زیبرا فش ایمبریو فوڈ اینٹی آکسیڈینٹ مرکبات کے حفاظتی اثرات کو جانچنے کے لیے ایک ماڈل کے طور پر

ای میلtina.xiang@wecistanche.comمزید معلومات کے لیے.

خلاصہ:دیاینٹی آکسیڈینٹکھانے کے مرکبات کی سرگرمی ان خصوصیات میں سے ایک ہے جو سب سے زیادہ دلچسپی پیدا کرتی ہے، اس کے صحت کے فوائد اور دائمی بیماری کی روک تھام کے ساتھ تعلق کی وجہ سے۔ اس سرگرمی کو عام طور پر ان وٹرو اسسیس کا استعمال کرتے ہوئے ماپا جاتا ہے، جو ویوو اثرات یا عمل کے طریقہ کار میں پیش گوئی نہیں کر سکتا۔ اس مطالعے کا مقصد چھ فینولک مرکبات (نارینجین، اپیگینن، روٹین، اولیورپین، کلوروجینک ایسڈ، اور کرکومین) اور تین کیروٹینائڈز (لائیکوپین بی، کیروٹین، اور ایسٹاکسینتھین) کے حفاظتی اثرات کا جائزہ لینا تھا۔ زیبرا فش ایمبریو ماڈل۔ زیبرا فش ایمبریو کو نو اینٹی آکسیڈنٹ مرکبات میں سے ہر ایک کے ساتھ پہلے سے علاج کیا گیا تھا اور پھر اسے ٹرٹ بیوٹائل ہائیڈروپرو آکسائیڈ (ٹی بی او او ایچ) کے سامنے لایا گیا تھا، جو کہ ایک معروف محرک ہے۔اوکسیڈیٹیو تناؤزیبرا فش میں TBOOH حوصلہ افزائی مہلکیت اور dysmorphogenesis کے ارتکاز ردعمل کا پہلے سے علاج شدہ جنین کے ساتھ موازنہ کرکے اہم اختلافات کا تعین کیا گیا۔اینٹی آکسیڈینٹمرکبات ہر مرکب کا ایک حفاظتی اثر، سوائے کیروٹین کے، آکسیڈیٹیو-تناؤ-حوصلہ افزائی مہلکیت کے خلاف، پایا گیا۔ مزید برآں، apigenin، rutin، اور curcumin نے بھی dysmorphogenesis کے خلاف حفاظتی اثرات دکھائے۔ دوسری طرف، -کیروٹین نے صرف ٹی بی او او ایچ کے علاج کے مقابلے میں مہلکیت اور ڈیسمورفوجنیسیس میں اضافہ کیا۔

مطلوبہ الفاظ: اوکسیڈیٹیو تناؤ؛ زیبرا فش ایمبریو؛ اینٹی آکسیڈینٹ اثر؛ پولیفینول؛ carotenoids

1. تعارف

رد عمل آکسیجن پرجاتیوں (ROS) اور رد عمل نائٹروجن پرجاتیوں (RNS) کی ابتدا سیل میٹابولزم کے دوران ہوتی ہے۔ وہ ایک عام جسمانی حالت کے لیے ضروری ہیں، لیکن جب وہ زیادہ ہوتے ہیں تو وہ پیتھولوجیکل عمل میں حصہ لیتے ہیں [1]۔ ایروبک جانداروں کے پاس ROS کی حوصلہ افزائی والے آکسیڈیٹیو نقصان کو روکنے کے لیے دفاعی نظام موجود ہےاینٹی آکسیڈینٹانزائمز اور/یا غیر انزیمیٹک میکانزم، بشمول endogenously پیدا ہونے والے اینٹی آکسیڈینٹ مرکبات یا غذا میں اینٹی آکسیڈنٹس کا استعمال [2]۔
عدم توازن، جب رد عمل پرجاتیوں کا ارتکاز اس سے زیادہ ہوتا ہے۔اینٹی آکسیڈینٹحیاتیات کے دفاع کو کہا جاتا ہے۔اوکسیڈیٹیو تناؤ(OS) [3]۔ OS کے نتائج میں میکروفیج کی بھرتی شامل ہے۔ لپڈ اور پروٹین کے معمول کے کام کی روک تھام؛ اور مائٹوکونڈریل، جھلی، اور ڈی این اے کو نقصان [4-7]۔ یہ تبدیلیاں کئی پیتھالوجیز کے ساتھ منسلک ہیں، جیسے کینسر، بڑھاپا، ذیابیطس، رمیٹی سندشوت، اور قلبی اور نیوروڈیجینریٹو امراض، دوسروں کے درمیان [8-11]۔

متعدد مطالعات سے پتا چلا ہے کہ ایک جاندار کو فزیو پیتھولوجیکل حالات (UV نمائش، تمباکو نوشی، آلودہ ہوا، وغیرہ) میں آکسیڈیٹیو نقصان کو کم کرنے کے لیے خوراک کے ذریعے اینٹی آکسیڈنٹس کی ضرورت ہوتی ہے، جو اضافی ROS پیدا کرتے ہیں۔ مختلف اینٹی آکسیڈنٹ خوراک کے ذریعے کھائے جاتے ہیں، جیسے فینولک مرکبات، وٹامنز، کیروٹینائڈز، اورflavonoids. اصطلاح "فینولک مرکبات" سے مراد کوئی بھی ایسا مادہ ہے جس کا فینول گروپ خوشبودار یا الیفاٹک ڈھانچے سے منسلک ہوتا ہے۔ فینولک مرکبات پودوں سے آتے ہیں اور سب سے اہم ثانوی میٹابولائٹس میں سے ہیں۔ جانوروں کی بادشاہی میں ان کی موجودگی خوراک کے ذریعے ان کے استعمال کی وجہ سے ہے۔ ان مرکبات میں،flavonoidsسب سے زیادہ مطالعہ اور پرچر ہیں؛ ان کے کیمیائی ڈھانچے میں aflavonoidنیوکلئس جو 15 کاربن ایٹموں پر مشتمل ہوتا ہے جو تین حلقوں میں ترتیب دیا جاتا ہے (C6–C3–C6) [13]۔ ان کے اینٹی آکسیڈینٹ میکانزم میں انزائمز کی روک تھام یا آزاد ریڈیکلز پیدا کرنے میں ملوث ٹریس عناصر کی چیلیشن، ROS کا اخراج، اور اینڈوجینس اینٹی آکسیڈینٹ ڈیفنسز کا تحفظ شامل ہیں [14]۔ مطلبflavonoidانٹیک کا تخمینہ 23 ملی گرام فی دن [15,16] ہے، اور بنیادی ذرائع کالی چائے، سرخ شراب، پیاز، سیب اور بیئر ہیں [17,18]۔

