Hypoxia اور Reoxygenation سے زخمی ہونے والے اینڈوتھیلیل سیلز پر Quercetin کا ​​حفاظتی اثر

مزید معلومات کے لیے رابطہ کریں۔tina.xiang@wecistanche.com

پس منظر: دماغی چھوٹے برتنوں کی بیماری (CSVD) کلینیکل سنڈروم کا ایک گروپ ہے جو دماغ میں چھوٹے برتنوں کے تمام پیتھولوجیکل عمل کا احاطہ کرتا ہے، جو فالج اور سنگین ڈیمنشیا کا سبب بن سکتا ہے۔ تاہم، چونکہ CSVD کا روگجنن واضح نہیں ہے، اس لیے علاج محدود ہے۔ اینڈوتھیلیل سیل کی خرابی طبی علامات جیسے ہائی بلڈ پریشر اور لیوکوسس سے پہلے ہوتی ہے۔ لہذا، endothelial خلیات کے علاج ایک نئی پیش رفت کی توقع ہے.Quercetin, ایک قسم کے پودوں میں موجود flavonoid، سوزش اور اینٹی آکسیڈیشن کا کام کرتا ہے۔ اس مطالعے کا مقصد اینڈوتھیلیل سیل کی چوٹ پر quercetin کے حفاظتی اثر کی چھان بین کرنا اور کلینک میں بعد میں اطلاق کے لیے ایک بنیادی نظریہ فراہم کرنا ہے۔

طریقے: انسانی دماغ کے مائیکرو واسکولر اینڈوتھیلیل سیلز (HBMECs) کو وٹرو میں کلچر کیا گیا تھا، اور اینڈوتھیلیل سیلز کے چوٹ کا ماڈل ہائپوکسیا اور ری آکسیجنیشن (H/R) کے ذریعے قائم کیا گیا تھا۔ HBMECs پر quercetin کے حفاظتی اثرات کا مطالعہ سیل کی قابل عملیت، سیل کی منتقلی، angiogenesis، اور apoptosis کے نقطہ نظر سے کیا گیا۔ quercetin کے طریقہ کار کا مزید مطالعہ کرنے کے لیے،اوکسیڈیٹیو تناؤاور اینڈوپلاسمک ریٹیکولم تناؤ کا تجزیہ کیا گیا۔ مزید کیا ہے، خون کے دماغ کی رکاوٹ (BBB) ​​کی سالمیت کا بھی مطالعہ کیا گیا تھا۔

نتائج: QuercetinHBMECs کی عملداری، منتقلی، اور انجیوجینیسیس کو فروغ دے سکتا ہے، اور apoptosis کو روک سکتا ہے۔ اس کے علاوہ، quercetin Keap1/Nrf2 سگنلنگ پاتھ وے کو بھی چالو کر سکتا ہے، ATF6/GRP78 پروٹین ایکسپریشن کو کم کر سکتا ہے۔ مزید مطالعہ سے پتہ چلتا ہے کہ quercetin Claudin-5 اور Zonula occludens-1 کے اظہار کو بڑھا سکتا ہے۔

نتائج: ہمارے تجربات سے پتہ چلتا ہے کہ quercetin H/R سے HBMECs کی حفاظت کر سکتا ہے، جس میں سیل کے پھیلاؤ، خلیے کی منتقلی، اور انجیوجینیسیس کو فروغ دینا، مائٹوکونڈریل جھلی کے ممکنہ نقصان کو کم کرنا اور سیل اپوپٹوسس کو روکنا شامل ہے۔ یہ اس کے اینٹی آکسیڈیشن اور اینڈوپلاسمک ریٹیکولم تناؤ کی روک تھام سے متعلق ہوسکتا ہے۔ ایک ہی وقت میں، quercetin BBB connexin کی سطح کو بڑھا سکتا ہے، یہ تجویز کرتا ہے کہ quercetin BBB کی سالمیت کو برقرار رکھ سکتا ہے۔

مطلوبہ الفاظ: دماغی چھوٹے برتنوں کی بیماری، اینڈوتھیلیل خلیات، کوئرسیٹن، آکسیڈیٹیو تناؤ، اینڈوپلاسمک ریٹیکولم تناؤ، خون دماغی رکاوٹ

تعارف

دماغی چھوٹے برتنوں کی بیماری(CSVD) ایک چھتری کی اصطلاح ہے جو دماغ میں چھوٹے برتنوں پر مشتمل تمام پیتھولوجیکل عمل کو گھیرے ہوئے ہے اور اس سے مراد کلینیکل، امیجنگ، اور پیتھولوجیکل سنڈروم کے ایک گروپ سے ہے جس میں مختلف ایٹولوجیز شامل ہیں جن میں انٹرا کرینیئل آرٹیریولز ٹو وینیولز (قطر) ہوتے ہیں۔<400 μm）（wardlaw="" et="" al,2013;="" wardlaw="" et="" al,2019).="" the="" most="" common="" symptoms="" include="" mainly="" new-onset="" subcortical="" small="" infarcts,="" lacunar="" foci="" of="" vascular="" origin,="" cerebral="" white="" matter="" hyperintensities,="" microbleeds,="" cerebral="" atrophy,="" and="" enlarged="" perivascular="" spaces="" (wardlaw="" et="" al,2013).="" with="" the="" progression="" of="" the="" disease,="" subclinical="" and="" early-stage="" patients="" can="" have="" emotional="" abnormalities,="" gait,="" memory,="" disorientation,="" and="" even="" stroke="" and="" dementia="" and="" other="" serious="" consequences.="" up="" to="" 25%="" of="" stroke="" and="" 45%="" of="" dementia="" are="" caused="" by="" csvd(cannistraro="" et="" al,2019),="" which="" brings="" a="" heavy="" socioeconomic="" burden="" and="" is="" a="" major="" problem="" that="" needs="" to="" be="" addressed="" by="" slow="" disease="" and="" health="" strategies.="" scholar="" has="" used="" dynamic="" contrast="" enhanced-mri="" technique="" to="" find="" that="" blood-brain="" barrier(bbb)leakage="" is="" more="" prevalent="" in="" csvd="" patients(zhang="" et="" al,2017).="" extravasation="" of="" blood="" components="" may="" lead="" to="" local="" vascular="" changes="" and="" diffuse="" brain="" tissue="" damage.="" the="" bbb="" is="" a="" junction="" of="" endothelial="" cells,="" pericytes,="" and="" astrocyte="" tight="" junctions(keaney="" and="" campbell,="" 2015).in="" addition,="" more="" and="" more="" scholars="" also="" believe="" that="" endothelial="" dysfunction="" plays="" a="" key="" role="" in="" the="" early="" development="" of="" csvd="" (hainsworth="" et="" al,2015).="" therefore,="" protecting="" endothelial="" cells="" may="" be="" a="" potential="" therapeutic="" strategy="" for="">

