دائمی گردے کی بیماری (CKD) کا عالمی پھیلاؤ آبادی کی بڑھتی عمر کے ساتھ بڑھ رہا ہے

مزید معلومات کے لیے براہ کرم oscar.xiao@wecistanche.com سے رابطہ کریں۔

پس منظر:فائبروسس گردے کی عمر بڑھنے کے عمل کی سب سے عام پیتھولوجیکل خصوصیات میں سے ایک ہے، اور عمر بڑھنے والے گردوں میں فائبروسس بھی گردے کی دائمی بیماری (CKD) کے عمل کو بڑھاتا ہے۔ Corallodiscus flabellata BLBurtt (C.flabellata, CF) چینی لوک داستانوں میں عام طور پر استعمال ہونے والی نباتاتی دوا ہے۔ تاہم، چند مطالعات نے اس کے فارماسولوجیکل اثرات کی اطلاع دی ہے۔ اس مطالعہ کا مقصد SAMP8 چوہوں میں رینل فبروسس پر CF ایتھنول ایکسٹریکٹ کے اثر کو تلاش کرنا اور ممکنہ طور پر فعال مرکبات کی شناخت کرنا تھا۔

طریقے:Senescence-accelerated mouse-prone 8 (SAMP8) کو جانوروں کے ماڈل کے طور پر استعمال کیا گیا تھا، اور CF کی مختلف خوراکیں ایک ماہ کے لیے gavage کے ذریعے دی گئی تھیں۔ -galactosidase سٹیننگ کا استعمال کرتے ہوئے چوہوں میں گردوں کی عمر بڑھنے کی ڈگری کا مشاہدہ کرنا۔ چوہوں میں رینل فبروسس کا اندازہ کرنے کے لیے میسن سٹیننگ اور Col-lI، a-SMA، اور FN کے اظہار کی سطح کا استعمال کیا گیا تھا۔ گردے میں Nrf2 پاتھ وے اور Wnt/ -catein/RAS پاتھ وے کی پروٹین ایکسپریشن لیول کی پیمائش کی گئی۔ اور -galactosidase ( -gal) نے NRK-52E خلیات کو CF کے فعال اجزاء کو اسکرین کرنے کے لیے ان وٹرو ماڈل کے طور پر حوصلہ افزائی کی۔

مزید جاننے کے لیے براہ کرم یہاں کلک کریں۔

نتائج:CF ایتھنول کے نچوڑ نے رینل-galactosidase کی سرگرمی اور Coll، a-SMA، اور FNin SAMP8 چوہوں کے اظہار کی سطح کو نمایاں طور پر روکا، اور SAMP8 چوہوں میں Masson کے داغ کو بہتر کیا۔ CF نے SAMP8 چوہوں میں پیشاب کی پروٹین، کریٹینائن، یوریا نائٹروجن، اور TNF-a اور IL-1 کے سیرم کی سطح کو نمایاں طور پر کم کیا، اور SOD اور GSH-Px کی سطح میں نمایاں اضافہ کیا۔ مزید برآں، CF نے Nrf2 پاتھ وے کو چالو کیا اور چوہوں کے گردوں میں Wnt/-catenin/RAS کے راستے کو روک دیا۔ اس کے علاوہ،3،4-ڈائی ہائیڈروکسی فینائل ایتھنول (SDC-0-14,16) اور (3,4-ڈائی ہائیڈروکسی فینائل ایتھنول-8-O-[4-O-ٹرانس -caffeoyl- -D-apiofuranosy-(1→3)- -D-glucopyranosyl (1→6)]- -D-glucopyranoside (SDC-1-8) CF سے الگ تھلگ تھے۔ ، جس نے NRK-52E خلیات کی سنسنی کو کم کیا، اور شاید CF کے فعال اجزاء جو عمر مخالف کردار ادا کر رہے ہیں۔

نتیجہ:ہمارے تجربات نے روشن کیا کہ CF ایتھنول کا عرق Wnt/ -catenin/RAS پاتھ وے کے ذریعے SAMP8 چوہوں میں رینل فبروسس کو بہتر بنا سکتا ہے۔ اور SDC-0-14,16 اور SDC-1-8 CF کے لیے اینٹی رینل سنسنینس سے متعلق اثرات مرتب کرنے کے لیے مادی بنیاد ہو سکتے ہیں۔

مطلوبہ الفاظ:عمر بڑھنے، کورلوڈیسس فلابیلاٹا، گردے، رینل فبروسس، SAMP8، سنسنی، Wnt/-catenin/RAS

تعارف

دائمی گردے کی بیماری (CKD) کا عالمی پھیلاؤ آبادی کی عمر بڑھنے کے ساتھ بڑھ رہا ہے اور معاشرے پر ایک اہم بوجھ بنتا ہے [1-3]۔ CKD کا سب سے عام پیتھولوجیکل مظہر رینل فبروسس کی کچھ شکل ہے[4]۔ اسی طرح رینل فبروسس بھی گردے کی عمر بڑھنے کی علامات میں سے ایک ہے [2]۔ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ آکسیڈیٹیو تناؤ، سوزش، Wnt/ -catenin، renin-angiotensin-aldosterone system (RAS)، اور rapamycin (mTOR) سگنلنگ کا تعلق CKD سے ہے جو سنسنی کی وجہ سے ہوتا ہے [5]۔ عمر رسیدہ گردوں میں رینل فبروسس کا تعلق Wnt/ -catein اور RAS سگنلنگ پاتھ وے کے فعال ہونے سے ہے [6]۔ Wnts کے ایکٹیویشن پر، سائٹوپلازم میں -کیٹنین کو نیوکلئس میں منتقل کیا جاتا ہے، جہاں یہ لیمفائیڈ اینہنسرس بائنڈنگ فیکٹر (LEF)/T-cell factor (TCF) ٹرانسکرپشن فیکٹر فیملی سے منسلک ہوتا ہے اور نیچے دھارے والے ٹارگٹ جینز کی نقل کو شروع کرتا ہے۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ RAS جین کے فروغ دینے والے علاقے میں LEF/TCF بائنڈنگ سائٹس بھی شامل ہیں، جو کہ -catenin کو ان سائٹس پر LEF-1 کی پابندی کو فروغ دینے کی اجازت دیتی ہے[7]۔cistanche کولیسٹرول،لہذا، Wnt/ -catenin/RAS سگنلنگ پاتھ وے کو نشانہ بنانا رینل فبروسس [8,9] کے لیے ممکنہ علاج کی حکمت عملی ہو سکتی ہے۔ حالیہ برسوں میں، قدرتی مصنوعات کے ساتھ رینل فبروسس کی متبادل تھراپی نے بہت سے اسکالرز کی توجہ مبذول کرائی ہے [10] . Xiaoyan Shen et al. نے پایا کہ ginsenoside Rgl نے SAMP8 چوہوں میں NLRP3 inflammasome کے ایکٹیویشن کو روک کر گردے کی عمر بڑھنے کے دوران گلومیریولر فائبروسس کو کم کیا [11]۔ اس مطالعہ نے Wnt/-catenin/RAS پاتھ وے سے SAMP8 چوہوں میں رینل فبروسس پر C. flabellate (CF) اقتباس کے اثر کو دریافت کیا۔