مرکبات کا ایک اور گروپ جس کا ان کی اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی کی وجہ سے مطالعہ کیا گیا ہے وہ ہے کیروٹینائڈز۔ وہ روغن ہیں جن کے ڈھانچے میں کنجوگیٹڈ C=C بانڈز (پولین) کی ایک سیریز شامل ہے، جو انہیں آزاد ریڈیکلز کے ساتھ تعامل کرنے کی اجازت دیتی ہے۔ لہذا، وہ مؤثر اینٹی آکسائڈنٹ کے طور پر کام کر سکتے ہیں [19]. کیروٹینائڈز قدرتی نظاموں میں وسیع پیمانے پر تقسیم ہوتے ہیں، اور مختلف بیماریوں سے بچاؤ میں ان کے کردار کا مطالعہ کیا گیا ہے، بنیادی طور پر خوراک میں موجود مرکبات جیسے کیروٹین، لیوٹین، اور لائکوپین [18,20,21]۔

کے کرداروں کی نشاندہی کرنااینٹی آکسیڈینٹویوو میں حفاظتی اثرات کا تجزیہ کرنے کے لیے آکسیڈیٹیو عمل سے منسلک بیماریوں اور عوارض میں ضروری ہے۔ اس وجہ سے، ہماری لیبارٹری نے ان کے حفاظتی اثرات کا جائزہ لینے کے لیے زیبرا فش (ZF) ایمبریو ماڈل تیار کیا ہے۔اینٹی آکسیڈینٹمرکبات [22]۔اوکسیڈیٹیو تناؤtertbutyl hydroperoxide (tBOOH) کا استعمال کرتے ہوئے حوصلہ افزائی کی جاتی ہے۔ ٹی بی او او ایچ فینٹن کے رد عمل کے ذریعے بٹوکسیل ریڈیکلز پیدا کرتا ہے [23]۔ تشکیل شدہ ریڈیکلز تھیول گروپس اور گلوٹاتھیون کے ذخائر کی انٹرا سیلولر کمی کے حق میں ہیں، جس سے بے نقاب زیبرا فش ایمبریو میں مہلکیت اور ڈیسمورفوجنیسیس میں نمایاں اضافہ ہوتا ہے۔ یہ ماڈل ٹی بی او او ایچ کے سامنے آنے والے زیبرا فش ایمبریوز کے لیے مہلکیت کے ارتکاز کے اثر کے منحنی خطوط اور ڈیسمورفوگنیسیس کے درمیان موازنہ کرنے کی اجازت دیتا ہے اور اینٹی آکسیڈینٹس کے ساتھ پہلے سے علاج شدہ ایمبریوز کے منحنی خطوط؛ تجزیہ شدہ اینٹی آکسیڈینٹ کمپاؤنڈ کے حفاظتی اثر کو تلاش کرنے کے لیے شماریاتی تجزیہ کیا جا سکتا ہے۔

موجودہ کام کا مقصد زیبرا فش ایمبریوز میں آکسیڈینٹ سے حوصلہ افزائی کرنے والے ترقیاتی زہریلے کے خلاف اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی کے ساتھ کھانے کے مرکبات کے حفاظتی اثرات کا جائزہ لینا تھا۔

2. نتائج

2.1 زیبرا فش ایمبریوز میں ٹی بی او او ایچ کے لیے ارتکاز اثر کے منحنی خطوط

ہمارے ریسرچ گروپ نے پہلے زیڈ ایف ایمبریو تیار کیا اور اس کی توثیق کی۔اوکسیڈیٹیو تناؤماڈل جس کے ساتھ حفاظتی سرگرمی کا جائزہ لیا جائے۔اینٹی آکسیڈینٹمادہ (22)

زیبرا فش ایمبریوز کو مہلکیت اور ڈیسمورفوجینیسیس منحنی خطوط حاصل کرنے کے لیے ٹیرٹ بٹیل ہائیڈروپرو آکسائیڈ (ٹی بی او او ایچ) کے سامنے لایا جاتا ہے۔ زیبرا فش ایمبریو ٹی بی او ایچ 24 سے 48 گھنٹے بعد فرٹیلائزیشن (ایچ پی ایف) کے سامنے مختلف ارتکاز میں ہوتے ہیں، جن میں 1 سے 3.5 ایم ایم (شکل 1) ہوتا ہے۔ مہلک ارتکاز 50 (LC50) کو 2.1 mM دریافت کیا گیا، جبکہ dysmorphogenesis (EC50) کے لیے مؤثر ارتکاز 50 1.7 mM تھا۔ مذکورہ منحنی خطوط کا استعمال زیبرا فش ایمبریو کا موازنہ کرنے کے لیے کیا گیا تھا جو پہلے سامنے آئے تھے، یا نہیں، اینٹی آکسیڈینٹ مرکبات سے، جس کے بعد وہ tBOOH کے سامنے آئے تھے۔

2.2 زیبرا فش ایمبریوز میں اینٹی آکسیڈنٹ مرکبات کے حفاظتی اثرات کی شناخت

پہلے بیان کردہ زیبرا فش ماڈل کو کھانے میں موجود چھ پولیفینول اور تین کیروٹینائڈز کے حفاظتی اثرات کا جائزہ لینے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔

چھ پولیفینولز میں سے تین تھے۔flavonoids: نارنگینن (20 یو ایم)، ایپیگینن (10 یو ایم)، اور روٹین (10 یو ایم)۔ تینوںflavonoidsمہلکیت کے لئے ارتکاز ردعمل کے منحنی خطوط میں ایک اہم بڑھاؤ پیدا کیا۔ مزید برآں، apigenin اور rutin نے dysmorphogenesis کے خلاف حفاظتی اثرات ظاہر کیے، جبکہ naringenin نے dysmorphogenesis کے خلاف کوئی حفاظتی اثر نہیں دکھایا (شکل 2)۔

Oleuropein (15 μM)، کلوروجینک ایسڈ (20 uM)، اور curcumin (15 μM) کا بھی تجزیہ کیا گیا۔ ان پولیفینول کے نتیجے میں مہلکیت کے لئے حراستی ردعمل کے منحنی خطوط میں نمایاں اضافہ ہوا۔ صرف کرکومین نے ڈیسمورفوگنیسیس کے خلاف حفاظتی اثر دکھایا (شکل 3)۔

اس کے علاوہ، کیروٹینائڈز لائکوپین （20 μM）، astaxanthin （20 μM）، اور کیروٹین （25 μM） کا جائزہ لیا گیا۔ لائکوپین اور astaxanthin کے نتیجے میں مہلکیت کے لیے ارتکاز ردعمل کے منحنی خطوط میں نمایاں اضافہ ہوا۔ اس کے برعکس، کیروٹینائڈز میں سے کسی نے بھی dysmorphogenesis کے خلاف حفاظتی اثر نہیں دکھایا (شکل 4)۔ مزید برآں، -کیروٹین کے نتیجے میں مہلکیت اور ڈیسمورفوجنیسیس کے لیے منحنی خطوط میں بائیں جانب بڑھے، جو ممکنہ پراکسیڈنٹ اثر کی نشاندہی کر سکتے ہیں۔

