C3 گلوومیرولوپیتھی میں IgG فیکٹر H فیوژن پروٹینز کے ساتھ اور بغیر ٹارگٹنگ ڈومینز کے ذریعے تکمیلی سرگرمی کو منظم کیا جاتا ہے۔

رابطہ:joanna.jia@wecistanche.com/ واٹس ایپ: 008618081934791

Alyssa C. Gilmore, Yuchun Zhang, H. Terence Cook', Deborah P. Lavin, Suresh Katti, YiWang2, Krista K. Johnson, SungKwon Kim², and Matthew C. Pickering

'سینٹر فار انفلامیٹری ڈیزیز، امپیریل کالج لندن، یو کے؛ اور²Alexion Pharmaceuticals, New Haven, Connecticut, USA

C3 glomerulopathyگلوومیرولی کے اندر تکمیلی C3 کے جمع ہونے کی خصوصیت ہے۔ اسباب میں شامل ہیں لیکن ان تک محدود نہیں ہیں، فیکٹر H میں اسامانیتا، تکمیلی متبادل راستے کا بڑا منفی ریگولیٹر۔ فیکٹر H- کمی (Cfh-/-) چوہے C3 تیار کرتے ہیں۔glomerulopathyپلازما C3 کی سطح میں کمی کے ساتھ۔ اس ماڈل کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے فیکٹر H متبادل پاتھ وے ریگولیٹری ڈومینز (FH1-5) پر مشتمل دو فیوژن پروٹینز کی افادیت کا اندازہ کیا۔

یا تو نان ٹارگٹنگ ماؤس امیونوگلوبلین (IgG-FH1-5) یا اینٹی ماؤس پروپرڈین اینٹی باڈی (Anti-P-FH1-5) سے منسلک۔ دونوں پروٹینوں نے پلازما C3 میں اضافہ کیا اور glomerular C3 کے جمع ہونے کو مساوی حد تک کم کر دیا، یہ تجویز کرتا ہے کہ FH1-5 کے لیے پلازما یا گلوومیرولی میں سے کسی ایک میں C3 ایکٹیویشن کو تبدیل کرنے کے لیے مناسب ہدف کی ضرورت نہیں تھی۔ IgG-FH1-5 انتظامیہ کے بعد، پلازما C3 کی سطح وقتی طور پر فیکٹر B کی سطحوں میں تبدیلیوں کے ساتھ منسلک ہوتی ہے جبکہ پلازما C5 کی سطح پلازما پروپرڈین کی سطحوں میں تبدیلیوں کے ساتھ منسلک ہوتی ہے۔ خاص طور پر، پلازما میں اضافہ

C5 اور پروپرڈین کی سطح C3 اور فیکٹر B میں اضافے سے زیادہ دیر تک برقرار رہی۔ Cfh-/- چوہوں میں IgG-FH1-5 نے تیز سیرم نیفروٹوکسک ورم ​​گردہ کے دوران گردے کی چوٹ کو کم کیا۔ اس طرح، ہمارے اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ IgG-FH1-5 نے گردش کرنے والی متبادل راستے کی سرگرمی کو بحال کیا اور Cfh-/- چوہوں میں گلومیرولر C3 جمع کو کم کیا اور یہ کہ پلازما پروپرڈین کی سطح عنصر H کی کمی میں C5 کنورٹیز سرگرمی کا ایک حساس مارکر ہے۔ امیونوگلوبلین کنجوگیٹڈ FH1-5 پروٹین، اپنی نسبتاً لمبی پلازما نصف زندگی کے ذریعے، C3 کے لیے ممکنہ علاج ہو سکتا ہے۔glomerulopathy.

Cistanche Glomerulopathy میں مدد کر سکتا ہے۔

ترجمہی بیان

C3 glomerulopathy(C3G) گردے کی ایک بیماری ہے جس کی خصوصیت گلومیرولی اور گلوومیرولر نقصان کے اندر اضافی C3 کے غیر معمولی جمع ہونے سے ہوتی ہے۔ یہ تکمیلی متبادل راستے کے بے قابو ہونے کی وجہ سے ہے۔ فیوژن پروٹین، متبادل پاتھ وے ریگولیٹر کے فنکشنل ڈومینز پر مشتمل، فیکٹر H (FH)، ایک اینٹی باڈی سے منسلک، تکمیلی ضابطے کو بحال کرتا ہے، اور C3G ماؤس ماڈل میں گلومیرولر C3 کو کم کرتا ہے۔ غیر ٹارگیٹنگ اینٹی باڈی کنجوجیشن کے نتیجے میں نسبتاً طویل فیوژن پروٹین پلازما نصف زندگی بنتی ہے، اور یہ، یا اسی طرح کے کنجوجیشن کے طریقے، C3G کے علاج میں FH فنکشن کو بڑھانے کے لیے استعمال کیے جا سکتے ہیں۔