Cistanche مخالف عمر رسیدہ کر سکتے ہیں

CF کو چین میں ایک دواؤں کے پودے کے طور پر سب سے پہلے "Dian Nan Ben Cao" میں درج کیا گیا تھا۔ یہ پورا پودا عام طور پر چین کے نسلی اقلیتی علاقوں میں پیچش، قبل از وقت انزال، سیمینل ویسیکل بیماری، اور گردے کی بیماری کے علاج کے لیے استعمال ہوتا ہے [12]۔ ، جدید تحقیق میں سی ایف کے بارے میں کچھ رپورٹس موجود ہیں۔ ہماری لیبارٹری میں فارماسولوجیکل اسٹڈیز سے پتا چلا ہے کہ سی ایف کے عرق میں موتروردک اثرات تھے اور اس میں بہتری لائیپوپولیساکرائڈ/ڈی-گیلیکٹوسامین کی وجہ سے جگر کی خرابی اور چوہوں میں دماغی نقصان ہوتا ہے [13، 14]۔ اس نے انکشاف کیا کہ فینی لیتھانائیڈ گلائکوسائیڈز اور فلیوونائڈز CF [15,16] کے اہم کیمیائی اجزا ہیں۔ سی ایف کے ساتھ گردے کی بیماری کے علاج کے تجرباتی ثبوت قدیم کتابوں میں بیان کیے گئے ہیں۔

مواد اور طریقے

پودوں کے مواد کو جمع کرنا اور نکالنا

"یونن چائنیز ہربل میڈیسن" ریکارڈ کرتی ہے کہ سی ایف کو سال بھر کاٹا جا سکتا ہے۔ اس تجربے میں استعمال ہونے والے سی ایف پلانٹس کی کاشت ستمبر میں چین کے صوبہ ہینان کے Xixia کاؤنٹی میں کی گئی۔ اس کی شناخت ہینان یونیورسٹی آف چائنیز میڈیسن کے پروفیسر سوئیکنگ چن نے کی تھی، اور نمونے لیبارٹری کے نمونوں کی لائبریری میں محفوظ کیے گئے تھے۔cistanche deserticola کے ضمنی اثراتپودوں (1 کلوگرام) کو 50 فیصد ایتھنول (3×12 L، ہر 1 h) کے ساتھ ریفلکس کیا گیا تھا، اور مرکب کو گوج کی 16 تہوں سے فلٹر کیا گیا تھا۔ مشترکہ فلٹریٹس کو فریز ڈرائر کا استعمال کرتے ہوئے روٹری بخارات کے ذریعہ خشک کیا گیا تھا۔ آخر میں، CF کے 50 فیصد ایتھنول خام عرق کی فیصد پیداوار 15.5 فیصد تھی۔ خشک عرق کو مزید استعمال تک فریج میں رکھا گیا تھا۔ ضمنی مواد CF ایکسٹریکٹ کے اجزاء کے عہدہ پر متعلقہ ڈیٹا کی فہرست بناتا ہے۔

ایک اور علیحدگی کا عمل جو پہلے بتایا گیا تھا اس مطالعہ میں پانی کے اخراج کا حصہ، 20 فیصد ایتھنول ایلیوشن فریکشن، 30 فیصد ایتھنول ایلیوشن فریکشن، اور 40 فیصد ایتھنول ایلیوشن فریکشن CF [13] سے حاصل کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ 40 فیصد ایتھنول فریکشن کو Sephadex LH-20 اور سلیکا جیل کالم کا استعمال کرتے ہوئے الگ کیا گیا تھا اور آخر کار SDC-0-14,16, SDC {10}}، SDC-0-60(p-hydroxy benzyl شراب)۔

جانور اور انتظامیہ

اس تحقیق میں تیانجن یونیورسٹی آف ٹریڈیشنل چائنیز میڈیسن (تیانجن، چائنا) کے فرسٹ ملحقہ ہسپتال کے چھ ماہ کے مرد SAMP8 اور سنسنی تیز رفتار ماؤس ریزسٹنٹ 1 (SAMR1) چوہوں کا استعمال کیا گیا۔ جانوروں کو کنٹرول شدہ روشنی (12-گھنٹہ روشنی/تاریک چکر)، درجہ حرارت (23-25 ڈگری سینٹی گریڈ)، اور نمی (45-55 فیصد) حالات میں رکھا گیا تھا اور انہیں معیاری خوراک اور پانی کا اشتہار ملا تھا۔ libitum کل 48 SAMP8 چوہوں کو چار تجرباتی گروپوں (n=12/گروپ) میں تقسیم کیا گیا تھا: SAMP8 ماڈل چوہوں (M)، کم خوراک والے CF ایتھنول ایکسٹریکٹ سے علاج شدہ SAMP8 چوہوں (CF-L، 387.5 mg/kg، انٹراگاسٹرک طور پر)، درمیانے درجے کی خوراک والے CF ایتھنول کے عرق سے علاج شدہ SAMP8 چوہے (CF-M,775 mg/kg, intragastrically)، اور زیادہ مقدار والے CF ایتھنول کے عرق سے علاج شدہ SAMP8 چوہے (CF-H,1550 mg/ kg، intragastrically)۔ SAMRI کنٹرول (Con, n=10) اور SAMP8 ماڈل گروپس (M) میں چوہوں کا علاج جسمانی نمکین (0.9 فیصد) سے کیا گیا۔ تمام چوہوں کا 1 ماہ تک زبانی علاج کیا گیا۔ تمام جانوروں کے تجربات کو ہینن یونیورسٹی آف چائنیز میڈیسن کی اخلاقیات کمیٹی نے منظور کیا تھا اور ادارہ جاتی رہنما خطوط کے تحت انجام دیا گیا تھا (ہینان، چین کی منظوری نمبر: HACTCM-2018009060-19)۔ تجربے کے دوران، Con اور M گروپوں میں سے ہر ایک میں ایک چوہے کی موت ہوئی، اور CF-H گروپ میں دو چوہے مر گئے۔