3. بحث

آکسیجن انسانی زندگی کے لیے ضروری ہے۔ تاہم، ایک ہی وقت میں، یہ زہریلے مادے پیدا کرتا ہے، جیسے فری ریڈیکلز اور ری ایکٹیو آکسیجن پرجاتیوں (ROS)؛ یہ مادے آکسائڈائزنگ، غیر مستحکم اور رد عمل ہیں۔ مزید برآں، وہ کسی بھی macromolecule کے ساتھ رد عمل ظاہر کر سکتے ہیں اور خلیے کو نقصان پہنچا سکتے ہیں [24]۔ ان آکسیڈائزنگ مادوں کا مقابلہ کرنے کے لیے، جسم اینٹی آکسیڈینٹ انزائمز، جیسے سپر آکسائیڈ ڈسموٹیز اور گلوٹاتھیون پیرو آکسیڈیز، اور غذا سے حاصل کردہ اینٹی آکسیڈینٹ مرکبات کو استعمال کرتا ہے۔ لہذا، مرکبات کی اینٹی آکسیڈینٹ صلاحیت کا مطالعہ پچھلے کچھ سالوں میں دلچسپی حاصل کر رہا ہے۔ اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی کا تعین کرنے کے لیے بہت سی ان وٹرو تکنیکیں موجود ہیں، حالانکہ ان میں غذائیت کے نقطہ نظر سے کچھ حدود ہیں کیونکہ کوئی بھی جسمانی صورت حال کو دوبارہ پیدا نہیں کرتا ہے [25]۔ اس وجہ سے، ویوو تکنیکوں میں شامل ایک طریقہ زیادہ مؤثر نتائج کا باعث بنے گا، کیونکہ آکسیڈیٹیو تناؤ ایسے میکانزم کو ظاہر کرتا ہے جو نظام کے بہت سے حالات، خاص طور پر رد عمل کے حرکیاتی حصوں پر منحصر ہے۔ ہماری ٹیم نے ایک ZF ایمبریو ماڈل [22] کا استعمال کیا، جو vivo کے طریقہ کار میں ایک قیمتی ثابت ہو سکتا ہے، نو اینٹی آکسیڈینٹ مرکبات کے حفاظتی اثرات کو جانچنے کے لیے جن کا وسیع پیمانے پر وٹرو میں مطالعہ کیا گیا ہے۔ ہم نے چھ فینولک مرکبات اور تین کیروٹینائڈز کا جائزہ لیا۔ فینولک مرکبات انسانی خوراک کی اینٹی آکسیڈائزنگ صلاحیت میں اہم شراکت کی نمائندگی کرتے ہیں۔ ان مرکبات میں سے، flavonoids سب سے زیادہ مطالعہ اور پرچر ہیں۔ flavonoids apigenin، rutin، اور naringenin کی اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی کا مطالعہ کیا گیا۔ یہ flavonoids بائیو ایکٹیو مرکبات ہیں جو بنیادی طور پر مختلف پھلوں، پودوں اور سبزیوں، گری دار میوے اور پیاز میں پائے جاتے ہیں۔ ان وٹرو مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ یہ فلیوونائڈز مؤثر طریقے سے ہائیڈروکسیل ریڈیکلز، سپر آکسائیڈ، ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ، نائٹرک آکسائیڈ ریڈیکلز، ڈی پی پی ایچ، اور لپڈ پیرو آکسائیڈ کو بے اثر کرتے ہیں [26-29]۔ چن ایٹ ال نے 2012 میں [30]، زیبرا فش لاروا ماڈل کا استعمال کرتے ہوئے QSAR تجزیہ کیا تاکہ UV-حوصلہ افزائی فوٹوٹوکسیسیٹی کے خلاف، روٹین سمیت پندرہ فلیوونائڈز کی ROS اسکیوینجنگ صلاحیتوں کا اندازہ کیا جا سکے۔ پچھلے مطالعات کے مطابق، انہوں نے دو ہائیڈروکسیل گروپوں اور ان کی پوزیشنوں کی اہمیت کا نتیجہ اخذ کیا، جس میں کم از کم دو ہائیڈروکسیل گروپ ایک مضبوط حیاتیاتی سرگرمی کے لیے ضروری ہیں [30,31]۔ مزید برآں، یہ طے کیا گیا کہ C3، C5، اور C7 پوزیشنوں پر ہائیڈروکسیل گروپس بہتر فلاوون استحکام اور سرگرمی فراہم کرتے ہیں [31]۔ ہمارے نتائج نے تین flavonoids کے لئے tBOOH کی حوصلہ افزائی مہلکیت کے خلاف حفاظتی اثر دکھایا۔ Apigenin اور rutin نے dysmorphogenesis کے خلاف حفاظتی اثرات بھی ظاہر کیے؛ تاہم، naringenin نے dysmorphogenesis کے خلاف کوئی اثر نہیں دکھایا۔

flavonoids کے علاوہ، oleuropein، chlorogenic acid، اور curcumin کے اینٹی آکسیڈینٹ اثرات کا بھی جائزہ لیا گیا۔ ان وٹرو اور ان ویوو مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ یہ

تین فینولک مرکبات میں اہم اینٹی آکسیڈینٹ اثرات ہوتے ہیں [32–34]۔ Oleuropein ایک بایوفینول ہے جو زیتون کے پتوں، اضافی کنواری زیتون کے تیل اور Oleaceae خاندان کی کچھ انواع میں پایا جاتا ہے [32]۔ Chlorogenic acids (CGAs) کیفیک اور کوئینک ایسڈز کے درمیان بننے والے ایسٹرز ہیں اور انسانی خوراک میں موجود پولی فینولز کے ایک گروپ کی نمائندگی کرتے ہیں [35]۔ کئی مطالعات سے یہ بات سامنے آئی ہے کہ سی جی اے پر مشتمل مشروبات جیسے کافی، چائے، شراب اور مختلف پھلوں کے جوس پینے سے مختلف دائمی بیماریوں [36–38] کے پیدا ہونے کا خطرہ کم ہوتا ہے۔ اس کمی کی ایک وجہ CGAs کی اینٹی آکسیڈینٹ صلاحیت ہے، جو آزاد ریڈیکلز کو کم کرنے اور آکسیڈیشن کے رد عمل کو روکنے کے لیے ہائیڈروجن ایٹم کا عطیہ کرتے ہیں [35]۔ کرکومین ایک پولی فینول ہے جو کھانے کی مصنوعات میں رنگنے اور پکانے کے لیے استعمال ہوتا ہے۔ پچھلے کچھ سالوں کے دوران اس کی اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی کا مطالعہ کیا گیا ہے، اور ایک مطالعہ سے پتہ چلتا ہے کہ یہ بائیو میمبرین کو پیرو آکسیڈیٹیو نقصان سے بچا سکتا ہے [39]۔ ZF ایمبریو ماڈل کا استعمال کرتے ہوئے، یہ دیکھا گیا کہ oleuropein، chlorogenic acid، یا curcumin کے ساتھ پہلے سے علاج کرنے سے tBOOH-حوصلہ افزائی آکسیڈیٹیو تناؤ کی شرح اموات میں کمی آئی۔ تاہم، dysmorphogenesis کے خلاف ایک اہم حفاظتی اثر صرف curcumin کے لیے دیکھا گیا۔