C3 glomerulopathy(C3G) ایک تکمیلی ثالثی گردوں کا عارضہ ہے جس کی خصوصیت glomeruli کے اندر C3 کی غیر معمولی مقدار سے ہوتی ہے۔ 1 یہ گردوں کی خرابی کی طرف بڑھ سکتا ہے اور اس کا کوئی حتمی علاج نہیں ہے۔ اے پی ایکٹیویشن کے نتیجے میں C3bBb (C3 کنورٹیز) کی پیداوار ہوتی ہے، ایک انزائم جو C3 کو بند کرتا ہے۔ ایک اور C3b مالیکیول کے اضافے کے بعد، نتیجے میں آنے والا C3bBbC3b کمپلیکس (C5 کنورٹیز) C5 کو مکمل کر سکتا ہے۔ بے قابو

C3G میں AP ایکٹیویشن C3، C5، فیکٹر B (FB) اور پروپرڈین کی گردش میں کمی کے ساتھ منسلک کیا جا سکتا ہے۔ بے قابو AP ایکٹیویشن کی وجوہات میں تکمیلی ریگولیٹرز میں فنکشن کی تبدیلیوں کا نقصان اور تکمیلی ایکٹیویٹرز میں فنکشن کی تبدیلیوں کا فائدہ شامل ہے۔2 اہم منفی AP ریگولیٹر فیکٹر H (FH) ہے، اور انسانوں، سوروں اور چوہوں میں FH کی کمی C3G سے وابستہ ہے۔ 3 C3 نیفریٹک فیکٹر، ایک اینٹی باڈی جو AP C3 کنورٹیز کو مستحکم کرتا ہے C3G میں کثرت سے پایا جاتا ہے۔ منحصر C3 nephritic عنصر) 5,6

اگرچہ پروپرڈین کی کمی نے پلازما C3 کی سطح کو بہتر نہیں کیا، C5 کی سطح میں اضافہ ہوا، جس سے یہ معلوم ہوتا ہے کہ C5 کی سرگرمی کے لیے properdin ضروری تھا لیکن C3 کنورٹیز نہیں۔8,9

ماؤس 10 یا انسانی FH11,12 سے Cfh–/– چوہوں کی انتظامیہ نے گلومیرولر C3 داغ کو کم کیا اور گردش کرنے والی C3 کی سطح میں اضافہ کیا۔ ایسی تعمیرات جن میں FH (mini-FH مالیکیولز) کے صرف ریگولیٹری اور ٹارگٹنگ ڈومینز ہوتے ہیں وہ بھی اس ماڈل میں کارآمد ہیں۔ ان میں TT30,14 ایک پروٹین شامل ہے جس میں FH (FH1-5) کے تکمیلی ریگولیٹری ڈومینز شامل ہیں جو تکمیلی رسیپٹر 2 کے تکمیلی بائنڈنگ ڈومینز سے منسلک ہیں، اور ہوموڈیمیرک FH مالیکیولز، 15 منی ایف ایچ مالیکیولز جو تکمیلی پابند ڈومینز پر مشتمل ہیں۔ فیکٹر H سے متعلقہ پروٹین 1۔

چونکہ C3G میں تکمیلی C3 ایکٹیویشن کو روکنے کی علاج کی افادیت زیر تفتیش ہے، اس لیے گلوومیرولر C3 جمع کرنے کے حرکیات اور گلومیرولی اور گردش دونوں کے اندر AP ایکٹیویشن سے اس کے تعلق کو سمجھنا ضروری ہے۔ مدافعتی پیچیدہ ثالثی گلوومیرولونفرائٹس کے ماڈلز میں، گلومیرولر C3c تکمیلی ایکٹیویشن کو روکنے کے 24 گھنٹوں کے اندر صاف ہو جاتا ہے، جبکہ گلومیرولر C3d ہفتوں تک برقرار رہتا ہے۔ ، جبکہ گلومیرولر C3d میں کوئی تبدیلی نہیں ہے۔11