Quercetinایک فلیوونائڈ ہے جو کئی پودوں میں موجود ہے، جیسے کہ Polygonum cuspidatum Sieb۔ et Zucc میں مضبوط اینٹی آکسیڈینٹ اور سوزش سے بچنے والی سرگرمیاں ہیں اور یہ مختلف پیتھولوجیکل حالات میں حفاظتی اثرات ڈال سکتی ہیں جن میں قلبی بیماری، میٹابولک عوارض، نیوروڈیجینریٹو امراض، ذیابیطس، کینسر، اور موٹاپا شامل ہیں (Dok-Go et al, 2003; Comalada et al,2005; Cho et al، 2006)۔ quercetin کے ساتھ پہلے سے علاج نے اسکیمیا سے متاثرہ جانوروں کے ہپپوکیمپل CA1 پرامڈل نیورونز میں اینڈوجینس اینٹی آکسیڈینٹ انزائمز کے اظہار کی سطح میں نمایاں اضافہ کیا، جو مضبوط اینٹی آکسیڈینٹ اور نیورو پروٹیکٹو اثرات دکھاتے ہیں (چن ایٹ ال، 2017)۔ حالیہ مطالعات سے یہ بھی پتہ چلا ہے کہ بی بی بی کی سالمیت کو برقرار رکھتے ہوئے کوئرسٹین کے اسکیمک چوٹ کے خلاف نیورو پروٹیکٹو اثرات ہوتے ہیں (جن ایٹ ال، 2019)۔ تاہم، ہائپوکسیا اور ری آکسیجنیشن (H/R) چوٹ کے تحت دماغ کے مائیکرو واسکولر اینڈوتھیلیل سیلز (BMECs) پر اس کے اثرات کا اچھی طرح سے مطالعہ نہیں کیا گیا ہے، اور BMECs کی حفاظت کرنے والے quercetin کے ہدف پروٹین کی اطلاع نہیں ملی ہے۔

ہمارے مطالعے میں، ہم نے ثقافت میں H/R کے ذریعے زخمی ہونے والے انسانی دماغ کے مائکرو واسکولر اینڈوتھیلیل سیلز (HBMECs) پر quercetin کے حفاظتی اثر کو دریافت کیا۔ اسی وقت، ہم نے اس کے حفاظتی اثر کے ممکنہ طریقہ کار کا مزید مطالعہ کیا، تاکہ quercetin کے طبی فروغ کے لیے مزید نظریاتی بنیاد فراہم کی جا سکے اور CSVD کے علاج کے لیے نئے آئیڈیاز فراہم کیے جا سکیں۔

مواد اور طریقے

میڈیا، ری ایجنٹس، اور اینٹی باڈیز

Quercetin(purity>98 فیصد) بیسٹ بائیولوجیکل ٹیکنالوجی کمپنی لمیٹڈ (چینگڈو، چین) سے حاصل کیا گیا تھا۔ HBMECs کو Qingqi Biotechnology Development Co., Ltd (شنگھائی، چین) سے خریدا گیا تھا۔ فیٹل بوائن سیرم (FBS) حیاتیاتی صنعتوں (Kibbutz Beit Haemek، اسرائیل) سے حاصل کیا گیا تھا۔ Penicillin/streptomycin اور Dulbecco کا ترمیم شدہ ایگل میڈیم (DMEM) Hyclone (GA, United States) سے خریدا گیا تھا۔ مائٹوکونڈریل میمبرین پوٹینشل (JC-1)ٹیسٹ کٹ، BCA پروٹین ٹیسٹ کٹ، 2،7-dichloride-hydro fluorescein diacetate (DCFH-DA)، اور NP40 lysate Beyotime Biotechnology سے خریدے گئے تھے۔ (شنگھائی، چین)۔ فاسفیٹیز کی تیاری اور مکمل پروٹیز روکنے والا روچے (شنگھائی، چین) سے خریدا گیا تھا۔ Apoptosis Kit BD بایوسینسز (Sparks, MD, United States) سے خریدی گئی تھی۔ Malondialdehyde (MDA)، Superoxide dismutase (SOD)، Intercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1), Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM{{10}} )انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ (ELISA) تھا (کیمبرج، Abcam نے d1"一United Kingdom سے خریدی کمپنی)۔ نیوکلیئر فیکٹر E{13}}متعلقہ فیکٹر 2(Nrf2) کے خلاف اینٹی باڈیز، کیلچ لائیک ECH ایسوسی ایٹڈ پروٹین 1 (Keap1)، ٹرانسکرپشن فیکٹر 6 (ATF6) کو چالو کرنا، گلوکوز ریگولیٹڈ پروٹین 78 (GRP78)، Zonula occludens 1 (ZO-1)، Claudin-5، GAPDH سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی (ڈینورس، ریاستہائے متحدہ) سے خریدا گیا تھا۔ ہارسریڈش پیرو آکسیڈیز (HRP) سے کنجوگیٹڈ اینٹی خرگوش IgG جیکسن کمپنی (پنسلوانیا، امریکہ) سے حاصل کیا گیا تھا۔ SDS-PAGE ریپڈ ڈسپنسنگ کٹ اور ECL کروموجینک محلول EpiZyme بائیو ٹیکنالوجی (شنگھائی، چین) سے خریدا گیا تھا۔ سیل کلچر اور انجری ماڈل HBMEC ماڈل۔ DMEM میں کلچر کیا گیا تھا جس میں 10 فیصد FBS اور 1 فیصد penicillin-streptomycin، 37Cincubator پر 5 فیصد CO2 کے ساتھ۔ ial سیل کو پہنچنے والے نقصان، HBMECs کا علاج 12 h ہائپوکسیا کے ساتھ کیا گیا جس کے بعد 8 h reoxygenation کی گئی، اور مخصوص طریقہ کار مندرجہ ذیل تھے (Warpsinski et al., 2020): HBMECs کو پہلی بار ہائپوکسیا انکیوبیٹر میں سیرم فری میڈیم کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا (1 فیصد O,5 فیصد CO.94 فیصد N) 12 گھنٹے کے لیے، اور پھر میڈیم کو 10 فیصد FBS پر مشتمل نارمل میڈیم میں تبدیل کر دیا گیا، جب کہ انہیں نارموکسیا انکیوبیٹر (95 فیصد O2,5 فیصد CO2) میں 8 گھنٹے کے لیے انکیوبیٹ کیا گیا۔ Quercetin علاج 2 mg Quercetin کو 331μL DMSO میں تحلیل کر کے 1 mmol/L کے ارتکاز کے ساتھ ایک سٹاک محلول بنایا گیا اور اسے -20 ڈگری ڈگری پر ذخیرہ کیا گیا۔ کام کرنے والے محلول کو DMEM کے ساتھ 0.1,0.5,1,2,5,10umol/L پر گھٹا دیا گیا، جس میں DMSO کا فیصد 0.1 فیصد سے کم تھا۔ ایک بار جب خلیات کی پیروی کی گئی تھی، سیرم فری میڈیم کے ساتھ quercetin شامل کیا گیا تھا، اور پلیٹوں کو بعد میں ہائپوکسیا انکیوبیٹر میں رکھا گیا تھا. 12 گھنٹے کے بعد، خلیوں کو ہٹا دیا گیا، سیرم میڈیم کے ساتھ quercetin میں تبدیل کر دیا گیا، اور 8 گھنٹے کے لیے نارموکسیا انکیوبیٹر میں رکھا گیا۔