نمونے کا مجموعہ

تجربے کے اختتام پر، چوہوں کو انفرادی طور پر میٹابولک پنجروں میں 12- گھنٹے پیشاب جمع کرنے کے لیے رکھا گیا تھا۔ اس کے بعد چوہوں کو isoflurane کے ساتھ بے ہوشی کی گئی، اور خون کے نمونے ریٹرو مداری خون بہنے کے ذریعے جمع کیے گئے۔ اس کے بعد ہر چوہے کے گردے جراحی کے ذریعے نکالے گئے اور تجزیہ کے مطابق 80 ڈگری سینٹی گریڈ پر رکھا گیا۔

سیل کلچر اور ان وٹرو اسٹڈی

NRK-52چائنیز اکیڈمی آف سائنسز (شنگھائی، چین) کے سیل بینک سے خریدے گئے E سیلز D-galactose (D-gal, S11050، Yuanye شنگھائی، چین)۔ NRK-52E خلیات Dulbecco کی Eagle's Medium Dulbecco (DMEM,12,100,046, Thermo Fisher, Massachusetts, USA) میں 10 فیصد فیٹل بووائن سیرم کے ساتھ ایک انکیوبیٹر میں اور 37 ڈگری سینٹی گریڈ کی موجودگی میں فراہم کیے گئے ترمیم میں اگائے گئے تھے۔ فیصد، CO.Cells کو 96-کنویں پلیٹوں یا 6-کنویں پلیٹوں میں 80-85 فیصد سنگم تک بڑھایا گیا اور پھر ان کا علاج مختلف دواؤں کے امتزاج پر مشتمل گروتھ میڈیا کے ساتھ کیا گیا: میڈیا پلس D-gal ( 20 mg/mL）، Media plus D-gal plus CF（10, 25,50, 100 ug/mL）یا Media plus D-gal plus monomeric compound） (10 μM） بالترتیب 48 گھنٹے کے لیے) ایم ٹی ٹی) پرکھ سیل کی قابل عملیت کا پتہ لگانے کے لئے استعمال کیا گیا تھا، اور -گیلیکٹوسیڈیس سٹیننگ کو سیل سنسنی کا مشاہدہ کرنے کے لئے استعمال کیا گیا تھا۔

سنسنی سے وابستہ - galactosidase staining

چوہوں کے منجمد گردے 10-μm-موٹے حصوں اور NRK-52E خلیات کو سنسنی سے وابستہ -galactosidase (SA- -gal, C0602, Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) سے داغے ہوئے تھے۔ کارخانہ دار کے پروٹوکول پر عمل کریں۔

ہسٹولوجیکل تجزیہ

گردے کے حصوں کو 4 فیصد بفرڈ پیرافارمیلڈہائڈ کے ساتھ طے کیا گیا تھا، اور 10-μm-موٹی پیرافین ایمبیڈڈ حصے میسن کے ٹرائیکروم (G1006، سروس، ووہان، چین) سے داغے ہوئے تھے اور خوردبینی طور پر مشاہدہ کیا گیا تھا۔ میسن کے ٹرائیکروم داغ والے حصوں میں نیلے رنگ کے علاقوں کو تصادفی طور پر چھ منتخب فیلڈز سے مقداری طور پر ماپا گیا اور امیج پرو پلس 6.0 سافٹ ویئر کے ذریعہ تجزیہ کیا گیا۔

بائیو کیمیکل پیمائش

سیرم اور گردے کے ہوموجنیٹ کے نمونوں کو کمرے کے درجہ حرارت پر پگھلا دیا گیا، اور سپر آکسائیڈ کے اخراج کی سطح (SOD، CSB-E08556m، ووہان ہوامی، ووہان، چین)، گلوٹاتھیون پیرو آکسیڈیس (GSH-Px، A005-1-2، Nanjing Jiancheng, Nanjing, China), interleukin-1 (IL-1, RK00006, ABclonal, Wuhan, China), tumor necrosis factor- (TNF-, RK00027, ABclonal, Wuhan, China), یوریا نائٹروجن (C{ {10}}، Nanjing Jiancheng, Nanjing, China), creatinine(Cr, C011-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing, China) ماؤس سیرم میں، کل پیشاب کی پروٹین (C035-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing) ، چین) ماؤس کے پیشاب میں اور کولیجن قسم I (Col-I, MU30364, Bio-Swamp, Wuhan, China) کے اظہار کی سطح، -smooth muscle actin (-SMA, MU30359, Bio-Swamp, Wuhan, China), fibronectin (FN, MU30179, Bio-Swamp, Wuhan, China) ماؤس کے گردے کے ٹشوز کو پرکھ کٹ بنانے والے کے پروٹوکول کے مطابق ترتیب وار ناپا گیا۔

امیونو ہسٹو کیمیکل تجزیہ

امیونو ہسٹو کیمیکل تجزیہ معمول کے طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا [17]۔ استعمال شدہ اینٹی باڈیز میں درج ذیل شامل ہیں: Wnt4 (14371-1-AP, Proteintech, Chicago, USA), -catenin (17565-1-AP,Proteintech, Chicago, USA), ٹائپ 1 انجیوٹینسن II ریسیپٹرز (AGTR1,{{ 7} AP, Proteintech, Chicago, USA), p-nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (p-Nrf2, ab76026, Abcam, Cambridge, UK),pc-Fos(ab27793,Abcam,Cambridge, UK )، کنیکٹیو ٹشو گروتھ فیکٹر (CTGF، GB11078، سروس، ووہان، چین)۔ حصوں کو ایک خوردبین (اولمپس، ٹوکیو، جاپان) کے تحت دیکھا گیا تھا.cistanche dosage redditImage-Pro Plus 6 کا استعمال کرتے ہوئے ٹین ایکسپریشن کے ساتھ علاقے کے رقبہ اور مربوط آپٹیکل ڈینسٹی (IOD) کی پیمائش کریں۔ -مقداری تجزیہ.