اینٹی آکسیڈینٹ خصوصیات کے ساتھ ایک اور گروپ کیروٹینائڈز ہے، جو isoprenoid pigments کا ہر جگہ موجود گروپ ہے۔ وہ سنگلٹ آکسیجن بجھانے والے اور ROS [40] کی صفائی کرنے والے ہیں۔ کیروٹینائڈز کی اینٹی اور پرو آکسیڈینٹ سرگرمی کے تحت مالیکیولر میکانزم ابھی تک پوری طرح سے سمجھ نہیں پائے ہیں۔ سب سے زیادہ زیر مطالعہ کیروٹینائڈز میں لائکوپین اور کیروٹین شامل ہیں۔ یہ ٹماٹر، ٹماٹر کی چٹنی، مختلف پھلوں، طحالبوں اور سبزیوں میں وافر مقدار میں پائے جاتے ہیں [18,41]۔ جب ان کیروٹینز کے حفاظتی اثرات کا جائزہ لیا گیا تو، یہ پایا گیا کہ لائکوپین نے اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی ظاہر کی، جنین کی مہلکیت کے خلاف حفاظتی اثر کے ساتھ؛ تاہم، dysmorphogenesis کے خلاف کوئی اثر نہیں پایا گیا۔ دوسری طرف، کیروٹین نے اکیلے آکسیڈینٹ کے اثر کے مقابلے میں زیڈ ایف ایمبریو میں مہلکیت اور ڈیسمورفوجنیسیس کے واقعات میں اضافہ کیا۔ یہ ان مطالعات کے مطابق ہے جس میں یہ دکھایا گیا ہے کہ کیروٹین کی زیادہ مقدار میں اینٹی آکسیڈینٹ اثرات ہوتے ہیں جس کے بعد ہائی آکسیجن تناؤ پر پراکسیڈینٹ ایکشن ہوتا ہے، جو اس کے منفی اثرات سے متعلق ہو سکتا ہے [42]۔ مزید یہ کہ، ایک مطالعہ سے پتہ چلتا ہے کہ -کیروٹین سپلیمنٹیشن کا پلیسبو [43] کے مقابلے ذیابیطس کے شکار مرد تمباکو نوشی کرنے والوں کی کل اموات پر کوئی حفاظتی اثر نہیں ہوتا ہے۔ ایک اور کیروٹینائڈ کا اندازہ لگایا گیا تھا astaxanthin؛ یہ ایک xanthophyll carotenoid ہے جو طحالب، خمیر، سالمن، ٹراؤٹ، کرل، جھینگا اور کری فش میں پایا جاتا ہے۔ یہ ایک سرخ، چکنائی میں گھلنشیل اینٹی آکسیڈینٹ روغن ہے جس میں وٹامن اے کی کوئی سرگرمی نہیں ہے [44]۔ ہمارے مطالعے میں، astaxanthin نے مہلکیت کے خلاف حفاظتی اثر کا مظاہرہ کیا، لیکن dysmorphogenesis کے خلاف کوئی اثر نہیں ملا۔

آخر میں، جانچے گئے نو مالیکیولز میں سے آٹھ نے ZF برانن مہلکیت کے خلاف حفاظتی اثرات کے ساتھ اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی ظاہر کی۔ صرف apigenin (10 µM)، rutin (10 µM)، اور curcumin (15 µM) اضافی طور پر tBOOH کی حوصلہ افزائی آکسیڈیٹیو تناؤ کے نتیجے میں ڈیسمورفوجنیسیس کے خلاف حفاظتی اثرات کی نمائش کرتے ہیں۔ اس کے برعکس، یہ پایا گیا کہ -کیروٹین نے الٹا اثر پیدا کیا، جس سے اموات اور ڈیسمورفوجنیسیس کی شرح میں اضافہ ہوا کیونکہ اس نے LC50 اور EC50 کی قدروں کو کم کر دیا۔ آکسیڈیٹیو اور اینٹی آکسیڈیٹیو قوتوں کا توازن اور وقت جنین کی نشوونما کے مناسب ضابطے اور وقت کی کلید ہے [45]۔ ان اینٹی آکسیڈنٹس کے حرکیات یا عمل کے طریقہ کار میں فرق dysmorphogenesis کے خلاف مختلف حفاظتی صلاحیتوں کی سب سے بڑی وجہ ہو سکتی ہے۔ یہ جاننے کے لیے مزید مطالعات کی ضرورت ہے کہ برانن کی نشوونما کے دوران صرف کچھ مرکبات ہی مورفوجینیسیس پر حفاظتی اثرات کیوں دکھاتے ہیں۔ اس مطالعے نے ایمبریوٹوکسک اثر (مہلکیت) اور ڈیسمورفوجنیسیس اثر (ٹیراٹوجینیٹی) کے درمیان امتیاز کرنے کی کوشش کی۔ کچھ معاملات میں، خرابی سے پہلے ہونے کا امکان ہوتا ہے اور اس کے نتیجے میں موت واقع ہوتی ہے۔ دوسری صورتوں میں، مہلک پن اور خرابی مختلف وجوہات کی وجہ سے ہو سکتی ہے۔ ان دو مظاہر کی آزادی پر شبہ کیا جائے گا اگر ایک مرکب مہلک اور ڈیسمورفوجنیسیس ارتکاز ردعمل کے منحنی خطوط کے درمیان علیحدگی کو بڑھاتا ہے۔ ہمارے مطالعے میں جانچے گئے تمام اینٹی آکسیڈینٹ مرکبات نے مہلک خوراک پر ٹیراٹوجینک اثر کو دو بار سے زیادہ نہیں بڑھایا۔ لہذا، کسی بھی اینٹی آکسیڈینٹ کمپاؤنڈ [46] کے لئے کوئی بڑھی ہوئی ٹیراٹوجینک صلاحیت نہیں دیکھی گئی۔

مجموعی طور پر، یہ نتائج بتاتے ہیں کہ یہ ZF ایمبریو ماڈل ایک قیمتی ٹول ہے جس کے ساتھ اینٹی آکسیڈینٹ مالیکیولز کے حفاظتی اثرات کا تجزیہ کیا جا سکتا ہے جو خوراک کو تشکیل دیتے ہیں۔ کیمیائی ساختی وجوہات کا تعین کرنے کے لیے جن کی وجہ سے ایپیگینن، روٹین، اور کرکومین نے ہمارے مطالعے میں سب سے زیادہ حفاظتی اثرات ظاہر کیے، مزید تجزیے ضروری ہیں۔ مثال کے طور پر، مقداری ڈھانچے کی سرگرمی کے تعلقات (QSARs) کا تعین کرنے کے لیے۔

4. مواد اور طریقے

4.1 اخلاقی بیان

زیبرا فش لاروا اور ایمبریو پر مشتمل طریقہ کار کو یونیورسٹی آف بارسلونا کی اینیمل ایتھکس کمیٹی، حکومت کاتالونیا کے محکمہ لائیو سٹاک اینڈ فشریز کے پروٹوکول 7971 (طریقہ کار ڈی اے اے ایم 7971) کے ذریعے اختیار کیا گیا تھا۔