سیل وائبلٹی پرکھ

کے اثراتquercetinHBMECs کی عملداری پر آپریٹر کے دستور کے مطابق سیل کاؤنٹنگ کٹ-8 کے ذریعے جانچ کی گئی۔ اینڈوتھیلیل خلیوں کو پہنچنے والے نقصان کی عدم موجودگی میں خلیات کو quercetin کی محفوظ خوراکوں کا پہلے جائزہ لیا گیا، اور پھر خلیوں کے نقصان کی حالت میں اس کے حفاظتی اثرات کا جائزہ لیا گیا۔ تمام تجرباتی نتائج کو کم از کم تین بار دہرایا گیا۔

سکریچ ہیلنگ اور ٹیوب فارمیشن پرکھ کی منتقلی کے تجربات سیل سکریچ کے طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے۔ quercetin کے علاج سے پہلے، کلچر پلیٹ کے نیچے ایک سیدھی سیدھی لکیر کھینچی گئی تھی اور 0 h کے لیے ریکارڈنگ کے لیے تصویر کشی کی گئی تھی، اور بعد میں سیلز کو ریکارڈنگ کے لیے تصاویر لینے سے پہلے quercetin اور ماڈلنگ ٹریٹمنٹ کا نشانہ بنایا گیا تھا۔ پچھلے اور پچھلے حصے دو بار متضاد تھے۔

ٹیوب کی تشکیل سیل انجیوجینک صلاحیت کی نقل کرتے ہوئے، میٹریجل (9-12mg/ml) کو کلچر پلیٹ کے نیچے رکھا گیا، پھر quercetin اور ماڈلنگ کے علاج شدہ خلیوں کو اوپر چڑھایا گیا، 8 گھنٹے کے بعد، تصاویر لی گئیں۔ امیج جے کا استعمال کرتے ہوئے خون کی وریدوں کی شاخوں کی نسل کا تجزیہ اور موازنہ کیا گیا۔

مائٹوکونڈریل جھلی کے امکانات اور اپوپٹوس پرکھ

سیل اپوپٹوسس کا پتہ لگانے کے لئے مائٹوکونڈریل جھلی کی ممکنہ تبدیلی اور اپوپٹوس کٹ کا استعمال کیا گیا تھا۔ JC-1 فلوروسینٹ پروب کے ساتھ HBMECs کو داغ لگا کر مائٹوکونڈریل جھلی کی صلاحیت کی تبدیلی کا پتہ چلا۔ JC-1(1×) سٹیننگ ورکنگ سلوشن شامل کیا گیا اور اسے 20 منٹ کے لئے 37 ڈگری سنکیوبیٹر میں JC-1(1×) سٹیننگ بفر سے دھونے سے پہلے اور آخر میں پی بی ایس کے لئے ہر کنویں میں شامل کیا گیا۔ . پھر، اعلی مواد سیل امیجر تجزیہ کے لئے استعمال کیا گیا تھا.