مغربی دھبے کا تجزیہ

مغربی بلٹ پرکھ کا انعقاد کیا گیا جیسا کہ پچھلے مطالعہ میں بیان کیا گیا ہے [18]۔ مختصراً، گردے کے ٹشوز کو لیسیز بفر میں ہم آہنگ کیا گیا اور بریڈ فورڈ پروٹین آسے کٹ (AR0197، بوسٹر بائیولوجیکل ٹکنالوجی، ووہان، چین) کا استعمال کرتے ہوئے مقدار درست کی گئی۔ اس کے بعد ہوموجنیٹس کو سوڈیم ڈوڈیسائل سلفیٹ-پولیاکریلامائڈ جیل الیکٹروفورسس کا نشانہ بنایا گیا، پولی وینیلائیڈین فلورائیڈ جھلی میں منتقل کیا گیا، اور 90 منٹ کے لیے بلاکنگ بفر (4 فیصد نان فیٹ خشک دودھ) میں بلاک کر دیا گیا۔ اس کے بعد انہیں بنیادی اینٹی باڈیز (Wnt4؛ renin؛ AGTR1؛ p-Nrf2؛ pc-Fos؛ کیلچ نما ECH سے وابستہ پروٹین 1 (کیپل، GB11847، سروس بائیو، ووہان، چین) کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا؛ -ایکٹین (AC026، Abclonal، ووہان، چین)؛ اور گلیسرالڈیہائیڈ-3-فاسفیٹ ڈیہائیڈروجنیز (GAPDH, AC033, Abclonal, Wuhan, China)) رات بھر 4 ڈگری پر، اس کے بعد کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹے کے لیے مناسب فلو پریزنس-کنججیٹڈ سیکنڈری اینٹی باڈی کے ساتھ انکیوبیشن . دلچسپی کے پروٹین کو Odyssey IR سکینر (LI-COR بایوسینسز، نیبراسکا، USA) کے ساتھ اسکین کیا گیا تھا، اور امیج اسٹوڈیو سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے سگنل کی شدت کو درست کیا گیا تھا۔ پروٹین کی سطح کو ایکٹین یا GAPDH کے خلاف معمول بنایا گیا تھا۔

گردے کے نمونوں کے لیے UPLC-Q-TOF-MS تجزیہ

گردوں کے ٹشوز کا وزن برف سے سرد جسمانی نمکین (w/v=1:1) میں کیا گیا تھا۔ اس کے بعد، 200 μL ٹشو ہوموجنیٹ نمونوں میں 1 ملی لیٹر ایسٹونیٹرائل شامل کیا گیا، اس کے بعد 30 منٹ تک الٹراسونک نکالا گیا۔ ایکسٹریکٹ کو 12،000 جی اور 4 ڈگری پر 10 منٹ کے لیے سینٹرفیوج کیا گیا۔ سپرنٹنٹ کو تجزیہ کے لیے شیشی میں لے جایا گیا۔ کرومیٹوگرافک علیحدگی الٹرا پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی (UPLC) (Dionex UltiMate 3000 System, Thermo Scientific, Massachusetts, USA) پر کی گئی تھی، جس میں LC سسٹم شامل تھا جس میں ایک Acclaim RSLC 120 C18 کالم （2.20mm؛ 2.1mm تھرمو سائنٹیفک)۔cistanche اقتباس کے فوائدموبائل فیز میں سالوینٹ A(acetonitrile) اور {{0}}.1 فیصد فارمک ایسڈ (B) کے ساتھ پانی شامل تھا۔ علیحدگی تدریجی اخراج کے ذریعہ اس طرح انجام دی گئی: 10-70 فیصد A 0 سے 3 منٹ تک، 70-78 فیصد A 4 سے 13 منٹ تک، 78-90 فیصد A 14 سے 15 منٹ، 90 فیصد -10 فیصد A 15 سے 16 منٹ تک، اور 10 فیصد A 16 سے 20 منٹ تک۔ ٹیسٹ کے نمونے کے انجیکشن کا حجم 2μL تھا۔ ماس اسپیکٹومیٹری (MS) تجزیہ مندرجہ ذیل شرائط کے تحت ESI ذریعہ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا: مثبت موڈ میں کیپلیری وولٹیج 3.5 kV تھا، اور منفی موڈ میں کیپلیری وولٹیج 3.2 kV تھا۔ نیبولائزر کا دباؤ 2.0 بار تھا، خشک گیس کا درجہ حرارت 230 ڈگری تھا، اور بہاؤ کی شرح 8 L/منٹ تھی۔

شماریاتی تجزیہ

The acquired raw data from ultra-performance liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q/TOF-MS) analysis were first preprocessed using profile analysis(version 2.1, Bruker, Germany). The"bucket table" was obtained and imported into the SIMCA-P software(version13.0 Umetrics AB, Sweden)for principal component analysis (PCA). Other results were presented as mean±stand-ard deviation(SD). The data were processed using IBM SPSS Statistics 26.0. The normal distribution of the data used the Levene test, which required the average value, P>{{0}.05; فرق کا یک طرفہ تجزیہ گروپوں کے درمیان موازنہ کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ 0.05 سے کم AP قدر کو شماریاتی لحاظ سے اہم سمجھا جاتا تھا۔