اس مطالعے میں، ہم نے C3G کے Cfh-/- ماؤس ماڈل میں تکمیلی ریگولیٹری سرگرمی کے ساتھ 2 ناول فیوژن پروٹین کی افادیت کی چھان بین کی۔ پروٹین میں ماؤس FH (FH1-5) کے ریگولیٹری ڈومینز شامل تھے، جو حیاتیاتی نصف زندگی کو طول دینے کے لیے ماؤس Ig سے جوڑ دیا گیا تھا۔ فیوژن پروٹینوں میں سے ایک، جسے IgG-FH1-5 کہا جاتا ہے، ایک غیر ٹارگٹنگ ماؤس مونوکلونل اینٹی باڈی سے جوڑ دیا گیا تھا۔ دوسرا، جسے اینٹی P-FH1-5 کہا جاتا ہے، کو ایک مونوکلونل اینٹی باڈی ٹو ماؤس پرپرڈین سے جوڑ دیا گیا تھا۔ یہ اس مفروضے کو جانچنے کے لیے کیا گیا تھا کہ اس فیوژن پروٹین کو تکمیلی ایکٹیویشن کی جگہوں پر نشانہ بنانا، مناسب طریقے سے جمع کرنے کے ساتھ تعامل کرکے، ٹشو کمپلیمنٹ ریگولیشن کو بڑھا دے گا۔ ہمارا ڈیٹا یہ ظاہر کرتا ہے کہ دونوں نان ٹارگٹنگ (IgG-FH1-5) اور مناسب طریقے سے ٹارگٹنگ (اینٹی P-FH1-5) پروٹین نے Cfh–/– چوہوں میں پلازما اور گلومیرولر C3 ریگولیشن کو بحال کیا۔ ٹائم کورس کے مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ C3 اور FB کی سطحوں کی بحالی نے گردش میں فیوژن پروٹین کی سطح کی عکاسی کی ہے۔ اس کے برعکس، فیوژن پروٹین گردش سے صاف ہونے کے بعد پلازما C5 میں اضافہ برقرار رہا۔ ہم دکھاتے ہیں کہ Cfh–/– چوہوں میں تیز سیرم نیفروٹوکسک ورم ​​گردہ کے دوران IgG-FH1-5 نے گلومیرولر چوٹ کو بہتر بنایا۔

cistanche گردوں کی بیماری کا علاج کر سکتے ہیں گردوں کی تقریب کو بہتر بنانے کے

نتائج

فیوژن پروٹین کی تخلیق اور وٹرو اور ان ویوو سرگرمی کی تشخیص فیوژن پروٹین ماؤس FH (FH1-5) کے پہلے 5 مختصر متفقہ ریپیٹ (SCR) ڈومینز کو اینٹی ماؤس پروپرڈین اینٹی باڈی (اینٹی ماؤس پروپرڈین اینٹی باڈی) سے جوڑ کر بنائے گئے تھے۔ -P-FH1-5) یا ایک اینٹی باڈی جس میں غیر ٹارگٹنگ Ig ڈومین (IgG-FH1- 5، سپلیمنٹری فگر S1) ہے۔ پروٹین کی سرگرمی کا اندازہ اے پی مخصوص ہیمولٹک پرکھ (شکل 1a) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ اینٹی P-FH1-5 اور IgG-FH1-5 نے خوراک پر منحصر طریقے سے اینٹی P-FH1-5 کی زیادہ طاقت کے ساتھ ہیمولائسز کو روکا۔ اینٹی پرپرڈین (اینٹی پی) نے بھی خوراک پر منحصر انداز میں ہیمولیسس کو کم کیا، لیکن آئی جی جی کنٹرول کا کوئی اثر نہیں ہوا۔ Cfh–/– چوہوں میں پروٹین کے مساوی انجیکشن کے بعد، IgG-FH1-5 پروٹین کو انجیکشن کے 11 دن بعد تک پہچانا جا سکتا تھا، جب کہ اینٹی P-FH1-5 کا پتہ لگانے کے 4 دن بعد تک ممکن تھا۔ انجیکشن (ضمنی شکل S2)۔ اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا IgG- FH1-5 اور anti-P-FH1-5 Cfh–/– چوہوں میں پلازما AP ریگولیشن کو بحال کر سکتے ہیں، ہم نے سب سے پہلے فیوژن پروٹین کے انجیکشن کے بعد پلازما C3 کی سطح کی پیمائش کی (شکل 1b) . IgG-FH1-5 یا اینٹی P-FH1-5 کی انتظامیہ نے 24 گھنٹے میں پلازما C3 کو نمایاں طور پر بڑھایا اور، ایک حد تک، انجیکشن کے 96 گھنٹے بعد (شکل 1b)۔ ان اعداد و شمار نے ظاہر کیا کہ IgG-FH1-5 اور anti-P-FH1-5 دونوں Cfh–/– چوہوں میں پلازما AP ریگولیشن کو عارضی طور پر بحال کر سکتے ہیں۔ اس کے بعد ہم نے ان تبدیلیوں کا نہ صرف پلازما C3 بلکہ پلازما C5 اور متبادل پاتھ وے پروٹینز FB اور properdin میں ہونے والی تبدیلیوں کے ٹائم کورس کو نمایاں کرتے ہوئے ان تبدیلیوں کا تفصیلی تجزیہ کیا۔ Cfh–/– چوہوں میں IgG-FH1-5 اور anti-P-FH1-5 کے استعمال کے بعد گردش کرنے والے C5 اور پرپرڈین کی سطح میں اضافہ C3 اور FB میں اضافے سے زیادہ دیر تک برقرار رہتا ہے۔