HBMECs کو 6-کنویں کی پلیٹوں سے اکٹھا کیا گیا تھا، سپرناٹینٹ کو ہٹانے کے لیے سینٹرفیوگ کیا گیا تھا، اس کے بعد خلیات کو پھونکنے اور مکس کرنے کے لیے 1 × Annexin V بائنڈنگ سلوشن شامل کریں، پھر FITC Annexin V ڈائی شامل کریں تاکہ کمرے کے درجہ حرارت پر اندھیرے میں 10 تک انکیوبیٹ کر سکیں۔ منٹ، مشین سے 5 منٹ پہلے پروپیڈیم آئوڈائڈ (PI) سٹیننگ سلوشن شامل کریں، اور بیک مین فلو سائٹو میٹر کا پتہ لگانے کے لیے لگایا گیا تھا۔

ایلیسا

خلیوں کا H/R یا quercetin کے ساتھ علاج کرنے کے بعد، سپرنٹنٹ کو جمع کیا گیا۔ ICAM-1, VCAM-1, SOD، اور MDA کا پتہ چلا آپریٹر کے دستور کے مطابق ELSA کٹس کا استعمال کرتے ہوئے۔

Reactive Oxygen Species (ROS) Assay ROS جنریشن کی صلاحیت کا پتہ DCFH-DA پروب کے ذریعے لگایا گیا تھا، جس کا اندازہ اعلیٰ مواد کے سیل امیجر کے ذریعے کیا گیا تھا، اور امیج جے کا استعمال کرتے ہوئے فلوروسینس کے ذریعے تجزیہ کیا گیا تھا۔ ویسٹرن بلاٹنگ

HBMECs کو کلچر پلیٹوں سے جمع کیا گیا تھا، NP40 lysate شامل کرنے والی فاسفیٹیز تیاری اور مکمل protease inhibitor کو خلیوں سے پروٹین نکالنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ پروٹین کے مواد کا تعین کیا گیا تھا اور امیونوبلوٹنگ کے تجربات کے لیے 30ug پروٹین لیا گیا تھا۔ SDS-PAGE جیل الیکٹروفورسس کے لیے استعمال کیا گیا تھا، کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹے کے لیے PVDF جھلی میں الیکٹرو ٹرانسفر کے بعد 5 فیصد نان فیٹ خشک دودھ کے ساتھ بلاک کر دیا گیا تھا۔ پھر اینٹی این آر ایف 2(خرگوش، 1:1،000)، اینٹی کیپل(خرگوش،1:1،000)، اینٹی اے ٹی ایف 6(خرگوش،1:1،000 )، اینٹی جی آر پی 78(خرگوش,1:1,000), اینٹی ZO-1(خرگوش,1:1,000), اینٹی کلاڈین-5( rabbit,1:1,000) اینٹی باڈیز کو راتوں رات 4C پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ اگلے دن دھونے کے بعد، بکرے کے مخالف خرگوش کے ثانوی اینٹی باڈیز (IgG HRP, 1:10,000) کو شامل کیا گیا اور 1 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ آخر میں، TBST میں تین بار دھونے کے بعد پتہ لگانے کو تیار کیا گیا تھا.

پروٹومک تجزیہ

HBMECs کا علاج H/R کے ساتھ quercetin (l umol/L) کی موجودگی میں کیا گیا۔ اس کے بعد، خلیات کو سیل سکریپر کے ساتھ کلچر پلیٹ سے آہستہ سے کھرچ دیا گیا، کریوویئلز میں جمع کیا گیا، جلدی سے مائع نائٹروجن میں رکھا گیا، اور پھر 5 منٹ کے لیے -80 ڈگری پر ذخیرہ کیا گیا iTRAQ ٹیکنالوجی کا استعمال پروٹومک تجزیہ کرنے کے لیے کیا گیا، پی ویلیو کے ساتھ پروٹین<0.05 and="" ratio="" multiple="" changes="">1.2 یا<0.83 were="" defined="" as="" differentially="" expressed="">

شماریاتی تجزیہ

ڈیٹا عام تقسیم کے ساتھ فٹ تھا، اور ڈیٹا کو ظاہر کرنے کے لیے ± معیاری انحراف کا مطلب استعمال کیا گیا تھا۔ گراف پیڈ پرزم 8 شماریاتی تجزیہ کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ ٹی ٹیسٹ کے ذریعہ دو آزاد نمونوں کا تجزیہ کیا گیا تھا، اور پیمائش کے اعداد و شمار کو اوسط ± معیاری انحراف (SD) کے ذریعہ بیان کیا گیا تھا۔ گروپوں کے درمیان موازنہ تغیرات کے یک طرفہ تجزیہ (ANOVA) کے ذریعے کیا گیا تھا۔ p-value<0.05 indicated="" that="" the="" difference="" was="" statistically="">

نتائج

نتائج

سیل کی قابل عملیت پر Quercetin کا ​​اثر

خلیے کی عملداری پر quercetin کے اثر کو جانچنے کے لیے، ہم نے سب سے پہلے خلیات پر quercetin کی محفوظ خوراک کی جانچ کی، جیسا کہ شکل 1A میں دکھایا گیا ہے، جس کا 0 پر سیل کی عملداری پر کوئی اثر نہیں پڑا۔{2}} umol/L . اس کے بعد، اینڈوتھیلیل سیل کو پہنچنے والے نقصان کی بنیاد پر ایک مؤثر خوراک کی تلاش کے لیے، ہم نے دکھایا کہ quercetin کو 0 پر۔ 1B اس کے بعد کے تجربات اس ارتکاز کی حد کے ارد گرد کئے گئے۔ یہ بات قابل غور ہے کہ جب منشیات کا ارتکاز 10 μmol/L تک پہنچ گیا تو سائٹوٹوکسائٹی ظاہر ہوئی۔ ہم نے سوچا کہ جب HBMECs کو H/R سے نقصان پہنچا تو ان کی برداشت کم ہو جاتی ہے۔ لہذا، جب منشیات کی حراستی تھوڑی زیادہ تھی، تو خلیات کو پہنچنے والے نقصان میں اضافہ ہوا. لہذا، سائٹوٹوکسٹی اس وقت ہوتی ہے جب دوائیوں کا ارتکاز 10 μmol/L ہو۔