نتائج

سی ایف نے SAMP8 چوہوں میں گردوں کی عمر بڑھنے اور فائبروسس کو بہتر کیا۔

SAMP8 چوہوں کے گردوں پر CF کے اثر کی چھان بین کرنے کے لیے، SA- -گردوں میں gal سرگرمی کی پیمائش کی گئی۔ تصویر میں، گردے کے ٹشوز میں SA- -گل کی سرگرمی ایم گروپ میں نمایاں طور پر بڑھی ہے (بلیو اینہانسمنٹ)۔ CF-L اور CF-M کی انتظامیہ نے SAMP8 چوہوں کے گردوں میں -galactosidase سرگرمی کو نمایاں طور پر روکا جبکہ CF-H کی طرف سے بہتری نمایاں نہیں تھی۔ اس کے علاوہ، ماڈل گروپ کے گردے کا انڈیکس کنٹرول گروپ کے مقابلے میں نمایاں طور پر کم تھا (تصویر 1b، P<0.05). after="" treatment="" with="" cf-m,="" the="" kidney="" index="" of="" samp8="" mice="" was=""><0.01). next,="" the="" results="" of="" masson's="" trichrome="" staining="" (fig.="" lc,=""><0.01)and the="" expression="" of="" fibrosis="" indicators="" col-i,="" α-sma,="" and="" fn="" revealed="" that="" m-group="" mice="" had="" more="" severe="" renal="" fibrosis="" than="" con-group="" mice,="" and="" cf-l="" and="" cf-m="" significantly="" attenuated="" renal="" fibrosis="" in="" samp8="" mice(fig.leg,=""><>

سی ایف نے SAMP8 چوہوں میں رینل فنکشن، آکسیڈیٹیو تناؤ، اور سوزش کی سطح کو بہتر بنایا

اس کے علاوہ، چوہوں کے ہر گروپ کے رینل فنکشن انڈیکیٹرز کی جانچ کی گئی، جس میں چوہوں میں 12 گھنٹے کے لیے پیشاب کا حجم، سیرم میں Cr اور یوریا نائٹروجن کی سطح، اور پیشاب میں پروٹین کی سطح شامل تھی۔ جیسا کہ تصویر 2a-d میں دکھایا گیا ہے، ماڈل گروپ کے پیشاب میں پروٹین، سیرم Cr اور سیرم یوریا نائٹروجن کی سطح کنٹرول گروپ کی نسبت نمایاں طور پر زیادہ تھی (تصویر 2a، P<0.01), while="" the="" urine="" volume="" of="" the="" model="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" control="" group(fig.2b-d,=""><0.01). cf="" supplementation="" down-regulated="" the="" levels="" of="" urine="" protein,="" serum="" cr="" and="" urea="" nitrogen="" in="" the="" model="" group(fig.2b-d,=""><0.05 or=""><0.01) while="" increasing="" the="" urine="" output="" of="" model="" mice.="" collectively,="" the="" results="" indicated="" that="" samp8="" mice="" had="" kidney="" damage="" associated="" with="" aging,="" and="" treatment="" with="" cf="" effectively="" ameliorated="" this="" injury.="">چنگیز خاناگلا، آیا سی ایف نے تیزی سے عمر رسیدہ چوہوں کے گردوں میں آکسیڈیٹیو تناؤ اور سوزش کو فائدہ مند طریقے سے ماڈیول کیا تھا۔ جیسا کہ تصویر 2e-h میں دکھایا گیا ہے، M گروپ کے گردوں میں SOD اور GSH-Pxin کی سطح Con گروپ کے گردے کے مقابلے میں نمایاں طور پر کم تھی، اور IL-1 کی سطح ان کی نسبت نمایاں طور پر زیادہ تھی۔ کون گروپ. CF کے علاج کے بعد، مندرجہ بالا اشارے میں بہتری آئی ہے، خاص طور پر CF-L اور CF-M کی بہتری کا اثر بہتر ہے۔

CF نے SAMP8 چوہوں کے گردے میں Nrf2 پاتھ وے کو چالو کیا۔

p-Nrf2 کے اظہار کی سطح کو گردے کے ٹشوز میں ناپا گیا تاکہ یہ معلوم کیا جا سکے کہ آیا موجودہ مطالعہ میں Nrf2 کا راستہ CF(Fig.3a-c) کے حفاظتی اثر میں شامل تھا۔ صرف SAMP8 گروپ میں p-Nrf2 کے اظہار کی سطح میں نمایاں کمی واقع ہوئی ہے۔<0.01, fig.="" 3c),="" and="" the="" downregulation="" was="" reversed="" to="" some="" extent="" by="" the="" treatment="" of="" cf="" crude="" extract.="" there="" was="" no="" significant="" change="" in="" the="" expression="" level="" of="" keapl="" among="" the="" groups(fig.="" 3b="" and="" d).="" further,="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" was="" detected="" and="" analyzed="" by="" immunohistochemical="" and="" western="" blot="" analyses.="" it="" was="" found="" that="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" mice="" in="" the="" m="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" con="" group;="" while="" cf="" treatment="" significantly="" reduced="" the="" expression="" levels="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" the="" mice="" (fig.3a-b="" and="">

SAMP8 چوہوں کے گردے میں CF کم ہونے والی Wnt/-catenin/RAS سگنلنگ ایکٹیویشن

اینٹی فبروسس اثر کو استعمال کرنے والے CF کے ممکنہ طریقہ کار کو مزید دریافت کرنے کے لیے۔ پروٹین کی لوکلائزیشن امیونو ہسٹو کیمسٹری کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی تھی۔ جیسا کہ تصویر 4a میں دکھایا گیا ہے، Wnt4 اور کے اظہار کی سطح

-کیٹنین بنیادی طور پر گردوں کے نلی نما خلیوں میں پیدا ہوتا تھا۔ اسی طرح کے نتائج دیکھے گئے جب AGTR1، Wnt سگنلنگ کے نیچے دھارے کے راستے کے اہداف کا جائزہ لیا گیا (تصویر 4a)۔ اس کے بعد، پروٹین کے اظہار کی سطح کی مقدار درست کی گئی، اور نتائج سے معلوم ہوا کہ ماڈل گروپ میں چوہوں کے گردے کے ٹشو میں Wnt4، -catenin، renin، اور AGTR1 پروٹینز جمع ہوئے، جبکہ CF نے ان تبدیلیوں کو نمایاں طور پر روکا (تصویر 4b-f) )۔ مزید برآں، CTGF کی اظہار کی سطح بھی واقع تھی اور مقداری تجزیہ کیا گیا تھا۔ مذکورہ بالا نتائج سے ہم آہنگ، CTGF کا اظہار بنیادی طور پر گردوں کی نالیوں میں ہوا، اور CF نے واضح طور پر CTGF (Fig.4d g) کی سرگرمی کو روک دیا۔