ہم نے IgG-FH1-5 یا اینٹی P-FH1-5 کے ایک انجیکشن کے بعد 27 دن تک وقفوں پر پروٹین کی پیمائش کرکے C3، C5، FB اور پروپرڈین میں تبدیلیوں کے حرکیات کا موازنہ کیا۔ تصویر 2)۔ IgG-FH1-5 کی انتظامیہ کے بعد، C3، C5، FB، اور پرپرڈین میں چوٹی کا اضافہ سب کچھ انجیکشن کے بعد 1 دن میں ہوا۔ ان تبدیلیوں کا علاج سے پہلے کی سطح پر آنے کا وقت مختلف تھا۔ پری ٹریٹمنٹ لیول پر واپسی FB کے لیے 1 اور 4 دن کے درمیان، C3 کے لیے 7 اور 11 دنوں کے درمیان، اور properdin اور C5 دونوں کے لیے 14 اور 21 دنوں کے درمیان ہوئی (شکل 2a، c، e، اور g)۔ اینٹی P-FH1-5 کے انتظام کے بعد، چوٹی C3 کی سطح پہلے دن میں واقع ہوئی لیکن 4 اور 7 دنوں کے درمیان پہلے سے علاج کی سطح پر گر گئی (شکل 2b)۔ چوٹی C5 کی سطح 4 دن پر واقع ہوئی اور 7 اور 11 دنوں کے درمیان پہلے سے علاج کی سطح پر واپس آگئی (شکل 2d)۔ ایف بی میں چوٹی کا اضافہ دن 1 کو ہوا اور 1 اور 4 دنوں کے درمیان پہلے سے علاج کی سطح پر گر گیا (شکل 2f)۔ جیسا کہ توقع کی گئی تھی، اینٹی P-FH1-5 یا اینٹی P (شکل 2h) کے انجیکشن کے بعد مفت پلازما پروپرڈین ختم ہو گیا تھا۔ اینٹی P-FH1-5 کے بعد 7 دنوں تک اور اینٹی پی (شکل 2h) کے بعد 14 دن تک مفت پلازما پروپرڈین کی سطح کم رہی۔ اگرچہ دونوں فیوژن پروٹینوں نے عارضی طور پر پلازما اے پی ریگولیشن کو بحال کیا، C3، FB، اور C5 کی سطحوں میں بہتری کا دورانیہ پلازما میں ان کے پتہ لگانے کی مدت کو ظاہر کرتا ہے، جو کہ اینٹی P-FH1-5 کے لیے کم تھا (ضمنی شکل S2) . خلاصہ طور پر، کسی بھی پروٹین کے انجیکشن کے بعد C3 اور FB کی سطحوں میں تبدیلیاں C5 اور پروپرڈین سے کم تھیں۔ یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ پلازما ایف بی اس ترتیب میں C3 کنورٹیز سرگرمی کا ایک حساس مارکر ہے، جبکہ پرپرڈین C5 کنورٹیز سرگرمی کا مارکر ہے۔ خاص طور پر، اینٹی پی انجیکشن کے بعد، 24 اور 96 گھنٹے اور دن 7 میں C5 میں اضافہ ہوا

تصویر 1| (a) متبادل راستے پر منحصر ہیمولیسس پرکھ کی تکمیل کریں۔ اینٹی باڈیز کو 60 nM سے لے کر 0.5 nM تک 2- گنا کم کرنے میں ٹائٹریٹ کیا گیا تھا۔ IgG-FH1-5، anti-P-FH1-5، اور اینٹی P ری ایجنٹس نے خوراک پر منحصر انداز میں خرگوش کے erythrocyte hemolysis کو کم کیا۔ IgG-کنٹرول پروٹین کو کوئی روکنا استعمال نہیں کیا گیا تھا۔ افقی سلاخیں اوسط قدروں کو ظاہر کرتی ہیں، اور ایرر بارز SD کی نمائندگی کرتی ہیں۔ (b) فیوژن پروٹین کے انجیکشن کے بعد Cfh–/– چوہوں میں پلازما تکمیلی C3۔ پلازما C3 کی پیمائش IgG-FH1-5 (سرخ مثلث، n ¼ 5) Anti–P–FH1-5 (جامنی مثلث، n ¼ 6)، اینٹی -P (سبز نقطے، n ¼ 5)، اور IgG-کنٹرول (نیلے نقطے، n ¼ 5)۔ افقی سلاخیں اوسط اقدار کو ظاہر کرتی ہیں، اور سرگوشیاں SD کو ظاہر کرتی ہیں۔ ***P # 0.001 بمقابلہ پری ٹریٹمنٹ ویلیو اور بونفرونی متعدد موازنہ ٹیسٹ کے ساتھ 2-طریقہ ANOVA سے اخذ کیا گیا ہے۔ FH، فیکٹر H؛ پی، مناسب

(شکل 2d)۔ جیسا کہ رپورٹ کیا گیا ہے، 8,9 اشارہ کرتا ہے کہ C5 کنورٹیز Cfh-/- چوہوں میں پرپرڈین پر منحصر ہے۔