سیل ہجرت اور انجیوجینیسیس پر Quercetin کا ​​اثر

اینڈوتھیلیل خلیوں کی ہجرت اور انجیوجینک صلاحیتوں پر کوئرسیٹن کے اثرات کی جانچ کرنے کے لیے، ایچ بی ایم ای سی کو ایچ/ آر علاج کا نشانہ بنایا گیا جب کہ کوئرسیٹن کا انتظام کیا گیا۔ ہم نے سیل کی منتقلی کی صلاحیت کو جانچنے کے لیے ایک سکریچ پرکھ کا مظاہرہ کیا، جس سے معلوم ہوا کہ H/R علاج نے کنٹرول کے مقابلے H/R-HBMECs کی منتقلی کی صلاحیت کو کمزور کر دیا، اور quercetin 0 کے ارتکاز میں سیل کی منتقلی کو نمایاں طور پر فروغ دے سکتا ہے۔ {2}} μmol/L Tubulogenesis کا استعمال وٹرو انجیوجینیسیس میں نقل کرنے کے لیے کیا گیا تھا، اور اس کی شاخ کی لمبائی انجیوجینک صلاحیت کی نمائندگی کرتی ہے۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ H/R علاج کے نتیجے میں انجیوجینک صلاحیت میں کمی آئی، لیکن quercetin 0.1-1 μmol/L اس چوٹ کو ریورس کر سکتا ہے، جیسا کہ شکل 2 میں دکھایا گیا ہے۔

سیل اپوپٹوس پر Quercetin کا ​​اثر

اینڈوتھیلیل سیل اپوپٹوس کو روکنے کے لیے کوئرسیٹن کی صلاحیت کو جانچنے کے لیے، ہم نے مائٹوکونڈریل میمبرین پوٹینشل اور اپوپٹوسس کو تشخیص کے لیے استعمال کیا۔ جب خلیے اپوپٹوٹک واقعات سے گزرنے کے لیے زخمی ہوئے تھے، مائٹوکونڈریل جھلی کی صلاحیت کو کم کر دیا گیا تھا، سائٹوپلاسمک ریڈ فلوروسینس کو نمایاں طور پر کم کر دیا گیا تھا، گرین فلوروسینس میں اضافہ کیا گیا تھا، اور آخر کار سرخ/سبز (R/G) کو اپنایا گیا تھا تاکہ مائٹوکونڈریل جھلی کی صلاحیت کی تبدیلی کی نمائندگی کی جا سکے۔ جب مائٹوکونڈریل جھلی کی صلاحیت سے سمجھوتہ کیا جاتا ہے تو اس میں کمی واقع ہوگی۔ ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ H/R علاج کے بعد، خلیوں کی مائٹوکونڈریل جھلی کی صلاحیت میں کمی واقع ہوئی، جیسا کہ سبز فلوروسینس میں اضافہ سے ظاہر ہوتا ہے۔ quercetin کی بڑھتی ہوئی خوراک کے ساتھ، سرخ فلوروسینس کو مسلسل بڑھایا گیا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ quercetin خوراک پر منحصر مائٹوکونڈریل جھلی کی صلاحیت کو بڑھا سکتا ہے (شکل 3A، C)۔ مزید، سیل اپوپٹوسس کی براہ راست جانچ کرنے کے لیے فلو سائٹوومیٹری کا استعمال کیا گیا تھا۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ HBMECs نے H/R علاج کے بعد apoptosis کی بلند شرح کی نمائش کی، جبکہ quercetin at 0.1-1 umol/L نے apoptosis کو روکنے کی واضح صلاحیت کا مظاہرہ کیا (شکل 3B, D)۔

سیل آسنجن پر Quercetin کا ​​اثر

ایک بار اینڈوتھیلیل سیلز کو نقصان پہنچنے کے بعد، کچھ چپکنے والے مالیکیولز، جیسے ICAM{{0}} اور VCAM-1 پیدا ہوتے ہیں، جو BBB میں زہریلے مادوں کو جذب کرتے ہیں، اور دماغی پیرینچیما کو نقصان پہنچاتے ہیں (Hauptmann et al,2020) .H/R-HBMECs کی آسنجن مالیکیولز پیدا کرنے کی صلاحیت پر quercetin کے اثر کو جانچنے کے لیے، ICAM-1 اور VCAM-1 کو ELISA کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا۔ ہمارے مطالعے میں، H/R کے نتیجے میں ICAM-1 اور VCAM-1 کی سطح میں اضافہ ہوا، لیکن 0. 4)۔

Quercetin آکسیڈیٹیو تناؤ کو روک سکتا ہے۔

Quercetin مضبوط اینٹی آکسیڈینٹ صلاحیت کے ساتھ ایک flavonoid ہے، لہذا ہم نے ROS کا پتہ لگانے کے لیے DCFH-DA تحقیقات کا استعمال کیا۔ ہم نے مشاہدہ کیا۔

H/R کے سامنے آنے والے HBMECs میں ROS کی پیداوار میں اضافہ، جو کہ {{0}} کے ارتکاز پر quercetin کے علاج سے واضح طور پر کم ہوا تھا۔ پروڈکٹس SOD اور MDA ELISA کے ساتھ، اور نتائج سے ظاہر ہوا کہ quercetin 01-1 μmol/L SOD اور MDA کو کم کرنے کے قابل تھا، جو H/R کے ذریعے بلند کیے گئے تھے، اس طرح یہ ظاہر ہوتا ہے کہ quercetin کم کر سکتا ہے۔ آکسیڈیٹیو تناؤ سے HBMECs کا نقصان (شکل 5)۔

