیا گیا تھا، اور 4 ڈگری پر راتوں رات پرائمری اینٹی باڈی کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ PVDF جھلیوں کو 1× TBS-T (Cell Signaling Technology Inc., CS-9997) سے دھویا گیا اور 1 گھنٹے کے لیے کمرے کے درجہ حرارت پر پرجاتیوں کے لیے مخصوص HRP-conjugated سیکنڈری اینٹی باڈی کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔ جھلیوں کو بعد میں پیئرس ای سی ایل ویسٹرن بلاٹنگ سبسٹریٹ (تھرمو فشر سائنٹیفک، 32106) اور آٹوراڈیوگرافی فلموں (لیب سائنٹیفک انکارپوریشن، XAR ALF 1318) کا استعمال کرتے ہوئے دھویا اور تیار کیا گیا۔ پائروپٹوسس اسٹڈیز کے لیے، پروٹین لائسیٹس کو SDS-PAGE کے ذریعے الگ کیا گیا تھا اور PVDF جھلیوں میں منتقل کیا گیا تھا۔ 5% BSA میں بلاک کرنے کے بعد، PVDF جھلیوں کو راتوں رات 4 ڈگری پر اشارے شدہ بنیادی اینٹی باڈیز کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا، PBS/Tween میں دھویا گیا، اور پیرو آکسیڈیس کپلڈ سیکنڈری اینٹی باڈیز کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔ HRP-conjugated سیکنڈری اینٹی باڈیز (CalBioTech)، ایک کیمیلومینیسینس سبسٹریٹ (تھرمو فشر سائنٹیفک)، اور ایک ChemicDoc MP امیجنگ سسٹم (Bio-Rad) کا استعمال کرتے ہوئے مدافعتی سرگرمی کا پتہ چلا۔ سپرنٹنٹ پر مشتمل تجربات کے لیے، SDS-PAGE کی تحریف سے بچنے کے لیے خلیوں کو FBS فری میڈیم میں کلچر کیا گیا تھا۔ سیل سپرنٹنٹس کی کٹائی کی گئی اور سیل کے ملبے کو ہٹانے کے لیے 10 منٹ کے لیے 500 گرام پر 4 ڈگری پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ نتیجے میں آنے والے سپرنٹینٹس کو 4 ڈگری پر 4,500 گرام پر 30 منٹ کے لیے سینٹرفیوگریشن کے ذریعے امیکون الٹرا 10K (ملی پور سگما) کا استعمال کرتے ہوئے 10× مرتکز کیا گیا۔ توجہ مرکوز کو نمونے کے بفر کے ساتھ ملایا گیا اور مغربی بلوٹنگ کے ذریعے تجزیہ کیا گیا جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے۔ پونسیو ریڈ سٹیننگ کا استعمال کرتے ہوئے پروٹین جیل سٹیننگ کی گئی تھی۔ LMP اور کیتھیپسن L سرگرمی پرکھ۔ انسانی pEGFP-hGal3 پلازمیڈ Tamotsu Yoshimori (Addgene plasmid, 73080) کی طرف سے ایک تحفہ تھا اور A375P-Galectin{139}} لائن بنانے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ pEGFP-C1 کنٹرول پلازمڈ ویکٹر بیک بون خریدا گیا تھا (نوو پرولابس، V012024)۔ پلاسمڈز (1 ug/mL) کو A375P خلیوں میں Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) کا استعمال کرتے ہوئے مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق منتقل کیا گیا تھا۔ منتقلی خلیوں کو G418 (Gibco، 10131035) کا استعمال کرتے ہوئے مستحکم طور پر منتخب کیا گیا تھا۔ LMP کے لیے، متعدد امیج فیلڈز میں کل 25 A375P-galectin-3 puncta–مثبت سیلز شمار کیے گئے تھے۔ پنکٹا-مثبت خلیوں کی فیصد کا حساب ہر فیلڈ میں الگ سے کیا گیا تھا، اور ہر گروپ کے لیے اوسط فیصد کا حساب لگایا گیا تھا۔ میجک ریڈ کیتھیپسن ایل پرکھ کٹ (Abcam, ab270774) کارخانہ دار کے پروٹوکول کے مطابق استعمال کی گئی تھی۔ خلیات کو زائس ایکسیو آبزرور 7 الٹی مائکروسکوپ کے تحت امیج کیا گیا تھا۔ میجک ریڈ خام انٹیگریٹڈ شدت کا حساب فجی - امیج جے سافٹ ویئر (NIH) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ MTT (3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 diphenyl tetrazolium bromide) سیل وائبلٹی پرکھ۔ 2,000 سیلوں کو ہر ایک کنویں میں 96-وییل پلیٹ کے تین حصوں میں چڑھایا گیا تھا، اور مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق سیل وائیبلٹی کٹ (روشے، 11465007001) کا استعمال کرتے ہوئے 3- دن کے MTT اسسز کیے گئے تھے۔ 1 گھنٹہ کے لیے انحیبیٹر پریٹریٹمنٹ دی گئی، اس کے بعد DC661 کے ساتھ یا اس کے بغیر انحیبیٹرز کے ساتھ خلیات کا علاج کیا گیا۔ IC50 کا حساب لگانے کے لیے نان لائنر ریگریشن (وکر فٹ) طریقہ استعمال کیا گیا تھا۔