4.2 کیمیکل اور حل

PreparationTert-butyl hydroperoxide (tBOOH، CAS نمبر: 75-91-2) اور اینٹی آکسیڈینٹ کام پاؤنڈز TCI یورپ سے حاصل کیے گئے تھے۔ tBOOH کو 0.3X ڈینیاؤ کے بفر (17.4 mM NaCl; 0.23 mM KCl; 0.12 mM MgSO4·7 H2O; 0.18 mM Ca (NO3)2؛ 1.5 mM HEPES(N-(2-hydroxyethyl) piperazine-N0 -(2-ethanesulfonic acid); pH 7.4)۔

نارنگینن (20 µM) (CAS نمبر: 67604-48-2)، oleuropein (15 µM) (CAS نمبر:32619-42-4)، روٹین (10 µM) (CAS نمبر : 207671-50-9)، کلوروجینک ایسڈ (20 µM) (CAS نمبر: 327-97-9)، apigenin (10 µM) (CAS نمبر: 520-36-5)، curcumin (15 µM) (CAS نمبر: 458-37-7)، لائکوپین (20 µM) (CAS نمبر: 502-65-8)، astaxanthin (20 µM) (CAS نمبر: 472-61-7)، اور کیروٹین (25 µM) (CAS نمبر: 7235-40-7) Sigmar-Aldrich® سے حاصل کیے گئے تھے۔ اینٹی آکسیڈنٹس کو 100 فیصد ڈائمتھائل سلفوکسائیڈ (DMSO، سگما ایلڈرچ، میڈرڈ، اسپین) میں تحلیل کیا گیا اور اس کے بعد 0.3× ڈینیو کے بفر میں 0.05 فیصد (v/v) کی فائینل ڈی ایم ایس او حراستی میں تحلیل کیا گیا۔ اینٹی آکسیڈنٹس کا استعمال مختلف ارتکاز میں کیا گیا تھا، اس کا انحصار سب سے زیادہ ارتکاز پر ہوتا ہے جس پر مہلک یا جنین کی نشوونما پر کوئی اثر نہیں دیکھا گیا (زیادہ سے زیادہ قابل برداشت ارتکاز، MTC)

4.3 زیبرا فش کی دیکھ بھال اور انڈے کی پیداوار

بالغ جنگلی قسم کی زیبرا فش کو معیاری حالات میں رکھا گیا تھا۔ جنین کو جمع کیا گیا، صاف کیا گیا اور ان کی قابل عملیت کے مطابق منتخب کیا گیا۔ بین الاقوامی تنظیم برائے معیاری کاری (ISO) کے معیارات 7346-1 اور 7346-2 (ISO, 1998; 2 mM CaCl2·2H2O, 0.5 mM MgSO4) کے مطابق فرٹیلائزڈ ایمبریو کو پانی سے معیاری بنایا گیا تھا۔ · 7H2O، 0.75 mM NaHCO3، اور 0.07 mM KCl)۔ فرٹیلائزڈ انڈوں کو Kimmel et al.، 1995 [47] کے پچھلے مطالعات کے مطابق اسٹیج کیا گیا تھا، اور بعد میں نمائش کے لیے ایک dissecting stereomicroscope (Motic SMZ168, Motic China Group, LTD., Luwan, Shanghai, China) کے تحت منتخب کیا گیا تھا۔ مچھلی کے جنین کو شیشے کی شیشیوں میں 27 ± 1 ◦C کے کنٹرول درجہ حرارت پر رکھا گیا تھا۔

4.4 زیبرا فش ایمبریوز کا آکسیڈیٹیو اسٹریس (Tert-Butyl Hydroperoxide) کی نمائش

tBOOH منحنی خطوط کی تیاری کے لیے، Boix کے طریقہ کار، 2020 کی پیروی کی گئی۔ یہ طریقہ کار ارتکاز – مہلک ردعمل (LC50) وکر اور dysmorphogenesis (EC50) حاصل کرنے پر مبنی ہے ZF ایمبریوز کو آکسیڈیٹیو اسٹریس انڈیوسر، tertbutyl hydroperoxide (tBOOH) سے بے نقاب کر کے۔ ایک بار زیبرا فش ایمبریو حاصل کر لینے کے بعد، انہیں 0.3X ڈینیاؤ میڈیم میں 0 سے 24 hpf تک رکھا جاتا ہے۔ 24 سے 48 hpf تک، جنین 1، 1.5، 2، 2.5، 3، اور 3.5 mM کے مختلف ارتکاز میں tBOOH حل کے سامنے آتے ہیں۔ ٹرپلیکیٹ میں زیبرا فش کے 3 مختلف چنگل سے ایمبریوز استعمال کیے گئے تھے (شکل 5A)۔

4.5 اینٹی آکسیڈینٹ مرکبات کے حفاظتی اثرات کا تعین

یہ معلوم کرنے کے لیے کہ آیا کسی مرکب کا آکسیڈیٹیو تناؤ کے خلاف حفاظتی اثر ہوتا ہے، زیبرا فش ایمبریوز کو پہلے 0 سے 24 hpf تک اینٹی آکسیڈینٹ کمپاؤنڈ کے سامنے لایا گیا تھا۔ حراستی کا حساب زیادہ سے زیادہ قابل برداشت حراستی اسیس پر منحصر کیا گیا تھا۔ اس کے بعد، 24 سے 48 hpf تک، جنین تناؤ پیدا کرنے والے، tBOOH کے سامنے آئے۔ اس کے بعد، جنین کے ہر گروپ کا اندازہ tBOOH (شکل 5B) کے ہر ایک ارتکاز پر کیا گیا۔ اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا کوئی خاص فرق تھا، صرف tBOOH کی نمائش کے لیے وکر اور اینٹی آکسیڈینٹ کمپاؤنڈ سے پہلے کی نمائش کے لیے وکر کا موازنہ کیا گیا۔

ہر مادہ اور ارتکاز کے لیے دس فرٹیلائزڈ انڈوں کو 2.5 ملی لیٹر کے سامنے لایا گیا۔ مختلف اسپننگ ایونٹس کے انڈوں کا استعمال کرتے ہوئے تین آزاد نقلیں کی گئیں۔ ZF ایمبریوز کو پہلے سے 24 گھنٹے تک اینٹی آکسیڈینٹ مرکبات کے سامنے رکھا گیا تھا، پھر اینٹی آکسیڈینٹ محلول کو ہٹا دیا گیا تھا، ڈینیاؤ کے میڈیم کا استعمال کرتے ہوئے دھونے کا عمل کیا گیا تھا، اور ZF ایمبریوز کو مختلف tBOOH ارتکاز کے سامنے لایا گیا تھا۔ مہلکیت کا اندازہ 48 گھنٹے کے بعد کیا گیا، اور مردہ ایمبریو کا مطلب مناسب اسیس کے بعد لگایا گیا۔ dysmorphogenesis کی تشخیص کے لیے، ہم نے Teixido et al کے بیان کردہ اسکورنگ سسٹم کی پیروی کی۔ تقریباً 48 ایچ پی ایف پر جنین کے ڈیسمورفوجنیسس کا حساب لگانا۔ ہم نے نو مورفولوجیکل خصوصیات کا انتخاب کیا، جن کی تفصیل جدول 2 میں ہے۔ ہر ارتکاز اور علاج شدہ گروپ کے لیے غیر معمولی ایمبریوز کی فریکوئنسی کا حساب لگایا گیا (کسی بھی مورفولوجیکل فیچر میں 1 کے اسکور والے ایمبریو کے طور پر بیان کیا گیا)۔