CF اور اس کے مرکبات نے D-gal کی طرف سے حوصلہ افزائی NRK-52 E خلیات کی پیدائش کو روک دیا

D-gal-حوصلہ افزائی NRK-52E خلیات CF میں بعض فعال اجزاء کی اسکریننگ کے لیے استعمال کیے گئے تھے، تاکہ CF کے نچوڑ کے ذریعے بزرگ گردوں کے علاج کے لیے مادی بنیاد کا تعین کیا جا سکے۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ CF نے خوراک پر منحصر انداز میں سیل کی عملداری کو بڑھایا اور مرکبات

SDC-0-14,16 اور SDC-1-8 CF سے الگ تھلگ سیل کے پھیلاؤ پر بہتر اثرات مرتب کرتے ہیں۔ اس کے علاوہ، 25 ug/mL CF اور مرکبات SDC-0-14,16 اور SDC-1-8 سبھی نے -galactosidase سرگرمی کو روکنے کا اثر ظاہر کیا (تصویر 5)۔

CF نے SAMP8 چوہوں میں گردے کے ٹشو کے PCA تجزیہ کو بہتر بنایا پرنسپل اجزاء کا تجزیہ (PCA) SAMP8 چوہوں پر CF کے اثرات کو دریافت کرنے کے لیے کیا گیا۔ جیسا کہ تصویر 6a میں دکھایا گیا ہے، کنٹرول اور ماڈل گروپس (R2X=0.542؛ Q2=0.38) کے درمیان ایک واضح گروپ بندی تھی، جو تجویز کرتی ہے کہ SAMP8 چوہوں کے اینڈوجینس میٹابولائٹس SAMR1 سے مختلف تھے۔ چوہے، جس کی وجہ سے وہ SAMR1 گروپ سے ہٹ جاتے ہیں۔ جیسا کہ تصویر 6b میں دکھایا گیا ہے، مختلف CF گروپس بھی کنٹرول اور ماڈل گروپس سے مختلف کلاسوں میں کلسٹر ہوگئے، اور CF گروپس کنٹرول گروپ کے قریب چلے گئے، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ

CF میں مداخلت کرنے والے SAMP8 چوہوں کے endogenous metabolites SAMR1 چوہوں سے ملتے جلتے تھے۔

بحث

CKD کے بڑھنے میں بڑھاپا ایک اہم کردار ادا کرتا ہے [19]۔ جیسے جیسے CKD فائبروسس بڑھتا ہے، سنسنی خیز خلیے پرو فبروٹک عوامل (TGF-، CTGF، وغیرہ) اور سوزش کے حامی عوامل (IL-1، IL-6، TNF-، وغیرہ کا اظہار اور اخراج کرتے ہیں۔ )، جو سنسنی سے وابستہ سیکریٹری فینوٹائپ عوامل ہیں، اس طرح رینل فبروسس کو تیز کرتے ہیں [20، 21]۔ فی الحال، روایتی چینی ادویات نے کم ضمنی اثرات کے ساتھ رینل فبروسس کے علاج میں اچھے نتائج حاصل کیے ہیں [22]۔ اس مطالعہ نے SAMP8 چوہوں میں رینل فبروسس پر CF ایکسٹریکٹ کے مداخلتی اثرات کی کھوج کی۔ اس مطالعے کے لیے منتخب کردہ ماؤس کا تناؤ SAMP8 تھا، جو کہ AKR/ چوہوں کی عمر، سنسنی، اور پیتھولوجیکل فینوٹائپک گریڈنگ اسکور کی بنیاد پر تیار کیا گیا تھا اور یہ صرف جینیاتی اصل [23,24] کا ایک تیز رفتار بڑھاپے کا ماڈل تھا۔ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ SAMP8 چوہوں (9 ماہ) کی گردوں کی پیتھالوجی میں تبدیلیوں میں tubulointerstitial fibrosis اور focal segmental glomerulosclerosis [25] شامل ہیں۔ اور یہ پایا گیا کہ SAMP8 چوہوں میں رینل فبروسس عمر سے متعلق تھا [6]۔ لہذا، ہم نے -galactosidase کی سرگرمی کا تجربہ کیا اور

SAMP8 چوہوں میں رینل فبروسس کی سطح اور پتہ چلا کہ CF-L اور CF-M نے SAMP8 چوہوں میں گردے کے فبروسس اور -galactosidase کی سرگرمی کو بہتر بنایا ہے (تصویر 1)۔ اور ہم نے چوہوں کے پیشاب کی پیداوار کا بھی تجربہ کیا۔ پہلے شائع شدہ مطالعات سے مطابقت رکھتے ہوئے جو اس بات کی نشاندہی کرتے ہیں کہ دو مختلف عملوں سے حاصل کردہ CF میں موتروردک اثرات تھے [13]، اس عرق نے SAMP8 چوہوں کے پیشاب کی مقدار میں نمایاں اضافہ کیا۔ اس کے علاوہ، موجودہ مطالعہ سے پتہ چلتا ہے کہ CF کے ساتھ اضافی رینل فنکشن، اینٹی آکسیڈینٹ انزائمز کی سرگرمی، اور SAMP8 چوہوں (تصویر 2) میں سوزش کے عوامل کی سطح کو بہتر بناتا ہے۔