IgG-FH1-5 اور anti-P-FH1-5 نے گلومیرولر C3c کو کم کیا لیکن Cfh–/– چوہوں میں C3d کے داغ کو تبدیل نہیں کیا۔

اس کے بعد ہم نے گلومیرولر C3b/iC3b/C3c، C3d، پروپرڈین، اور FH سے متعلق (FHR) پروٹینز پر IgG-FH1-5 اور anti-P-FH1-5 کے اثر کا اندازہ کیا۔ IgG- FH1-5 کے انجیکشن کے 96 گھنٹے بعد، گلومیرولر C3b/iC3b/C3c داغ کم ہو گیا تھا لیکن گلومیرولر C3d (فگر 3a) اور FHR سٹیننگ (فگر 3b) نہیں تھا۔ Glomerular C3b/iC3b/C3c آئی جی جی کنٹرول یا اینٹی پی کے ساتھ کوئی تبدیلی نہیں کی گئی۔ غیر علاج شدہ Cfh–/– چوہوں میں گلومیرولر پرپرڈین داغ کا غیر معمولی لکیری نمونہ IgG کنٹرول کے 96 گھنٹے بعد رہا۔ Cfh–/– چوہوں میں اینٹی پی یا IgG-FH1-5 کے ساتھ انجیکشن لگائے گئے، گلومیرولر پرپرڈین کی سطح 96 گھنٹے میں تقریباً ناقابل شناخت تھی (شکل 3b)۔ غیر متوقع طور پر، اینٹی پی-ایف ایچ1-5 انجیکشن کے نتیجے میں اینٹی پروپرڈین، اینٹی ایف ایچ/ایف ایچ آر، اور اینٹی آئی جی جی اینٹی باڈیز (شکل 3b) کا استعمال کرتے ہوئے دانے دار گلوومیرولر سٹیننگ پیٹرن نکلا۔ اس دریافت نے تجویز کیا کہ اینٹی P-FH1-5 پروٹین گلومیرولی میں جمع ہو رہا تھا۔ جنگلی قسم کے چوہوں میں اینٹی P-FH1-5 پروٹین کے انجیکشن کے نتیجے میں اینٹی پروپرڈین، اینٹی FH/FHR، اور اینٹی آئی جی جی اینٹی باڈیز کے ساتھ گلوومیرولر سٹیننگ 96 گھنٹے (ضمنی شکل S3) میں ظاہر ہوتا ہے۔ ریجنٹ عام گلوومیرولی کے ساتھ تعامل کرتا ہے۔ تاہم، ہم نے قیاس کیا کہ اینٹی P-FH1-5 پروٹین Cfh–/– چوہوں میں پہلے سے موجود گلومیرولر پروپرڈین کے ساتھ بھی تعامل کر سکتا ہے۔ جب ہم نے ریجنٹ کو Cfh–/– چوہوں میں انجیکشن لگایا جن کو گلومیرولر پرپرڈین کو ہٹانے کے لیے اینٹی پی کے ساتھ پہلے سے علاج کیا گیا تھا، تو اینٹی پرپرڈین، اینٹی ایف ایچ/ایف ایچ آر، اور اینٹی آئی جی جی اینٹی باڈیز کا استعمال کرتے ہوئے دانے دار داغ کے نمونوں میں کمی واقع ہوئی تھی۔ ضمنی شکل S4)۔ یہ مشاہدات بتاتے ہیں کہ Cfh–/– چوہوں میں اینٹی P-FH1-5 پروٹین کا گلومیرولر تعامل جزوی طور پر گلومیرولر پرپرڈین پر منحصر ہے۔

IgG-FH1-5 Cfh–/– چوہوں میں تیز سیرم نیفروٹوکسک ورم ​​گردہ کے دوران گردوں کی چوٹ میں بہتری

C3G والے مریضوں میں، شدید گردوں کی چوٹ انٹرکرنٹ انفیکشن کے تناظر میں پیدا ہو سکتی ہے۔ مثال کے طور پر، FHR5 نیفروپیتھی میں رینل فنکشن کی کمی کا تعلق synpharyngitic macroscopic hematuria کی اقساط سے ہے۔ اس کا نمونہ بنانے کے لیے، ہم نے تیز رفتار سیرم نیفروٹوکسک ورم ​​گردہ کی حوصلہ افزائی کی، ایک مدافعتی پیچیدہ

تصویر 2|Cfh–/– چوہوں میں پلازما تکمیلی پروفائل ٹائم کورس IgG-FH1-5 اور اینٹی P-FH1-5 کے ساتھ انجکشن لگایا گیا ہے۔ پلازما C3 (a,b) C5 (c,d), FB (e,f) اور properdin (P; g,h) تجرباتی آغاز سے IgG-FH کے سنگل انجیکشن کے 27 دن بعد تک{{1{{21} }}}} (a,c,e,g; سرخ مثلث، n ¼ 5) یا اینٹی P- FH1-5 (b,d,f,h; جامنی مثلث، n ¼ 6)۔ کنٹرولز میں اینٹی پی (سبز نقطے، n ¼ 5) اور ایک آاسوٹائپ سے مماثل مونوکلونل اینٹی باڈی (IgG- کنٹرول؛ نیلے نقطے، n ¼ 5) شامل تھے۔ افقی سلاخیں اوسط اقدار کو ظاہر کرتی ہیں، اور سرگوشیاں SD کو ظاہر کرتی ہیں۔ *P # 0۔ ایف بی، فیکٹر بی؛ FH، فیکٹر H.