Quercetin Keap1/Nrf2 اور ATF6/GRP78 پروٹین کو ریگولیٹ کر سکتا ہے

HBMECs پر quercetin کے حفاظتی طریقہ کار کو مزید دریافت کرنے کے لیے، ہم نے اظہار کی سطحوں کا تجزیہ کیا۔اوکسیڈیٹیو تناؤاور اینڈوپلاسمک ریٹیکولم تناؤ سے متعلق پروٹین۔ Keap1/Nrf2 Vivo میں اینٹی آکسیڈینٹ ردعمل کو منظم کرنے کے لیے جانا جاتا ہے۔ آکسیڈیٹیو تناؤ کی چوٹ اینڈوتھیلیل خلیوں کو تناؤ کے ردعمل سے گزرنے پر مجبور کرتی ہے، جس کے نتیجے میں Keapl/Nrf2 کی سطح بڑھ جاتی ہے (وارپسنسکی ایٹ ال، 2020)۔ موجودہ مطالعہ میں، H/R کے نتیجے میں سیلولر اینٹی آکسیڈینٹ رسپانس میکانزم کو چالو کیا گیا اور Keapl اور Nrf2 کی سطح میں اضافہ ہوا، جسے 05-1 umol/L پر quercetin کے ذریعے HBMECs کی اینٹی آکسیڈینٹ صلاحیت کو بڑھانے کے لیے مزید مضبوط کیا جا سکتا ہے۔ .ATF6/GRP78 ان راستوں میں سے ایک ہے جو اینڈوپلاسمک ریٹیکولم (ER) ہومیوسٹاسس کو منظم کرتا ہے۔ ER تناؤ اینڈوتھیلیل سیل کی چوٹ کو بڑھا سکتا ہے (Nie et al, 2020)۔ ہمارے مطالعے میں، ER تناؤ کو H/R کے ذریعے چالو کیا گیا تھا، اور ATF6 اور GRP78 کی سطح میں اضافہ کیا گیا تھا۔ l umol/L پر Quercetin دونوں کے پروٹین کی سطح کو نمایاں طور پر کم کرنے، ER تناؤ کو روکنے، اور H/R کی چوٹ سے HBMECs کی حفاظت کرنے کے قابل تھا (شکل 6)۔

Quercetin BBB کی سالمیت کو برقرار رکھ سکتا ہے۔

BMECs BBB ڈھانچے کی ریڑھ کی ہڈی ہیں، اور H/R کی چوٹ کے بعد ان کی موت یا apoptosis BBB کی سالمیت اور فعالیت کو متاثر کرتی ہے (Ding et al, 2019)۔ اس مقالے میں، endothelial خلیات کے کام کو اظہار میں تبدیلیوں کا پتہ لگانے سے ظاہر کیا گیا تھا۔ BBB سے وابستہ پروٹین ZO-1 اور Claudin-5 کا۔ کنٹرول گروپ کے مقابلے میں، ZO-1 اور Claudin-5 کا اظہار تھا

H/R کی چوٹ میں کمی، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ BBB کو نقصان پہنچا ہے اور اس نقصان کو quercetin کے ذریعے 0 5-1 μmol/L کے ارتکاز میں تبدیل کیا جا سکتا ہے، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ quercetin endothelial خلیات کے کام کو برقرار رکھ سکتا ہے۔ (شکل 7)۔

پروٹومک تجزیہ

quercetin کی موجودگی میں H/R زخمی HBMECs کے امتیازی اظہار پروٹین (DEPs) کو تلاش کرنے کے لیے، ITRAO کا استعمال پروٹومکس تجزیہ کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ اے پی کی نمائش کرنے والے پروٹین<0.05 and="" a="" ratio="" fold="" change="">1.2 یا<0.83 were="" defined="" as="" deps.="" in="" our="" study,="" the="" differences="" in="" protein="" among="" the="" control,="" h/r,="" and="" quercetin="" groups="" were="" compared.="" the="" results="" showed="" that="" 172="" proteins="" were="" identified="" as="" deps="" between="" the="" control="" and="" h/r="" groups,="" among="" which="" 94="" were="" upregulated="" and="" 78="" were="" downregulated="" in="" the="" h/r="" group.="" there="" were="" 1,016="" proteins="" identified="" as="" deps="" between="" the="" h/r="" group="" and="" the="" quercetin="" group,="" of="" which="" 553="" were="" up-regulated="" and="" 463="" were="" down-regulated="" in="" the="" quercetin="" group,="" as="" shown="" in="" figure="" 8a.="" between="" control="" vs="" h/r="" and="" h/r="" vs="" quercetin="" group,56="" of="" the="" same="" deps="" were="" shared="" between="" the="" two="" groups.="" the="" expressions="" of="" these="" deps="" were="" analyzed="" by="" hierarchical="" clustering="" as="" shown="" in="" figure="" 8b.="" among="" these="" deps,="" the="" top="" 20="" were="" shown="" in="" table="" among="" these="" 20="" commons,="" insulin="" receptor-related="" protein="" (insrr),="" dual-specificity="" protein="" phosphatase="" 3="" (dusp3),="" annexin="" a2(anxa2),="" hemoglobin="" subunit="" alpha="" (hba1),="" phosphoglycerate="" kinase="" 1="" (pgk1),="" vitronectin="" (vtn),="" glucose-6-phosphate="" isomerase="" (gpi)="" are="" related="" to="" endothelial="">

بحث

CSVD، ایک بڑھتے ہوئے طبی اور سماجی اقتصادی بوجھ کے طور پر، تیزی سے توجہ مبذول کر رہا ہے۔ لیکن حیرت انگیز طور پر، CSVD کا روگجنن فی الحال مبہم ہے، اس کے علاج کے لیے بھی کوئی واضح اسکیم نہیں ہے۔ یہ دیکھتے ہوئے کہ CSVD کے بعد کے مراحل فالج اور ڈیمنشیا جیسے سنگین نتائج کی طرف بڑھ سکتے ہیں، علاج کے لیے ابتدائی گھاووں کو نشانہ بنانا CSVD (Cannistraro et al,2019) کے بڑھنے میں مؤثر طریقے سے تاخیر کر سکتا ہے۔ یہ دکھایا گیا ہے کہ CSVD کی ابتدائی پیتھولوجیکل تبدیلیاں endothelial cell dysfunction اور دوائیں جو اس کے dysfunction کو مستحکم کرتی ہیں CSVD گھاووں میں دماغی سفید مادے کی کمزوری کو بہتر بنا سکتی ہیں (راجانی ایٹ ال، 2018)۔ CSVD میں اینڈوتھیلیل سیلز کے ذریعے ادا کیے گئے کردار کو دیکھتے ہوئے، ہم نے HBMECs کا استعمال کرتے ہوئے اینڈوتھیلیل سیلز پر روایتی چینی ادویات کے حفاظتی اثرات کی چھان بین کی۔