اینٹی آکسیڈنٹس سے پہلے کی نمائش کی وجہ سے ارتکاز ردعمل کے منحنی خطوط کو دائیں طرف منتقل کرنا آکسیڈیٹیو اسٹریس انڈیسر کے خلاف ایک حفاظتی اثر کی نشاندہی کرتا ہے کیونکہ انڈسر کی زیادہ ارتکاز کو وہی نتائج حاصل کرنے کی ضرورت ہوتی ہے جو صرف tBOOH کی نمائش میں ہوتے ہیں۔ اینٹی آکسیڈنٹس سے پہلے کی نمائش کی وجہ سے، ارتکاز ردعمل وکر کے بائیں طرف ایک شفٹ آکسیڈیٹیو تناؤ میں اضافہ کا مطلب ہے۔

4.6 شماریاتی تجزیہ

گراف پیڈ 7.02 سافٹ ویئر انکارپوریشن کا استعمال کرتے ہوئے اموات اور ڈیسمورفوجنیسیس کے لئے ارتکاز ردعمل کے منحنی خطوط کا حساب لگایا گیا اور اس کا اندازہ لگایا گیا۔ اضافی رقم کے مربع F ٹیسٹ کا استعمال وکر کے ہر ڈیٹا گروپ کے پیرامیٹرز کے فٹ کا موازنہ کرنے کے لئے کیا گیا تھا۔ اعتماد کا وقفہ 95 فیصد پر ایڈجسٹ کیا گیا۔

5. نتائج

اس تحقیق میں زیبرا فش ایمبریو کو ایک ماڈل آرگنزم کے طور پر استعمال کیا گیا تاکہ چھ فینولک مرکبات اور تین کیروٹینائڈز کی حفاظتی صلاحیت کو جانچا جا سکے جو عام طور پر کھانے میں پائے جاتے ہیں۔ تمام مرکبات، سوائے کیروٹین کے، نے آکسیڈیٹیو-تناؤ-حوصلہ افزائی مہلکیت کے خلاف حفاظتی اثرات دکھائے۔ مزید برآں، apigenin، rutin، اور curcumin نے tBOOH کی حوصلہ افزائی dysmorphogenesis کے خلاف حفاظتی اثرات کی بھی نمائش کی۔ ہم تجویز کرتے ہیں کہ زیبرا فش ایمبریو ٹیسٹ، جیسا کہ یہاں پیش کیا گیا ہے، ممکنہ اینٹی آکسیڈینٹ صلاحیت کے ساتھ نوول بائیو ایکٹیو فوڈ اجزاء کے ویوو حفاظتی اثرات کا جائزہ لینے کے لیے لاگو کیا جا سکتا ہے۔

کرسٹینا آرٹیگا 1,20، نوریا بوکس 13، ایلیسابیٹ ٹیکسیڈو 13⑤، فرنینڈا ماریزاندے 2، سینٹیاگو کیڈینا 4 اور البرٹو بسٹیلوس 5،*

1 ٹاکسیکولوجی یونٹ، فارماکولوجی، ٹوکسیکولوجی اور تھیراپیوٹیکل کیمسٹری ڈیپارٹمنٹ، فارمیسی سکول،

یونیورسٹی آف بارسلونا، Avda Joan XXIIs/n,08028Barcelona, ​​Spain;

2 فیکلٹی آف ہیلتھ سائنسز، نیوٹریشن، اینڈ ڈائیٹکس، ٹیکنیکل یونیورسٹی آف امباٹو، امباٹو 180207، ایکواڈور؛