cistanche tubulosa - مدافعتی نظام کو بہتر بنانا

Cistanche Enhance Immunity مصنوعات دیکھنے کے لیے یہاں کلک کریں۔

【مزید پوچھیں】 ای میل:cindy.xue@wecistanche.com / واٹس ایپ: 0086 18599088692 / وی چیٹ: 18599088692

کالونی کی تشکیل پرکھ۔ 2،000 سیل فی کنویں کو ایک 6-کنویں کی پلیٹ میں سیڈ کیا گیا اور اگلے دن علاج کیا گیا۔ خلیوں کو کل 8 دن تک علاج کے تحت رکھا گیا تھا۔ ہر کنویں میں بننے والی کالونیوں کو پی بی ایس سے دھویا جاتا تھا، 20 منٹ کے لیے ٹھنڈے میتھانول سے -20 ڈگری پر فکس کیا جاتا تھا، اور کرسٹل وایلیٹ 0.5% آبی محلول (V5265؛ ملی پور سگما) سے داغ دیا جاتا تھا۔

ٹریپین بلیو ڈائی اخراج پرکھ۔ ٹریپین بلیو پرکھ کے لیے رد عمل کا مرکب 0.4% ٹریپین بلیو (25- 900-CI، کارننگ) کے 1 حصے اور پتلے سیل کے نمونوں کے 1 حصے کو ملا کر تیار کیا گیا تھا۔ اس مرکب کو 1 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا، اور سیل کو سیلومیٹر ویژن (Nexcelom، Vision-310-0208) پر شمار کیا گیا۔

شکل 8. DC661-حوصلہ افزائی کیلریٹیکولن سطح کا اظہار ٹی خلیوں کو ٹیومر خلیوں کے خلاف پرائم کرتا ہے۔ (ا)

شکل 9. DC661-علاج شدہ خلیات کی ٹیکہ مخصوص سیاق و سباق میں ٹیومر کو مسترد کرتا ہے۔ (ا)