Quercetin ایک flavonoid ہے جو مختلف قسم کے پودوں میں موجود ہے (Nawrot-Hadzik et al, 2019)۔ اس میں مضبوط اینٹی آکسیڈینٹ اور سوزش کی سرگرمیاں ہیں اور مختلف پیتھولوجیکل حالات میں حفاظتی اثرات مرتب کر سکتی ہیں۔ اس مطالعے میں، ہم نے یہ ظاہر کیا کہ quercetin H/R کی چوٹ کو کم کر سکتا ہے، اور کئی تجرباتی اعداد و شمار ہمارے اس نتیجے کی تصدیق کرتے ہیں کہ quercetin سیل کی عملداری، خلیے کی منتقلی، انجیوجینیسیس کو فروغ دے سکتا ہے، مائٹوکونڈریل جھلی کی صلاحیت کو بڑھا سکتا ہے اور apoptosis کو روک سکتا ہے۔

اس بات پر غور کرتے ہوئے کہ quercetin میں مضبوط اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی ہے، ہم نے اس طریقہ کار کی چھان بین کی جس کے ذریعے quercetin اینٹی آکسیڈیشن کے لحاظ سے HBMECs کی حفاظت کرتا ہے۔ آکسیڈیٹیو تناؤ (Wu et al.,2018) کے ذریعے ROS کی سطح میں نمایاں اضافہ کیا جا سکتا ہے، اور ROS کا جمع ہونا بہت سی بیماریوں کا سبب بن سکتا ہے، بشمول قلبی امراض، endothelial dysfunction اور عمر بڑھنے سے متعلق امراض، اور neurodegenerative disease(Chen et al., 2015; Jakaria et al.، 2018؛ Santos et al.، 2018)۔ مزید یہ کہ، آکسیڈیٹیو تناؤ لپڈ پیرو آکسیڈیشن میں ہوتا ہے، جس سے ایم ڈی اے پیدا ہوتا ہے، جو جسم کے آکسیڈیٹیو اینٹی آکسیڈینٹ توازن کو تباہ کر دے گا اور اینڈوتھیلیل سیل کے نقصان کو بڑھا دے گا (یانگ ایٹ ال، 2021)۔

Keapl/Nrf2 اس وقت سب سے اہم سیلف اینٹی آکسیڈیٹیو اسٹریس پاتھ وے سمجھا جاتا ہے، اور اس پاتھ وے کو چالو کرنے سے اینڈوتھیلیل سیل کی خرابی میں نمایاں بہتری آسکتی ہے۔ خاص طور پر، ROS Nrf2 سگنلنگ پاتھ وے کو فعال کرنے میں مدد کرتا ہے (Selimoglu-Buet et al، 2017)۔ ہم نے یہ ظاہر کیا ہے کہ کیپل اور این آر ایف 2 پروٹین ایکسپریشن میں اضافہ کرتے ہوئے کوئرسیٹن آر او ایس اور ایم ڈی اے جنریشن کو کم کر سکتا ہے، یہ تجویز کرتا ہے کہ کیپل/ این آر ایف 2 سگنلنگ پاتھ وے کو چالو کرنے کے ذریعے آکسیڈیٹیو تناؤ کے ردعمل کو کم کر کے اینڈوتھیلیل سیل کی چوٹ کو کم کر سکتا ہے۔

صرف یہی نہیں، پائیدار ER تناؤ کھلے ہوئے پروٹین کے ردعمل کو متحرک کرتا ہے اور اینٹی آکسیڈینٹ جینز کے اظہار کو بدل دیتا ہے، جس سے اینڈوتھیلیل سیل اپوپٹوسس (Tang et al، 2019) ہوتا ہے۔ مزید یہ کہ، آکسیڈیٹیو تناؤ ER میں پروٹین فولڈنگ میں خلل کا سبب بھی بن سکتا ہے، ER تناؤ کو بھڑکا سکتا ہے، اور endothelial سیل کی چوٹ کو بڑھا سکتا ہے (Hetz، 2012)۔ ER تناؤ کو ان تین راستوں سے چالو کیا جا سکتا ہے: PKR کی طرح ER kinase (PERK)، inositol جس کو انزائم 1 (IRE1) کی ضرورت ہوتی ہے، اور ایکٹیویٹ کرنے والا ATF-6، جو ہومیو سٹیٹک حالات میں خلیات کو ER تناؤ سے بچاتا ہے (Hetz et al) 2020)۔ لیکن جب بیرونی منفی محرکات سے متاثر ہوتے ہیں، تو یہ تین راستے ER تناؤ کے ردعمل کو چالو کریں گے اور سیل اپوپٹوس کو آمادہ کریں گے۔ مزید برآں، مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ ER تناؤ کے ردعمل کی روک تھام H/R-حوصلہ افزائی شدہ اینڈوتھیلیل سیل ڈیسفکشن (چن ایٹ ال، 2020) کو ریورس کر سکتی ہے۔ ہمارے مطالعے میں، quercetin H/R کی وجہ سے بلند ATF6/GRP78 مواد کو کم کر سکتا ہے، روکنا۔ اینڈوپلاسمک ریٹیکولم تناؤ کا ردعمل، اور اینڈوتھیلیل خلیوں کی حفاظت کرتا ہے۔