3 INSA-UB نیوٹریشن اینڈ فوڈ سیفٹی ریسرچ انسٹی ٹیوٹ، فوڈ، اینڈ نیوٹریشن ٹوریبیرا کیمپس،

یونیورسٹی آف بارسلونا، پراٹ ڈی لا ریبا 171، 08921 سانتا کولوما ڈی گرامینیٹ، سپین

4 فیکلٹی آف اپلائیڈ سائنسز، انٹرنیشنل SEK یونیورسٹی، کوئٹو 170134، ایکواڈور؛

5 فیکلٹی آف ہیلتھ سائنسز، میڈیسن، ٹیکنیکل یونیورسٹی آف امباٹو، امباٹو 180207

حوالہ جات

1. ٹین، بی ایل؛ نورہیزان، ایم ای؛ لیو، W.P.-P. غذائی اجزاء اور آکسیڈیٹیو تناؤ: دوست یا دشمن؟ آکسائڈ. میڈ. سیل لونگیو۔ 2018، 2018، 9719584۔ [کراس ریف] [پب میڈ]
2. Sies، H. بایو کیمسٹری آف آکسیڈیٹیو اسٹریس۔ اینجیو Chemie Int. ایڈ انگلش 1986، 25، 1058–1071۔ [کراس ریف]
3. Dröge, W. سیل فنکشن کے جسمانی کنٹرول میں فری ریڈیکلز۔ فزیول Rev. 2002, 82, 47-95. [کراس ریف] [پب میڈ]
4. ریندرا، ای. Riabov, V.; موسل، ڈی ایم؛ Sevastyanova, T.; ہارمسن، ایم سی؛ Kzhyshkowska، J. ری ایکٹو آکسیجن پرجاتیوں (ROS) میں میکروفیج ایکٹیویشن اور ذیابیطس میں کام۔ امیونو بایولوجی 2019، 224، 242–253۔ [کراس ریف]
5. لن، ایم ٹی؛ بیل، ایم ایف مائٹوکونڈریل dysfunction اور neurodegenerative بیماریوں میں آکسیڈیٹیو کشیدگی. فطرت 2006، 443، 787–795۔ [کراس ریف] [پب میڈ]
6. تھیرونڈ، P. آکسیڈیٹیو تناؤ، اور بائیو مالیکیولز (لپڈ، پروٹین، ڈی این اے) کو پہنچنے والے نقصانات۔ این۔ فارم۔ Fr. 2006، 64، 383–389۔ [کراس ریف]
7. ارمک، جی؛ ڈیوس، کے جے اے کیلشیم اور آکسیڈیٹیو تناؤ: سیل سگنلنگ سے سیل کی موت تک۔ مول امیونول۔ 2002، 38، 713–721۔ [کراس ریف]
8. ودھوا، آر. گپتا، آر. موریا، پی کے آکسیڈیٹیو تناؤ اور نیوروڈیجینریٹو اور نیوروپسیچائٹرک ڈس آرڈر میں تیز عمر۔ کرر فارم۔ دیس 2018، 24، 4711–4725۔ [کراس ریف]
9. میریٹیم، اے سی؛ سینڈرز، RA؛ واٹکنز، جے بی ذیابیطس، آکسیڈیٹیو تناؤ، اور اینٹی آکسیڈینٹ: ایک جائزہ۔ جے بائیو کیم۔ مول ٹاکسیکول۔ 2003، 17، 24-38۔ [کراس ریف]
10. سنہا، این. دبلا، پی کے آکسیڈیٹیو تناؤ، اور ہائی بلڈ پریشر میں اینٹی آکسیڈینٹ - ایک موجودہ جائزہ۔ کرر ہائپرٹین. Rev. 2015, 11, 132–142. [کراس ریف]
11. Klaunig، JE آکسیڈیٹیو تناؤ اور کینسر۔ کرر فارم۔ دیس 2018، 24، 4771–4778۔ [کراس ریف] [پب میڈ]
12. Sies، H. آکسیڈیٹیو تناؤ: ریڈوکس حیاتیات اور طب میں ایک تصور۔ ریڈوکس بائیول۔ 2015، 4، 180–183۔ [کراس ریف]
13. Pietta، P.-G. فلاوونائڈز بطور اینٹی آکسیڈینٹ۔ جے نیٹ پیداوار 2000، 63، 1035–1042۔ [کراس ریف]
14. ہیلی ویل، بی۔ گٹیرج، حیاتیات اور طب میں JMC فری ریڈیکلز، 5ویں ایڈیشن؛ Oxford University Press: Oxford, UK, 2015; آئی ایس بی این 9780198717478۔
15. ہول مین، پی سی؛ کتان، ایم بی ڈائیٹری فلیوونائڈز: انٹیک، صحت کے اثرات، اور جیو دستیابی۔ فوڈ کیم۔ ٹاکسیکول۔ انٹر جے پبلی Br Ind. Biol. Res. ایسوسی ایشن 1999، 37، 937-942۔ [کراس ریف]
16. ہرٹوگ، ایم جی؛ ہولمین، پی سی؛ کتان، ایم بی؛ Kromhout, D. ہالینڈ میں بالغوں میں ممکنہ طور پر اینٹی کارسینوجینک فلیوونائڈز اور ان کے تعین کنندگان کا استعمال۔ نٹر کینسر 1993، 20، 21-29۔ [کراس ریف]
17. Martínez, S.; گونزالیز، جے؛ کیولبراس، جے؛ Tuñón، M. Flavonoides: Propiedades y acciones antioxidantes۔ نٹر ہسپتال 2002، 17، 271–278۔
18. آرٹیگا، سی. Bustillos, A.; Gómez, J. Migración de neutrófifilos en larvas de pez cebra expuestos a extractos de sofrito de tomate. محراب لاطینی۔ نٹر 2021، 70، 216–224۔ [کراس ریف]
19. نوجوان، اے جے؛ لو، جی ایل کیروٹینائڈز - اینٹی آکسیڈینٹ خصوصیات۔ اینٹی آکسیڈینٹ 2018، 7، 28۔ [کراس ریف] [پب میڈ]
20. زاویر، اے اے او؛ Pérez-Gálvez، A. کیروٹینائڈز غذا میں اینٹی آکسیڈینٹس کے ذریعہ کے طور پر۔ سب سیل۔ بائیو کیم۔ 2016، 79، 359–375۔ [کراس ریف] [پب میڈ]
21. Stahl، W.؛ Sies، H. کیروٹینائڈز کی اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی۔ مول ایس پی میڈ. 2003، 24، 345–351۔ [کراس ریف]
22. Boix, N.; Teixido, E.; Pique, E.; Llobet, JM; Gomez-Catalan, J. زیبرا فش میں آکسیڈینٹ انڈسڈ ڈویلپمنٹ ٹوکسیسیٹی کے خلاف اینٹی آکسیڈینٹ مرکبات کے ماڈیولیشن اور تحفظ کے اثرات۔ اینٹی آکسیڈنٹس 2020, 9, 721۔ [کراس ریف]
23. فینٹن، ایچ جے ایچ آئرن کی موجودگی میں ٹارٹرک ایسڈ کا آکسیڈیشن۔ جے کیم Soc ٹرانس 1894، 65، 899-910۔ [کراس ریف]
24. Phaniendra، A.؛ جسٹیڈی، ڈی بی؛ پیریاسامی، ایل فری ریڈیکلز: پراپرٹیز، ذرائع، اہداف، اور مختلف بیماریوں میں ان کا اثر۔ ہندوستانی جے کلن۔ بائیو کیم۔ 2015، 30، 11-26۔ [کراس ریف] [پب میڈ]
25. Fernández-Pachón, MS; Villaño, D.; Troncoso, AM; García-Parrilla، MC Revisión de los métodos de evaluación de la actividad antioxidante in vitro del vino y valoración de sus efectos in vivo. محراب لاطینی۔ نٹر 2006، 56، 110-122۔ [پب میڈ] 26۔ کیویا سائیز، ایم۔ بسٹو، ایم ڈی؛ Pilar-Izquierdo, MC; اورٹیگا، این. پیریز میٹیوس، ایم۔ Muñiz، P. اینٹی آکسیڈینٹ خصوصیات، ریڈیکل اسکیوینگنگ سرگرمی، اور فلیوونائڈ نارینجن اور اس کے گلائکوسائیڈ نارنگن کی بایومولیکول تحفظ کی صلاحیت: ایک تقابلی مطالعہ۔ جے سائنس فوڈ ایگریک۔ 2010، 90، 1238–1244۔ [کراس ریف] [پب میڈ]
27. پٹیل، K.؛ سنگھ، جی کے؛ پٹیل، ڈی کے نارینجنن کے فارماسولوجیکل اور تجزیاتی پہلوؤں پر ایک جائزہ۔ ٹھوڑی J. انٹیگر میڈ. 2014، 24، 551–560۔ [کراس ریف]
28. رشمی، آر. Magesh, SB; رام کمار، کے ایم؛ سوری نارائنن، ایس. Subbarao، MV نارنجینن کی اینٹی آکسیڈینٹ صلاحیت جگر کے بافتوں کو اسٹریپٹوزوٹوسن کی حوصلہ افزائی سے ہونے والے نقصان سے بچانے میں مدد کرتی ہے۔ نمائندہ بائیو کیم۔ مول بائول 2017، 7، 76–84۔
29. شکلا، آر. پانڈے، وی. وڈنیرے، جی پی؛ لودھی، S. باب 18 - سوزش کی خرابی کے انتظام میں فلیوونائڈز کا کردار۔ گٹھیا اور متعلقہ سوزش کی بیماریوں کے لئے غذائی مداخلت کے طور پر حیاتیاتی خوراک میں؛ واٹسن، آر آر، پریڈی، وی آر، ایڈز؛ اکیڈمک پریس: لندن، یوکے، 2019؛ صفحہ 293-322؛ ISBN 978-0-12-813820-5۔
30. چن، YH؛ یانگ، زیڈ ایس؛ وین، سی سی؛ چانگ، وائی ایس؛ وانگ، BC؛ Hsiao, CA; شیہ، ٹی ایل فلیوونائڈز کی ساخت اور سرگرمی کے تعلق کی تشخیص بطور اینٹی آکسیڈینٹ اور زیبرا فش لاروا کے زہریلے مادے۔ فوڈ کیم۔ 2012، 134، 717–724۔ [کراس ریف]
31. کشمین، ایم. Zhu, H.; گیہلن، آر ایل؛ کریکر، اے جے سنتھیسز اور پروٹین-ٹائروسین کناسز p56lck، EGFr، اور p60v-src کے ممکنہ روکنے والوں کے طور پر امینوفللاوونز کی ایک سیریز کا بائیو کیمیکل تشخیص۔ جے میڈ کیم 1994، 37، 3353–3362۔ [کراس ریف]
32. Ciffi, G.; پیسکا، ایم ایس؛ ڈی کیپراریس، پی. براکا، اے. Severino, L.; ڈی ٹوماسی، این. زیتون کے تیل میں فینولک مرکبات اور سلینٹو (کیمپینیا، اٹلی) سے زیتون کے پومیس اور ان کی اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی۔ فوڈ کیم۔ 2010، 121، 105–111۔ [کراس ریف]