فوم-ایل پی او۔ ایل ایل پی کا مطالعہ فلوروسینٹ پروب، FOAMLPO کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ FOAM-LPO کی ترکیب کی گئی تھی جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا (26)۔ خلیوں کو 8 ویل μSlide (ibid، 80807) پر کلچر کیا گیا تھا اور ان کا علاج روکنے والوں کے ساتھ اور DC661 کے ساتھ یا اس کے بغیر کیا گیا تھا۔ خلیوں کو FOAM-LPO (1 M) پر مشتمل میڈیا کے ساتھ 5% CO2 اور 95% ہوا 37 ڈگری پر 5 منٹ کے لیے انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ خلیوں کو میڈیا سے دو بار دھویا گیا، اور پھر LLP کے جواب میں 586 سے 512 nm تک فلوروسینس شفٹنگ کا پتہ لگانے کے لیے خلیوں کو خوردبین (Zeiss Axio Observer 7 inverted microscope) کے نیچے دیکھا گیا۔ qRT-PCR اور پرائمر۔ A375P (3 × 105 ) خلیوں کو 60 ملی میٹر کے برتنوں میں کلچر کیا گیا تھا اور 24 گھنٹے تک DMSO یا DC661 (3 μM) کے ساتھ علاج کیا گیا تھا۔ مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق کل آر این اے کو آر این اے آئسولیشن کٹ (کیوآگن، 74134) کے ساتھ الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ سی ڈی این اے کو مینوفیکچرر کے پروٹوکول (تھرمو سائنٹیفک، K1642) کے مطابق 500 این جی پیوریفائیڈ آر این اے کے ساتھ ایک iScript ریورس ٹرانسکرپٹیس کٹ کا استعمال کرتے ہوئے ترکیب کیا گیا تھا۔ qPCR رد عمل SYBR گرین PCR ماسٹر مکس (BioRad، 1725121) کا استعمال کرتے ہوئے ترتیب دیا گیا تھا جس میں 1 μL cDNA تھا۔ تمام پیمائشیں سہ رخی میں کی گئی تھیں، اور BACTIN کو ΔCT حسابات کے لیے اندرونی معیار کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ جین ایکسپریشن کا تجزیہ درج ذیل پرائمرز کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا: PTGS2/COX-2 فارورڈ (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG)، PTGS2/COX-2 ریورس (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA)، CARS فارورڈ (CTGGACTCCAGCAGCAACCA)، آگے (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC)، CHAC1 ریورس (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG)، بیکٹن فارورڈ (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT)، اور بیکٹن ریورس (CCAGAGGGCGTACAGGGATAGCAC)۔