کیپ1-Nrf2 سسٹم نے حالیہ برسوں میں اپنے اینٹی آکسیڈینٹ اور سوزش کو روکنے والی خصوصیات کی وجہ سے بہت سے اسکالرز کی توجہ حاصل کی۔ گردے کی بیماریوں کے علاج میں اس کی فارماسولوجیکل صلاحیت کا بڑے پیمانے پر غیر طبی اور طبی مطالعات میں مطالعہ کیا گیا تھا [26]۔ Nrf2 ریڈوکس اسٹیٹس اور اینٹی آکسیڈینٹ اثرات سے متعلق جینز کے لیے ایک ماسٹر ٹرانسکرپشن ریگولیٹر ہے [27]۔ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ Nrf2 ایکٹیویشن اور ٹارگٹ جین انڈکشن [28] کے لیے فاسفوریلیشن کی ضرورت ہے۔ Nrf2 کو چالو کرنے سے آکسیڈیٹیو تناؤ کو روکنے اور سیلولر ریڈوکس ہومیوسٹاسس کو برقرار رکھنے کے ذریعے CKD کی ترقی میں بہتری آئی [29]۔ ایک اہم ٹرانسکرپشن عنصر کے طور پر، Nrf2 اپنے بہاو والے اینٹی آکسیڈینٹس اور ڈیٹوکسیفیکیشن انزائمز [30] کو منظم کرکے آکسیڈیٹیو تناؤ کے خلاف دفاع میں ایک اہم کردار ادا کرتا ہے۔ کم وغیرہ۔ نے اطلاع دی ہے کہ resveratrol، ایک طاقتور Nrf2 ایکٹیویٹر کے طور پر، بڑھاپے سے متعلق ترقی پسند گردوں کی چوٹ کو کم کرتا ہے [31]۔ موجودہ مطالعہ میں، CF نے Keapl کے اظہار کی سطح کو متاثر کیے بغیر SAMP8 چوہوں کے گردے میں Nrf2 کی توجہ کو بہتر بنایا، یہ تجویز کرتا ہے کہ CF کروڈ ایکسٹریکٹ Nrf2 کے راستے کو فعال کر کے گردوں میں آکسیڈیٹیو نقصان کو بہتر بنا سکتا ہے (تصویر 3)۔

رینل فبروسس کی خصوصیت ضرورت سے زیادہ ایکسٹرا سیلولر میٹرکس (ECM) جمع ہے جس کی وجہ سے رینل پیرینچیما میں داغ بن جاتے ہیں [32]۔ ٹرانسفارمنگ گروتھ فیکٹر- (TGF-) فائبرو بلاسٹ اوور ایکٹیویشن [33، 34] میں ایک کلیدی سائٹوکائن سمجھا جاتا ہے۔ بلاشبہ، صرف TGF سگنلنگ پاتھ وے کو نشانہ بنانا رینل فبروسس کو کم کرنے کے لیے ناکافی ہے۔ کچھ مطالعات نے اشارہ کیا کہ CTGF، Wnt/ -catenin، renin-angiotensin system، oxidative stress، وغیرہ، رینل فبروسس [35-37] میں ملوث تھے۔ Wnt/ -کیٹنین ایک ارتقائی طور پر محفوظ سگنلنگ راستہ ہے جو ٹشو ہومیوسٹاسس، اعضاء کی نشوونما، اور چوٹ کی مرمت میں شامل ہے[38]۔ Cisternas et al. کنکال کے پٹھوں اور گردے دونوں میں Wnt سگنلنگ کے پرو فائبروٹک اثر پر تبادلہ خیال کیا [39]۔ بڑھتے ہوئے شواہد نے ثابت کیا کہ Wnt/ -catein سگنلنگ پاتھ وے چوٹ کے بعد رینل فبروٹک گھاووں کی نشوونما اور بڑھنے کو منظم کرنے میں ایک اہم کردار ادا کرتا ہے [40-42]۔ صحت مند بالغوں کے گردوں میں Wnt/ -catenin سگنل نسبتاً خاموش ہوتا ہے اور جب گردے مختلف قسم کے نقصانات کا شکار ہو جاتے ہیں تو فعال ہو جاتا ہے [43]۔

ستنداریوں میں، Wnt خاندان میں خاندان کے کم از کم 19 افراد گردے کی نشوونما کے لیے اہم ہیں۔ اور ان میں سے کم از کم 15 خاندان کے افراد عمر رسیدہ گردے میں مختلف طور پر اپ ریگولیٹ ہوتے ہیں، بشمول Wnt4 [6]۔ موجودہ مطالعے کے نتائج سے ظاہر ہوا کہ SAMP8 چوہوں کے گردوں میں Wnt4 پروٹین کی اظہار کی سطح SAMR1 چوہوں کے مقابلے میں نمایاں طور پر زیادہ تھی، جس کی تصدیق مغربی بلاٹ اور امیونو ہسٹو کیمیکل تجزیہ (تصویر 4a، d، اور f) دونوں سے ہوئی تھی۔ اتفاق سے، -کیٹنین پروٹین کے اظہار کی سطح کو بھی بڑھا دیا گیا تھا۔ نیز، Wnt4 اور -catenin دونوں کا اظہار گردوں کے نلی نما اپکلا خلیوں میں کیا گیا تھا، جیسا کہ امیونو ہسٹو کیمیکل تجزیہ (تصویر 4a اور f) سے ظاہر ہوتا ہے۔ Wnt/ -کیٹنین نے متعدد فائبروجینک جینز جیسے کہ RAS اجزاء، میٹرکس میٹالوپروٹینیز-7 (MMP-7)، پلازمینوجن ایکٹیویٹر انہیبیٹر 1 (PAI-1)، اور Snail [37] کو شامل کرکے رینل فبروسس کو نکالا۔ ] چاؤ وغیرہ۔ Wnt/ -catenin کو بڑے اپ اسٹریم ریگولیٹر کے طور پر بیان کیا گیا ہے، جو گردوں میں تمام ٹیسٹ شدہ RAS اجزاء کے اظہار کو کنٹرول کرتا ہے [44]۔ Zhou et al. نے دماغ اور گردے میں RAS کے بڑے اجزاء جیسے انجیوٹینینوجن، اینجیوٹینسن کو تبدیل کرنے والے انزائم، اور انجیوٹینسین II AT{{25 }} رسیپٹر کو نمایاں طور پر اپ ریگولیٹ کیا گیا تھا۔ اپریگولیٹڈ ایکسپریشن لیول کو Wnt کے ایک سنٹرل بلاکر نے روکا تھا، جو ایک اڈینو سے وابستہ وائرس ویکٹر تھا جو DKK1 جین [45] کو زیادہ متاثر کرتا تھا۔ اسی طرح، موجودہ مطالعہ سے پتہ چلا ہے کہ AGTR1 کا اظہار گردوں کے نلی نما اپیتھیلیم میں اب بھی ہوتا ہے، اور SAMP8 چوہوں کے گردے کے ٹشوز میں renin اور AGTRl کے اظہار کی سطح SAMR1 چوہوں (تصویر 4a اور dg) کے مقابلے میں نمایاں طور پر زیادہ تھی۔ ان نتائج نے اشارہ کیا کہ Wnt/ -catenin/RAS سگنلنگ پاتھ وے کو SAMP8 چوہوں کے گردوں میں چالو کیا گیا تھا، اور CF نے مؤثر طریقے سے اس راستے کو چالو کرنے سے روکا تھا۔