glomerulonephritis ماڈل جس میں تکمیلی اور Fc رسیپٹر ثالثی راستے شامل ہیں، Cfh–/– چوہوں میں 18,19۔ ہم نے پہلے دکھایا تھا کہ Cfh–/– چوہے اس ترتیب میں گردوں کی چوٹ کے لیے انتہائی حساس ہوتے ہیں چونکہ ہمارے ڈیٹا نے اشارہ کیا ہے کہ اینٹی P-FH1-5 پروٹین عام گلوومیرولی میں جمع تھا، ہم نے IgG-FH1-5 کو تیز سیرم نیفروٹوکسک ورم ​​گردہ کے دوران استعمال کیا۔ بھیڑوں کے نیفروٹوکسک سیرم کے انجیکشن سے چوبیس گھنٹے پہلے، چوہوں کو آئی جی جی کنٹرول (n ¼ 7) یا IgG-FH1-5 (n ¼ 8) کا آئی پی انجیکشن ملا۔ تجرباتی پروٹوکول کو شکل 4a میں دکھایا گیا ہے۔ بھیڑوں کے نیفروٹوکسک سیرم کی انتظامیہ کے 6 دن بعد چوہوں کو مارا گیا۔ گلومیرولر پیتھالوجی کے تمام 3 ہسٹولوجک اقدامات (شدت کا سکور، کل سیل نمبر، اور میکروفیج نمبر) IgG-FH1-5 گروپ (شکل 4b) میں نمایاں طور پر کم تھے۔ IgG-FH1-5 گروپ (شکل 4b) میں ٹیوبولوئنٹرسٹیشل چوٹ بھی کم تھی۔ سیرم یوریا میں نمایاں طور پر اضافہ ہوا تھا۔

تصویر 3|IgG-FH1-5 یا اینٹی P-FH1-5 کے انجیکشن کے 96 گھنٹے بعد Cfh–/– چوہوں میں گلومیرولر کمپلیمنٹ امیونوسٹیننگ۔ (a) 4 تجرباتی گروپوں میں گلومیرولر C3b/iC3b/C3c اور C3d کی مقدار کے ساتھ نمائندہ تصاویر: IgG-FH1-5 (سرخ مثلث، n ¼ 5)، اینٹی P-FH1-5 (جامنی مثلث، n ¼ 6)، anti-P(سبز نقطے، n ¼ 5)، اورIgG-کنٹرول (نیلے نقطے، n ¼ 5)۔PlasmaC3 کی سطح اس وقت کا وقت ہے جس کی شکل 1۔ (b) ڈیٹا پوائنٹس درمیانی قدروں کی نمائندگی کرتے ہیں، اور سرگوشیاں ایک انٹرکوارٹائل رینج کو ظاہر کرتی ہیں۔ ڈن متعدد موازنہ ٹیسٹ کے ساتھ کرسکل والس ٹیسٹ سے حاصل کردہ P اقدار۔ (b)گلومیرولر آئی جی جی، ایف ایچ آر، اور 4 تجرباتی گروپوں کی نمائندہ تصاویر۔ بار ¼ 100 ملی میٹر۔ اے ایف یو، من مانی فلوروسینٹ یونٹس؛ FH، فیکٹر H؛ پی، مناسب اس تصویر کو دیکھنے کو بہتر بنانے کے لیے، براہ کرم اس مضمون کا آن لائن ورژن دیکھیںwww.kidney-international.org۔

IgG-کنٹرول گروپ، لیکن سیرم البومین اور پیشاب البومین سے کریٹینائن کے تناسب میں تبدیلیاں مختلف نہیں تھیں (شکل 4b)۔ جیسا کہ توقع کی گئی تھی، گلوومیرولر C3b/iC3b/C3c کو IgG-FH1-5 گروپ (شکل 4b) میں نمایاں طور پر کم کیا گیا تھا، لیکن گلومیرولر ماؤس IgG (شکل 4b) اور بھیڑوں کے IgG (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا) گروپوں کے درمیان مختلف نہیں تھا۔ .