سی آر این اے ٹرانسفیکشن۔ انسانی ULK1، ATG7، TAX1BP1، BNIP3، PPT1، اور MFSD12 کے لیے جینیاتی ناک ڈاؤن اسٹڈیز A375P سیل لائنوں میں انجام دی گئیں۔ ماؤس Ppt1 اور Calreticulin کے لیے جینیاتی روک تھام کے مطالعے MC38 خلیوں میں کیے گئے تھے۔ غیر ٹارگٹ siRNA (sc{{10}})، human ULK1 (sc-44182)، ATG7 (sc-41447)، TAX1BP1/T6BP (sc-106831)، BNIP3 (sc{{20}}، PPT1/CLN1 (sc-105216)، MFSD12 (sc-97888)، ماؤس Ppt1/Cln1 (sc-142398) اور Calreticulin /Calregulin (sc-29895) siRNAs سانتا کروز بائیو ٹیکنالوجی سے خریدے گئے تھے۔ یہ siRNAs 3-5 ہدف کے مخصوص siRNAs کے تالابوں پر مشتمل ہیں۔ بہاؤ سائٹوومیٹری۔ فیروپٹوس انڈکشن کو C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861) کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا۔ A375P خلیات کو ایک 6-کنویں پلیٹ میں سیڈ کیا گیا تھا اور DMSO، فیروسٹیٹین{{40} (10 μM)، لپ روکسٹٹین-1 (2 μM)، ایلسٹن (5 μM) کے ساتھ علاج کیا گیا تھا۔ )، DC661 (3 μM)، یا 24 گھنٹے کے لیے ایک مجموعہ۔ 5 منٹ کے لئے 300 گرام پر سینٹرفیوگنگ کے ذریعے خلیوں کی کٹائی کی گئی۔ سیلز کو 500 μL 1X HBSS (کارننگ، 21-023-CV) میں دوبارہ معطل کیا گیا تھا جس میں 1 μM C11-BODIPY تھا اور 15 منٹ کے لیے 37 ڈگری پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ خلیوں کو 500 μL 1X HBSS میں چھرا اور دوبارہ معطل کیا گیا تھا، اور فلوروسینس کی شدت کو BD LSRII سائٹو میٹر پر 530/30 بلیو (یونیورسٹی آف پنسلوانیا فلو کور سہولت) کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا تھا۔ امیونوجینک سیل کی موت کے لئے کیلریٹیکولن کے سیل سطح کے اظہار کی مقدار کو انجام دیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا (45) بہاؤ سائٹومیٹری کے ذریعہ۔ B16F10 یا MC38 خلیوں کو NAC (10 mM) یا DC661 (3 μM) کے ساتھ 24 گھنٹے تک مہذب اور علاج کیا گیا۔ MC38 خلیوں کا علاج siPpt1 یا siNT کے ساتھ 48 گھنٹے تک 10 mM NAC کی موجودگی یا غیر موجودگی میں 24 گھنٹے تک کیا گیا۔ خلیوں کو CALR اینٹی باڈی (سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی، 12238)، الیکسا فلور 647 بکری اینٹی خرگوش سیکنڈ اینٹی باڈی (انویٹروجن)، اور پروپیڈیم آئوڈائڈ (PI) (بائیو لیجنڈ، 421301) سے داغ دیا گیا تھا۔ 710/50 بلیو اور 670/30 ریڈ کا استعمال کرتے ہوئے BD LSRII فلو سائٹو میٹر پر داغے ہوئے نمونے حاصل کیے گئے تھے، بالترتیب PI اور CALR فلوروسینس (یونیورسٹی آف پنسلوانیا فلو کور سہولت)، اور تجزیہ صرف CALR- مثبت اور خلیات تک ہی محدود تھا۔ جھوٹے مثبت واقعات سے بچنے کے لیے۔ ٹی سیل پرائمنگ اور فیصد سائٹوٹوکسیٹی۔ B16 یا MC38 ٹیومر سیلز (5 × 104) کو NAC (10 mM) یا DC661 (1 μM یا 3 μM) کے ساتھ بالترتیب 24 گھنٹے تک کلچر اور علاج کیا گیا۔ Calr جینیاتی روک تھام کے لیے، MC38 خلیوں کا علاج Calr siRNA یا nontarget siRNA (siNT) کے ساتھ 48 گھنٹے تک کیا گیا، اس کے بعد DMSO یا 3 μM DC661 کے ساتھ 24 گھنٹے تک علاج کیا گیا۔ اس کے بعد Splenocytes کو IL{102}} (5 IU/mL) کی موجودگی میں B16 یا MC38 سیلز کے ساتھ یا اس کے بغیر DC661 کے ساتھ کلچر کیا گیا اور 72 گھنٹے کے لیے cocultured کیا گیا۔ پرائمنگ کی تصدیق سپرنٹنٹ کے IFN- ELISA (Biolegend, 430815) نے کی۔ اس کے بعد پرائمڈ اسپلینوسائٹس کو تازہ کلچرڈ B16 یا MC38 سیلوں کے ساتھ ٹارگٹ ٹو ایفیکٹر (B16 یا MC38 سے splenocytes) کے تناسب کے ساتھ بالترتیب B16 اور MC38 سیلوں کے لیے 1:20 اور 1:50 کے تناسب سے تشکیل دیا گیا تھا۔ B16 یا MC38 سیل ڈیتھ سے وابستہ LDH ریلیز اور پھر فی صد سائٹوٹوکسٹی کو مینوفیکچرر کے پروٹوکول (ملی پور سگما، 4744926001) (31) کے مطابق ماپا گیا۔ قائم کینسر کے ماڈلز کے ساتھ اینٹیٹیمر ویکسینیشن اسسز اور کیموتھریپی اسٹڈیز۔ جیکسن لیبارٹری سے چھ سے آٹھ ہفتے پرانی خاتون WT C57BL/6 چوہوں، NOD/SCID، اور BALB/c چوہوں کو حاصل کیا گیا تھا۔ اینٹی ٹیومر ویکسینیشن کے تجربات کے لیے، WT B16F10، MC38، اور CT26 خلیوں کا علاج DC661 (3 μM) کے ساتھ 175 cm2 فلاسکس میں 36 گھنٹے تک کیا گیا۔ اس کے بعد، سپرنٹنٹس اور علیحدہ خلیات کو 50 ملی لیٹر فالکن ٹیوب میں جمع کیا گیا۔ خلیوں کو سینٹرفیوج کیا گیا تھا اور برف کے ٹھنڈے پی بی ایس سے دھویا گیا تھا۔ ویکسینیشن کے لیے، 150 μL سیلولر سسپنشن امیونوکمپیٹنٹ C57BL/6 چوہوں، امیونو ڈیفیشننٹ NOD/SCID چوہوں (1.8 × 104 B16F10 سیلز، 1.5 × 106 MC38 سیلز فی ماؤس)، یا SyncAL/B38 سیلز کے بائیں جانب لگایا گیا تھا۔ × 106 CT26 سیل فی ماؤس)۔ پی بی ایس میں دوبارہ معطل شدہ منجمد پگھلنے والے خلیوں کو منفی کنٹرول کے طور پر انجیکشن لگایا گیا تھا۔ ایک ہفتہ بعد، اسی قسم کے زندہ کینسر کے خلیات (3 × 104 B16F10 خلیات، 2 × 105 MC38 خلیات، یا 5 × 105 CT26 خلیات فی ماؤس) میٹریجل (کارننگ، 354248) کے مساوی حجم کے ساتھ دائیں طرف میں انجیکشن لگائے گئے۔ ویکسین شدہ چوہوں کی. ٹیومر کو الیکٹرانک کیلیپرز کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا تھا، اور حجم کا حساب L × W2 × 0.5 کے طور پر کیا گیا تھا۔ اگلے دنوں تک ٹیومر کی نشوونما کی باقاعدگی سے نگرانی کی جاتی تھی، اور ٹیومر کی عدم موجودگی کو موثر اینٹی ٹیومر ویکسینیشن کا اشارہ سمجھا جاتا تھا۔ DC661-MC38 ویکسینیشن اسٹڈیز NOD/SCID چوہوں میں دہرائی گئیں۔ شماریات۔ 2 گروپوں کا موازنہ کرتے وقت شماریاتی اہمیت کا تعین طالب علم کے غیر جوڑا، 2-ٹیلڈ ٹی ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ 1-طریقہ سے ANOVA ٹیسٹ استعمال کیا گیا جب 2 سے زیادہ گروپس کا موازنہ کیا گیا۔ اگر P قدر 0.05 سے کم تھی تو ایک کالعدم مفروضے کو نمایاں طور پر مسترد کر دیا گیا تھا۔ ڈیٹا کو اوسط ± SEM کے طور پر دکھایا گیا ہے۔ مطالعہ کی منظوری۔ تمام جانوروں کے تجربات یونیورسٹی آف پنسلوانیا کی ادارہ جاتی جانوروں کی دیکھ بھال اور استعمال کمیٹی کے منظور کردہ پروٹوکول کے مطابق کیے گئے تھے۔