33. بلوٹا، ایس. Corradino, R.; سیلانو، ایم؛ D'Agostino، M. Maiuolo، J.؛ اولیوریو، ایم؛ پروکوپیو، اے۔ Iannone، M. روٹیروتی، ڈی۔ روسو، ڈی. اولیورپین کے چھاتی کے کینسر کے خلیات پر اینٹی پرولیفیریٹو اور اینٹی آکسیڈینٹ اثرات اور اس کے نیم مصنوعی ہائپراسیٹیلیٹڈ مشتقات۔ فوڈ کیم۔ 2011، 127، 1609–1614۔ [کراس ریف]
34. ہان، جے؛ Talorete, TPN; یامادا، پی. Isoda, H. انسانی چھاتی کے کینسر کے MCF-7 خلیات پر oleuropein اور hydroxytyrosol کے antiproliferative اور apoptotic اثرات۔ سائٹو ٹیکنالوجی 2009، 59، 45–53۔ [کراس ریف] [پب میڈ]
35. لیانگ، این. کٹس، ڈی ڈی آکسیڈیٹیو اور اشتعال انگیز تناؤ کے حالات کو کنٹرول کرنے میں کلوروجینک ایسڈ کا کردار۔ غذائی اجزاء 2015، 8، 16۔ [کراس ریف] [پب میڈ]
36. پارک، S.-Y.؛ فریڈمین، این ڈی؛ ہیمن، CA؛ لی مارچینڈ، ایل۔ ولکنز، ایل آر؛ سیٹیاوان، کافی کی کھپت کی وی ڈبلیو ایسوسی ایشن غیر سفید آبادیوں میں کل اور وجہ سے متعلق اموات کے ساتھ۔ این۔ انٹرن میڈ. 2017، 167، 228–235۔ [کراس ریف] [پب میڈ]
37. تاجک، ن. تاجک، ایم. میک، آئی۔ اینک، پی. کلوروجینک ایسڈ کے ممکنہ اثرات، کافی میں اہم فینولک اجزاء، صحت پر: ادب کا ایک جامع جائزہ۔ یور جے نٹر 2017، 56، 2215–2244۔ [کراس ریف] [پب میڈ]
38. پول، آر. کینیڈی، OJ؛ روڈرک، پی. فالوففیلڈ، جے اے؛ ہیز، پی سی؛ پارکس، جے کافی کی کھپت اور صحت: متعدد صحت کے نتائج کے میٹا تجزیہ کا چھتری جائزہ۔ BMJ 2017, 359, j5024. [کراس ریف] [پب میڈ]
39. تنویر، ای ایم؛ ہوسن، ایم ایس؛ حسین، ایم ایف؛ افروز، آر۔ Gan, SH; خلیل، ایم آئی؛ کریم، N. بنگلہ دیش کی مشہور ہلدی (Curcuma longa) اقسام کی اینٹی آکسیڈینٹ خصوصیات۔ J. فوڈ کوال۔ 2017، 2017، 8471785۔ [کراس ریف]
40. فیڈر، جے؛ برڈا، K. انسانی صحت اور بیماری میں اینٹی آکسیڈینٹ کے طور پر کیروٹینائڈز کا ممکنہ کردار۔ غذائی اجزاء 2014، 6، 466–488۔ [کراس ریف]
41. Eggersdorfer, M.; Wyss, A. انسانی غذائیت اور صحت میں کیروٹینائڈز۔ محراب بائیو کیم۔ بائیوفیس۔ 2018، 652، 18–26۔ [کراس ریف]
42. پدمنابھن، پی. چیمہ، اے۔ پالیاتھ، جی سولانیسیس پھل جن میں ٹماٹر، بینگن، اور مرچ، پہلا ایڈیشن؛ Elsevier Ltd: لندن، UK، 2015۔
43. کتجا-تومولا، ایم کے؛ Kontto, JP; Männistö, S.; البانس، ڈی. Virtamo، JR میکروواسکولر پیچیدگیوں اور ذیابیطس سے کل اموات پر الفا-ٹوکوفیرول اور بیٹا کیروٹین سپلیمنٹ کا اثر: اے ٹی بی سی مطالعہ کے نتائج۔ این۔ میڈ. 2010، 42، 178–186۔ [کراس ریف]
44. امباتی، آر آر؛ موئی، پی ایس؛ راوی، ایس. Aswathanarayana، RG Astaxanthin: ذرائع، نکالنے، استحکام، حیاتیاتی سرگرمیاں، اور اس کی تجارتی ایپلی کیشنز - ایک جائزہ۔ مارچ منشیات 2014، 12، 128–152۔ [کراس ریف] [پب میڈ]
45. ڈینیری، PA جنین کی نشوونما پر آکسیڈیٹیو تناؤ کے اثرات۔ پیدائشی نقائص Res. سی ایمبریو ٹوڈے 2007، 81، 155–162۔ [کراس ریف] [پب میڈ]
46. ​​Selderslaghs, IWT; بلسٹ، آر. وِٹرس، ایچ ای فزیبلٹی اسٹڈی زیبرا فش پرکھ کا ایک متبادل طریقہ کے طور پر 27 مرکبات کے تربیتی سیٹ کا استعمال کرتے ہوئے ترقیاتی زہریلا اور ایمبریوٹوکسائٹی کی اسکریننگ کے لیے۔ دوبارہ پیش کریں۔ ٹاکسیکول۔ 2012، 33، 142–154۔ [کراس ریف]
47. کامل، سی بی؛ بیلارڈ، ڈبلیو ڈبلیو؛ کامل، ایس آر؛ المن، بی. شلنگ، ٹی ایف زیبرا فش کی جنین کی نشوونما کے مراحل۔ دیو ڈائن 1995، 203، 253–310۔ [کراس ریف] [پب میڈ]
48. Teixidó, E.; Pique, E. Gómez-Catalan J.; Llobet، JM زیبرا فش ایمبریو ٹیراٹوجینسیٹی پرکھ میں ترقیاتی تاخیر کا اندازہ۔ ٹاکسیکول۔ وٹرو 2013، 27، 469–478 میں۔ [کراس ریف] [پب میڈ]