CTGF متعدد حیاتیاتی افعال کا استعمال کرتا ہے، بشمول کیموٹیکٹک خلیوں کے مائٹوسس کو فروغ دینا، آسنجن کو دلانا، اور سیل کے پھیلاؤ اور ECM ترکیب کو فروغ دینا [35,46]۔ CCN2(CTGF) ماڈیولڈ Wnt سگنلنگ کو کم کثافت لیپوپروٹین ریسیپٹر سے متعلق پروٹین 5/6 (LRP5/6) سے منسلک کرکے مزید فبروسس میں ثالثی کرتا ہے [39, 47]۔ دیگر مطالعات میں یہ دریافت کرنے اور تصدیق کرنے کے لیے جین کی خاموشی کا استعمال کیا گیا کہ Nrf2 نے CTGF کے اظہار کی سطح کو ریگولیٹ کر کے Wnt کے راستے کو ریگولیٹ کیا، جس سے گردوں کی بیچوالا بیماری متاثر ہوتی ہے۔ نیز، Nrf2 نے CTGF ٹرانسکرپشن لیول کو بنیادی طور پر CTGF ٹرانسکرپشن ریگولیٹر c-Fos [48] کے ذریعے منظم کیا۔ امیونو ہسٹو کیمیکل تجزیہ نے انکشاف کیا کہ CTGF اور pc-Fos کا اظہار بنیادی طور پر گردوں کے نلی نما اپکلا خلیوں میں کیا گیا تھا، اور pc-Fos کو گلوومیرولی میں بھی تقسیم کیا گیا تھا۔ مقداری تجزیے سے معلوم ہوا کہ دونوں پروٹینوں کے اظہار کی سطح کو CF(Figs.3b اور e اور 4a اور c) کے ذریعے روکا گیا تھا۔ آخر میں، PCA تجزیہ کو مزید تصدیق کرنے کے لیے استعمال کیا گیا کہ CF نے SAMP8 چوہوں (تصویر 6) میں گردے کے نقصان کو بہتر کیا۔ موجودہ مطالعہ نے اس بات کا ثبوت فراہم کیا کہ CF نے نہ صرف Nrf2 سگنلنگ کو چالو کیا بلکہ آکسیڈیٹیو تناؤ اور سوزش کو متوازن کرنے کے لیے Nrf2 پر انحصار کیا، Wnt/-catenin/RAS سگنلنگ کو روکا، اور گردوں کی عمر بڑھنے اور رینل فبروجنیسیس کو بہتر بنایا۔ تاہم، ہمیں اس تجربے میں میسن اور SA- -گیل سٹیننگ پر CF کے اثر میں متضاد بہتری بھی ملی۔ یہ قیاس کیا جاتا ہے کہ یہ SAMP8 چوہوں میں گردوں کی عمر بڑھنے اور رینل فبروسس کی متضاد ترقی کی وجہ سے ہوسکتا ہے۔ اس تجربے میں چوہوں میں گردوں کی عمر بڑھنے کی ڈگری فائبروسس سے زیادہ سنگین ہو سکتی ہے۔ لہذا، SAMP8 چوہوں میں گردوں کی عمر بڑھنے پر CF-H کا بہتر اثر رینل فبروسس کی طرح واضح نہیں تھا۔

monosaccharide کو کم کرنے والے کے طور پر، D-galactose وسیع پیمانے پر عمر سے متعلق مختلف بیماریوں میں Vivo اور in Vitro میں استعمال ہوتا ہے۔ D-gal NRK-52E خلیات [49] میں سنسنی اور چوٹ کا سبب بنتا ہے، انسانی گردے کے قربت والے نلی نما اپکلا خلیات (HKC-8 خلیات) کے جوش پیدا کرتا ہے، اور دو گردوں کے اظہار کی سطح کو بڑھاتا ہے۔ فبروسس مارکر پروٹینز FN اور a-SMA [6]۔ اس تحقیق میں، D-gal کا استعمال NRK-52E خلیوں کو وٹرو میں لانے کے لیے کیا گیا تھا۔ CF سے الگ تھلگ مرکبات کا پتہ لگانے کے لیے MTT پرکھ اور -galactosidase staining کا استعمال کرتے ہوئے، یہ پتہ چلا کہ SDC-0-14,16 اور SDC-1-8 نے D-gal کی طرف سے حوصلہ افزائی کی سیل کی عملداری کو بڑھایا اور D-gal-حوصلہ افزائی کو روک دیا۔ سیل سنسنینس (تصویر 5)۔ اس نے تجویز کیا کہ SDC-0-14,16 اور SDC-1-8 گردے کی عمر میں تاخیر کرنے کے لیے CF کی مادی بنیاد ہو سکتی ہے۔ SDC-1-8 phenylethanoid glycosides میں سے ایک ہے۔ phenylethanoid glycosides پایا گیا جو Caenorhabditis Elegans [50] کی عمر کو بڑھاتا ہے، جس میں بڑھاپا مخالف، [51] اور نیورو پروٹیکٹو اثرات [52-54] ہوتے ہیں۔ یہ CF کے فارماسولوجیکل اثرات پر ہمارے فالو اپ مطالعہ کے لیے ایک سمت فراہم کرتے ہیں۔

نتائج

آخر میں، Vivo کے مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ CF نے بزرگ چوہوں میں رینل فبروسس کو کم کیا۔ وٹرو تجربات میں کچھ ممکنہ فعال اجزاء پائے گئے۔ ان نتائج نے CF کا استعمال کرتے ہوئے گردے کی بیماری کے علاج کے لیے فارماسولوجیکل مدد فراہم کی اور CF کے فعال اجزاء پر مزید تحقیق کے لیے ایک سمت فراہم کی۔

یہ مضمون Cao et al سے ماخوذ ہے۔ BMC تکمیلی دوا اور علاج (2022) 22:52