چینی جڑی بوٹی سیستانچ پلانٹ - اینٹیٹیمر

حوالہ جات

1. زی ایچ جے، وغیرہ۔ لبلبے کے کینسر کے مریضوں میں ہائی ڈوز ہائیڈروکسی کلوروکوئن اور جیمسیٹا بائن/ ناب پیلیٹیکسیل کے ساتھ آٹوفجی کی روک تھام کا بے ترتیب مرحلہ II سے پہلے کا مطالعہ۔ کلین کینسر ریس 2020؛ 26(13):3126–3134۔

2. ربیکا وی ڈبلیو، وغیرہ۔ پی پی ٹی 1 ٹیومر کی نشوونما کو فروغ دیتا ہے اور کینسر میں کلوروکوئن مشتقات کا سالماتی ہدف ہے۔ کینسر ڈسکو۔ 2019؛ 9(2):220–229۔

3. برون ایس، وغیرہ۔ GNS561، ہیپاٹو سیلولر کارسنوما میں کینسر اسٹیم سیلز اور کولوریکٹل کینسر سے ہیپاٹک میٹاسٹیسیس کے خلاف فعال ایک نیا آٹوفجی انحیبیٹر۔ جے کینسر۔ 2021؛12(18):5432–5438۔

4. برون ایس، وغیرہ۔ GNS561، ایک کلینیکل اسٹیج PPT1 روکنے والا، lysosomal افعال کی ماڈیولیشن کے ذریعے hepatocellular carcinoma کے خلاف موثر ہے۔ آٹوفجی۔ 2022؛18(3):678–694۔

5. Oberle C، et al. Lysosomal membrane permeabilization اور cathepsin کی رہائی ایک Bax/ Bak پر منحصر ہے، fibroblasts اور monocytes میں apoptosis کے بڑھنے والا واقعہ ہے۔ سیل کی موت مختلف ہے۔ 2010؛ 17(7):1167–1178۔