تصویر 4|Cfh–/– چوہوں میں تیز سیرم نیفروٹوکسک ورم ​​گردہ کے دوران IgG-FH1-5 کے ساتھ پیشگی علاج سے گردوں کی چوٹ میں بہتری آئی۔ (a) ایکسلریٹڈ سیرم نیفروٹوکسک نیفرائٹس پروٹوکول کا اسکیمیٹک۔ بھیڑوں کے IgG کے ساتھ پہلے سے حفاظتی ٹیکے لگائے گئے چوہوں کو یا تو IgG-FH1-5 (علاج گروپ، n ¼ 8) یا IgG-کنٹرول (کنٹرول گروپ، n ¼ 7) بھیڑوں کے نیفروٹوکسک سیرم کے استعمال سے 24 گھنٹے پہلے موصول ہوا۔ (b) رینل فنکشن اور ہسٹولوجی چوہوں میں تیز سیرم نیفروٹوکسک ورم ​​گردہ کی شمولیت کے 6 دن بعد IgG-FH1-5 (علاج؛ سرخ مثلث، n ¼ 8) یا IgG-کنٹرول (کنٹرول؛ نیلے حلقوں، n) سے علاج کیا جاتا ہے۔ ¼ 7)۔ افقی سلاخیں درمیانی قدروں کو ظاہر کرتی ہیں، اور سرگوشیاں ایک انٹرکوارٹائل رینج کو ظاہر کرتی ہیں۔ *P # 0۔ FH، فیکٹر H؛ پی، مناسب

بحث

IgG-FH1-5 اور anti-P-FH1-5 دونوں نے Cfh–/– چوہوں میں C3، FB، اور C5 کی سطح کو معمول بنایا۔ یہ تلاش اس حقیقت سے مطابقت رکھتی ہے کہ ماؤس FH کے تکمیلی ریگولیٹری ڈومینز SCR ڈومینز 1 سے 5 کے اندر واقع ہیں (ایک C3b-بائنڈنگ سائٹ اور C3b کے فیکٹر I-ثالثی کلیویج کے لیے کوفیکٹر سرگرمی)۔20 سطح کی شناخت والے ڈومینز، جو ہیپرین اور اینڈوتھیلیل سیلز پر اثر انداز ہونے اور دوسری C3b بائنڈنگ سائٹ شامل ہے، SCR ڈومینز 18 کے اندر موجود ہیں۔

20 (FH18-20) اور اس وجہ سے فیوژن پروٹینز میں موجود نہیں ہیں۔ 20 اس کے باوجود، دونوں پروٹینوں نے گلومیرولر iC3b/C3b/C3c کو کم کیا، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ اس ترتیب میں FH18-20 کی ضرورت نہیں تھی۔ یہ تلاش پچھلے اعداد و شمار سے مطابقت رکھتی ہے جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ Cfh–/– SCR ڈومینز 1 سے 15 (Cfh–/– .FHD16-20) پر مشتمل ایک اتپریورتی FH پروٹین کا اظہار کرنے والے چوہوں نے غیر معمولی گلومیرولر C3 جمع نہیں کیا۔ 21,22 تاہم، Cfh–/–.FH D16-20 جانور رینل اینڈوتھیلیم کے ساتھ C3 ایکٹیویشن کو ریگولیٹ کرنے سے قاصر تھے اور تھرومبوٹک مائیکرو اینجیوپیتھی تیار ہوئی۔ یہ ممکن ہے کہ، FH18-20 ڈومینز کو ہدف بنانے والی سطح کی کمی کی وجہ سے، FH کی کمی میں FH1-5 پر مشتمل فیوژن پروٹین کا انتظام تھرومبوٹک مائکروانجیوپیتھی کے لیے حساسیت کا باعث بن سکتا ہے۔ یہ بھی ممکن ہے کہ فیوژن پروٹینز کے ڈائمرک ڈھانچے کے تحت C3b بائنڈنگ کے لیے بڑھتی ہوئی ایویڈیٹی، FH18-20 ڈومینز کو ہدف بنانے والے سطح کی عدم موجودگی کی تلافی کے لیے کافی ہے۔ تاہم، C3b کی سطح کی شناخت FH.23 A Streptococcus pneumoniae FH-binding پروٹین (PspCN، جو SCR ڈومین 9 کو باندھتی ہے) میں تبدیلیوں سے بھی متاثر ہوتی ہے، FH تبدیلی کو متحرک کرتی ہے، اور FH-PspCN کمپلیکس نے C3b بنڈنگ میں اضافہ کیا تھا۔ کشی کو تیز کرنے والی سرگرمی۔ FH20 C3d بائنڈنگ سائٹ FH میں ظاہر نہیں ہوتی ہے لیکن FH- PspCN کمپلیکس میں ظاہر ہوتی ہے۔ یہ وضاحت کر سکتا ہے کہ کیوں FH19-20 سطح C3d کے ساتھ تعامل کرتا ہے لیکن FH نہیں کرتا۔ 24,25 ہم قیاس کرتے ہیں کہ ہمارے ایجنٹس، تبدیلیوں کے ذریعے، مؤثر طریقے سے فلوئڈ فیز اور سطح C3b دونوں کے ساتھ تعامل کر سکتے ہیں۔ خاص طور پر، دونوں IgG-FH1-5 اور anti-P-FH1-5 نے AP پر منحصر ہیمولائسس پرکھ میں erythrocytes کو lysis سے محفوظ کیا۔