BBB کے ایک اہم جزو کے طور پر، endothelial خلیات کے افعال میں ان کی سالمیت کو برقرار رکھنا شامل ہے۔ بی بی بی کی خرابی پیریواسکولر ٹشوز میں سیالوں، پروٹینوں اور پلازما کے دیگر اجزاء کے رساؤ کا سبب بنتی ہے، دماغی واسوڈیلیشن اور غذائیت کی نقل و حمل کو مزید خراب کرتی ہے (وارڈلاو ایٹ ال، 2019)۔ جب اینڈوتھیلیل سیلز کو نقصان پہنچے گا اور BBB کی سالمیت تباہ ہو جائے گی، اس لیے اینڈوتھیلیل سیلز کی حفاظت BBB کی سالمیت کو مزید برقرار رکھ سکتی ہے۔ BMECs میں Claudin-5 کا بہت زیادہ اظہار ہوتا ہے اور ریگولیٹ کرنے کے لیے سخت جنکشن چینز کی ریڑھ کی ہڈی کی تشکیل میں شامل ہوتا ہے۔ BBB پارگمیتا (یانگ ایٹ ال، 2020)۔ اینڈوتھیلیل سیلز ایکٹین سائٹوسکلٹن کے ساتھ لنگر انداز ہوتے ہیں جیسے ZO-1، انڈوتھیلیل سیلز کے درمیان تنگ جنکشن جو BBB (Zhang et al,2020) کی جکڑن کو برقرار رکھتے ہیں۔ ہمارے مطالعے میں، کلاڈین-5 اور ZO-1 کا اظہار BBB کی سالمیت کی نمائندگی کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ کلاؤڈین-5 اور ZO-1 کی پروٹین کی سطح H/R کی چوٹ کا نشانہ بننے والے HBMECs میں کم ہوئی تھی، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ BBB کی سالمیت میں خلل پڑا تھا، اور quercetin claudin کو بلند کر کے اس چوٹ کو کم کر سکتا ہے{{ 9}} اور ZO 1 پروٹین کی سطح۔

مزید برآں، HBMECs پر quercetin کے ممکنہ اہداف کو تلاش کرنے کے لیے، i-TRAQ کو خلیوں میں لیبل لگایا گیا تھا۔ پروٹومک تجزیہ کے بعد، عام تفریق ظاہر کیے گئے 20 پروٹینوں کی چھان بین کی گئی۔ ان میں، INSRR، DUSP3،

ANXA2، HBA1، PGK1، VTN، GPI کا تعلق اینڈوتھیلیل سیل سے ہے۔ INSRR کو ٹیومر اینڈوتھیلیل مارکر سمجھا جاتا ہے اور اس کا زیادہ اظہار انجیوجینیسیس کو فروغ دے سکتا ہے (نوواک-سلیونسکا ایٹ ال، 2019)۔ Recombinant ANXA2 ہائپوکسک اور سوزش والے عنصر کی چوٹ کی حالتوں کے تحت اینڈوتھیلیل پارگمیتا کو کم کر سکتا ہے، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ ANXA2 اینڈوتھیلیل سیل کی تنگی (Li et al، 2019) کی دیکھ بھال میں ملوث ہو سکتا ہے۔ انسانی سروائیکل سیکشنز کو داغدار کرنے میں، اینڈوتھیلیل سیلز میں DUSP3 کا مضبوط اظہار پایا گیا، اور تجربات سے یہ بھی ثابت ہوا کہ DUSP3 بنیادی فبروبلاسٹ گروتھ فیکٹر کی وجہ سے مائکرو واسکولر گروتھ (Amand et al. 2014) کے لیے ضروری ہے۔ اینڈوتھیلیل سیلز میں ایچ بی اے ایل کا اظہار ویسکولر ٹون اور فنکشن کو کنٹرول کرنے کے لیے دکھایا گیا ہے۔ مزید یہ کہ وی ٹی این کو ویسکولر انجری کی ترتیب میں تھرومبس کی تشکیل کے لیے اہم سمجھا جاتا ہے (Bowley et al، 2017)۔ جی پی آئی ہائپوکسک ماحول کے تحت ریمیٹائڈ گٹھیا کے مریضوں سے سائنوویئل ٹشو کے مائکرو واسکولر اینڈوتھیلیل خلیوں میں افزودہ ہوتا ہے اور انجیوجینیسیس (Lu et al, 2017) کو دلانے کے لئے ریمیٹائڈ گٹھائی کے synovial fibroblasts سے vascular endothelial گروتھ فیکٹر کے سراو کو منظم کرتا ہے۔ varicocele ثالثی بانجھ پن سے متعلق اظہار شدہ پروٹین سے پتہ چلتا ہے کہ Nrf2 ANXA2 کا ایک اپ اسٹریم ریگولیٹر تھا (پینر سیلوام ایٹ ال، 2021)۔ PGK1 کی روک تھام Keapl/Nrf2 راستے کو چالو کر سکتی ہے اور سیل کے حفاظتی اینٹی آکسیڈینٹ ردعمل کو متحرک کر سکتی ہے (Bolong et al,2018)۔ کیپل/این آر ایف 2 پاتھ وے کے ذریعے دو پروٹین quercetin کے ممکنہ اہداف ہو سکتے ہیں۔ مزید مطالعہ H/R-HBMECs پر quercetin کے اثر پر ان پروٹینوں کے کردار کی تصدیق کر سکتا ہے۔

اس بات کا یقین ہے کہ، quercetin endothelial خلیات پر حفاظتی اثرات ڈال سکتا ہے. لیکن کارروائی کے مخصوص اہداف کے لیے ابھی بھی مزید تفتیش کی ضرورت ہے، اور کیا کارروائی کے اضافی راستے موجود ہیں، نامعلوم ہے۔

آخر میں، اس مطالعہ سے پتہ چلتا ہے کہ quercetin نے endothelial خلیات کی حفاظت کرکے خون کے دماغ کی رکاوٹ کی سالمیت کو برقرار رکھا. سالماتی سطح پر، quercetin Keapl/Nrf2 پاتھ وے کے ذریعے آکسیڈیٹیو تناؤ سے بچا کر اور ATF6/GRP78 راستے کے ذریعے اینڈوپلاسمک ریٹیکولم تناؤ کو روک کر اینڈوتھیلیل خلیوں کی حفاظت میں اپنا کردار ادا کر سکتا ہے۔ یہ مطالعہ اینڈوتھیلیل سیلز کی حفاظت کے ذریعے CSVD کے علاج کے لیے TCM کی بنیاد رکھتا ہے۔