6. بویا پی، کرومر جی. سیل کی موت میں لائسوسومل میمبرین پارمیبلائزیشن۔ آنکوجین۔ 2008؛27(50):6434–6451۔

7. ربیکا وی ڈبلیو، وغیرہ۔ لائزوزوم کے انحطاطی اور نمو کے سگنلنگ کرداروں کو نشانہ بنانے کے لیے ایک متحد نقطہ نظر۔ کینسر ڈسکو۔ 2017؛7(11):1266–1283۔

8. تانگ آر، وغیرہ۔ فیروپٹوسس، نیکروپٹوسس، اور پائروپٹوسس اینٹی کینسر مدافعتی میں۔ جے ہیماتول آنکول۔ 2020؛ 13(1):110۔

9. یاماموٹو کے، وغیرہ۔ آٹوفیجی ایم ایچ سی آئی کو کم کرکے لبلبے کے کینسر کی مدافعتی چوری کو فروغ دیتی ہے۔ فطرت 2020؛581(7806):100–105۔

10. ڈینگ جے، وغیرہ۔ ULK1 روکنا سمجھوتہ شدہ اینٹیجن پریزنٹیشن پر قابو پاتا ہے اور LKB1 اتپریورتی پھیپھڑوں کے کینسر میں اینٹیٹیمر استثنیٰ کو بحال کرتا ہے۔ نیٹ کینسر۔ 2021؛2(5):503–514۔

11. Lazarou M، et al. ubiquitin kinase PINK1 مائٹوفگی کو دلانے کے لیے آٹوفجی ریسیپٹرز کو بھرتی کرتا ہے۔ فطرت 2015؛524(7565):309–314۔

12. Choi YB، et al. TAX1BP1 مائٹوکونڈریل اڈاپٹر MAVS کی خارش میں ثالثی انحطاط کی سہولت فراہم کرکے وائرس سے متاثرہ اپوپٹوسس کو روکتا ہے۔ مول سیل بائیول۔ 2017؛37(1):e00422-16۔

13. Rikka S, et al. Bnip3 mitochondrial bioenergetics کو متاثر کرتا ہے اور mitochondrial ٹرن اوور کو متحرک کرتا ہے۔ سیل کی موت مختلف ہے۔ 2011؛ ​​18(4):721–731۔

14. لیو جے آئی، وغیرہ۔ p53 کے افریقی-مرکزی S47 متغیر کو ظاہر کرنے والے خلیوں میں خراب فیروپٹوسس کی میکانکی بنیاد۔ Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(17):8390–8396۔

15. Erkes DA، et al. اتپریورتی BRAF اور MEK inhibitors pyroptosis کے ذریعے ٹیومر کے مدافعتی مائکرو ماحولیات کو منظم کرتے ہیں۔ کینسر ڈسکو۔ 2020؛10(2):254–269۔

16. Serrano-Puebla A، Boya P. Lysosomal membrane permeabilization in cell death: نئے ثبوت اور صحت اور بیماری کے لیے مضمرات۔ این NY Acad Sci. 2016؛ 1371(1):30–44۔

17. Thirusangu P، et al. ڈمبگرنتی کینسر میں کوئناکرائن کی حوصلہ افزائی آٹوفجی کیتھیپسن-ایل ثالثی لائسوسومل/مائٹوکونڈریل جھلی کے پارمیبلائزیشن اور سیل کی موت کو متحرک کرتی ہے۔ کینسر (بیسل)۔ 2021;13(9):2004۔

18. Michallet MC، et al. کیتھیپسن پر منحصر اپوپٹوسس T لیمفوسائٹس کے سپراپٹیمل ایکٹیویشن سے شروع ہوتا ہے: اعلی خوراک رواداری کا ایک ممکنہ طریقہ کار۔ جے امیونول۔ 2004؛172(9):5405–5414۔

19. مونڈل اے، وغیرہ۔ CLN1 بیماری کے ماؤس ماڈل میں پی پی ٹی1-کی کمی لیسوسومل Ca++ ہومیوسٹاسس کو روکتی ہے۔ J Inherit Metab Dis. 2022؛45(3):635–656۔ 20. Engel KM، et al. فاسفولیپیسس اور ری ایکٹیو آکسیجن پرجاتیوں نے صحت مند اور بیمار انسانوں اور جانوروں میں لپڈ بائیو مارکر حاصل کیے - لائسو فاسفیٹائڈیلچولین پر فوکس۔ فرنٹ فزیول۔ 2021؛ 12:732319۔

21. فو آر، وغیرہ۔ Niemann-Pick بیماری، قسم C1 کے ماؤس ماڈل کے فینوٹائپک دبانے میں N-acetylcysteine ​​کی افادیت۔ ہم مول جینیٹ۔ 2013؛22(17):3508–3523۔

22. بوز زیڈ، وغیرہ۔ N-acetylcysteine ​​mHypoA-59 ہائپوتھلامک نیورونز میں اولانزاپائن کی حوصلہ افزائی آکسیڈیٹیو تناؤ کو روکتا ہے۔ سائنس کا نمائندہ 2020؛ 10(1):19185۔

23. کھرے ایس، وغیرہ۔ ASS1 اور ASL تبدیل شدہ نائٹروجن میٹابولزم کے ذریعے واضح سیل رینل سیل کارسنوما میں ترقی کو دباتے ہیں۔ کینسر میٹاب۔ 2021؛ 9(1):40۔

24. Gęgotek A، et al. UV تابکاری اور ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ کے سامنے آنے والے وٹرو کلچرڈ انسانی جلد کے فائبرو بلاسٹس میں ریڈوکس اور اینڈوکانا بینوئڈ سسٹم کے تعاملات پر ایسکوربک ایسڈ کے حفاظتی اثر کا موازنہ۔ آرک ڈرمیٹول ریس۔ 2017؛309(4):285–303۔

25. De Raedt T, et al. راس سے چلنے والے ٹیومر کے لئے ایک مجموعہ تھراپی تیار کرنے کے لئے کینسر کے خلیوں کی کمزوریوں کا استحصال کرنا۔ کینسر سیل۔ 2011؛20(3):400–413۔

26. ژانگ ایکس، وغیرہ۔ لائزوزوم ٹارگٹ ایبل اور ریٹیومیٹرک پروب کے ذریعے فوم سیلز کے اندر لپڈ پیرو آکسیڈیشن کی نگرانی کرنا۔ مقعد کیمیکل۔ 2015؛87(16):8292–8300۔

27. وی سی وائی، وغیرہ۔ بائیو انفارمیٹکس پر مبنی تجزیہ سیل کے پھیلاؤ کے ایک اہم فروغ اور میلانوما میں ممکنہ علاج کے ہدف کے طور پر بلند MFSD12 کو ظاہر کرتا ہے۔ آنکوجین۔ 2019؛ 38(11):1876–1891۔

28. Aldini G، et al. N-Acetylcysteine ​​بطور اینٹی آکسیڈینٹ اور ڈسلفائڈ بریکنگ ایجنٹ: وجوہات۔ Free Radic Res. 2018؛52(7):751–762۔ 29. ابو رمیلح ایم، وغیرہ۔ لائسوسومل میٹابولومکس V-ATPase- اور mTOR پر منحصر lysosomes سے امینو ایسڈ کے اخراج کے ضابطے کو ظاہر کرتا ہے۔ سائنس۔ 2017؛358(6364):807–813۔

30. Zhou J، et al. کینسر کے علاج میں امیونوجینک سیل کی موت: موجودہ اور ابھرتے ہوئے انڈیوسرز۔ جے سیل مول میڈ۔ 2019؛ 23(8):4854–4865۔ 31. شرما جی، وغیرہ۔ PPT1 روکنا میلانوما میں اینٹی PD-1 اینٹی باڈی کی اینٹی ٹیومر سرگرمی کو بڑھاتا ہے۔ جے سی آئی انسائٹ۔ 2020؛5(17):e133225۔

32. مہنرٹ جے ایم، وغیرہ۔ BAMM (میلانوما میں BRAF آٹوفیجی اور MEK روکنا): جدید BRAFV600-میوٹنٹ میلانوما میں dabrafenib، trametinib، اور hydroxychloroquine کا مرحلہ I/II ٹرائل۔ کلین کینسر ریس 2022؛28(6):1098–1106۔ 33. لوئی ایم، وغیرہ۔ میکروآٹوفیجی پروٹین ڈینڈریٹک خلیوں پر MHC کلاس I کی سطح کو کنٹرول کرتے ہیں اور اینٹی وائرل CD8(+) T سیل کے ردعمل کو تشکیل دیتے ہیں۔ سیل ریپ. 2016؛ 15(5):1076–1087۔

34. Jouandin P، et al. Lysosomal cysteine ​​mobilization TORC1 کے ردعمل اور ٹشو کی افزائش کو روزے کی شکل دیتا ہے۔ سائنس۔ 2022;375(6582):eabc4203۔

35. Schwalfenberg GK. N-acetylcysteine: طبی افادیت کا جائزہ (نئی چالوں کے ساتھ ایک پرانی دوا)۔ جے نیوٹر میتاب۔ 2021؛ 2021:9949453۔

36. بیئر ایل اے، وغیرہ۔ ایکٹوپک حمل کے سیرم بائیو مارکر کی منظم دریافت 3-ڈی پروٹین پروفائلنگ کے ساتھ لیبل فری مقدار کے ساتھ۔ J Proteome Res. 2011؛10(3):1126–1138۔ 37. گولڈمین اے آر، وغیرہ۔ ARID1A-میوٹیٹڈ ڈمبگرنتی کلیئر سیل کارسنوما کے پروٹوم پر بنیادی اثر نقل کے بعد کی سطح پر میولوونیٹ پاتھ وے کی کمی ہے۔ مول سیل پروٹومکس۔ 2016؛ 15(11):3348–3360۔

38. Cox J، Mann M. MaxQuant اعلی پیپٹائڈ کی شناخت کی شرح، انفرادی پی پی بی رینج بڑے پیمانے پر درستگیوں، اور پروٹوم وسیع پروٹین کی مقدار کو قابل بناتا ہے۔ نیٹ بائیو ٹیکنالوجی۔ 2008؛ 26(12):1367–1372۔

39. کاکس جے، وغیرہ۔ اینڈرومیڈا: ایک پیپٹائڈ سرچ انجن جو میکس کوانٹ ماحول میں مربوط ہے۔ J Proteome Res. 2011؛10(4):1794–1805۔

40. کاکس جے، وغیرہ۔ تاخیر سے نارملائزیشن اور زیادہ سے زیادہ پیپٹائڈ تناسب نکالنے کے ذریعے درست پروٹوم وسیع لیبل فری مقدار کا تعین، جسے MaxLFQ کہا جاتا ہے۔ مول سیل پروٹومکس۔ 2014;13(9):2513–2526۔

41. Tyanova S، et al. پرسیئس کمپیوٹیشنل پلیٹ فارم (پروٹ) اومکس ڈیٹا کے جامع تجزیہ کے لیے۔ نیٹ کے طریقے۔ 2016؛ 13(9):731–740۔

42. Tyanova S, Cox J. Perseus: کینسر کی تحقیق میں پروٹومکس ڈیٹا کے انٹیگریٹو تجزیہ کے لیے ایک بایو انفارمیٹکس پلیٹ فارم۔ طریقے Mol Biol. 2018؛ 1711: 133-148۔

43. ایلیسیا جی ایم، وغیرہ۔ عمر رسیدہ فبروبلاسٹ لپڈ میٹابولزم میں تبدیلیاں فیٹی ایسڈ ٹرانسپورٹر FATP2 کے ذریعے عمر پر منحصر میلانوما سیل مزاحمت کو ٹارگٹ تھراپی کے لیے اکساتی ہیں۔ کینسر ڈسکو۔ 2020؛ 10(9):1282–1295۔

44. Ran FA, et al. CRISPR-Cas9 سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے جینوم انجینئرنگ۔ نیٹ پروٹوک۔ 2013؛ 8(11):2281–2308۔

45. لیو پی، وغیرہ۔ امیونوجینک سیل کی موت سے وابستہ کیلریٹیکولن کی نمائش کی مقدار۔ انزیمول کے طریقے۔ 2020؛ 632:1-13۔