نہ ہی فیوژن پروٹین نے گلوومیرولر C3d داغ کو کم کیا، شاید گلوومرولر C3d کی مستقل نوعیت کی وجہ سے۔ تجرباتی مدافعتی پیچیدہ ورم گردہ میں، glomerular C3c تکمیلی ایکٹیویشن کے خاتمے کے 24 گھنٹوں کے اندر حل ہو گیا لیکن C3d ہفتوں تک برقرار رہا۔ 16 اس کے علاوہ، گلومیرولر C3d lupus nephritis میں مستقل رہتا ہے۔ Cfh–/– چوہوں میں انسانی FH کے بار بار لگائے جانے والے انجیکشن نے 10 دنوں کے دوران گلوومیرولر C3d میں کمی ظاہر کی۔ 11 یہ امکان ہے کہ IgG-FH1-5 کی بار بار خوراک اس ماڈل میں گلومیرولر C3d کو کم کر سکتی ہے۔ گلوومیرولر ایف ایچ آر داغ میں بھی کوئی تبدیلی نہیں ہوئی۔ ماؤس FHR پروٹین کے افعال کے بارے میں بہت کم معلوم ہے، لیکن وہ C3b27,28 اور C3d.27 دونوں کے ساتھ تعامل کر سکتے ہیں۔ درحقیقت، C3d کے لیے FHR-A اور FHR-B دونوں کا ظاہری تعلق FH.27 سے زیادہ مضبوط ہے۔ ہم قیاس کرتے ہیں کہ گلوومیرولر ایف ایچ آر پروٹین گلوومیرولی سے تب ہی صاف ہونے کا امکان ہے جب C3d کو ہٹا دیا گیا ہو۔ اس تناظر میں، یہ بات قابل ذکر ہے کہ انسانی C3G میں، عنصر H-متعلق پروٹین 5 glomerular C3d.29 کے ساتھ منسلک ہوتا ہے۔

اینٹی P-FH1-5 پروٹین نے فری پلازما پروپرڈین کی سطح کو توقع کے مطابق ختم کردیا کیونکہ اس فیوژن پروٹین کا اینٹی پرپرڈین حصہ ایک انجیکشن کے بعد 8 دن تک اے پی کی سرگرمی (پرپرڈین کی کمی کی وجہ سے) روک سکتا ہے۔30 تاہم، ہمارے اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ FH1-5 کی پلازما C3 کی سطح کو بڑھانے اور گلوومیرولر C3b/iC3b/C3c سٹیننگ کو کم کرنے میں 2 فیوژن پروٹین کے درمیان موازنہ تھا (یعنی، مناسب ہدف سے آزاد تھا)۔ مزید برآں، اینٹی پی یا IgG-FH1-5 کی انتظامیہ کے بعد غیر معمولی گلومیرولر پرپرڈین سٹیننگ کو نمایاں طور پر کم کیا گیا تھا۔ واضح طور پر، C3d اور FHR پروٹین کے برعکس، C3 ریگولیشن کی بحالی کے بعد glomerular properdin آسانی سے صاف ہو جاتا ہے۔ گلومیرولر پروپرڈین اینٹی P-FH پروٹین کے انتظام کے بعد پیٹرن میں تبدیل ہوا، لیکن یہ اس مشاہدے سے پیچیدہ تھا کہ ہمیں Cfh–/– اور جنگلی قسم کے گلومیرولی دونوں میں اس فیوژن پروٹین کے جمع ہونے کا پتہ چلا۔ یہ جزوی طور پر گلومیرولر پرپرڈین کے ساتھ تعامل کی وجہ سے تھا، لیکن جنگلی قسم کے گلومیرولی میں جمع ہونے سے ظاہر ہوتا ہے کہ یہ جزوی طور پر مکمل طور پر گلومیرولر تکمیل پر منحصر ہے اور ممکنہ طور پر فیوژن پروٹین کی فزیکو کیمیکل خصوصیات سے متعلق ہے۔

ہمارے حرکیاتی اعداد و شمار نے FB، C5، اور properdin میں وقتی تبدیلیوں سے متعلق نئے نتائج کا مظاہرہ کیا جو فیوژن پروٹین کے انجیکشن کے بعد Cfh-/- چوہوں میں C3 میں اضافہ کے ساتھ ہوتا ہے۔ انجیکشن کے بعد ایف بی کی سطح تیزی سے بڑھ گئی۔

اور ایک ایسے وقت میں بیس لائن لیول پر واپس آئے جب C5 اور properdin دونوں کی سطحیں بلند رہیں۔ IgG-FH1-5 کے انجیکشن کے بعد Cfh–/– چوہوں میں Properdin کی سطح بنیادی سطح پر کم ہوئی اور معمول کی سطح (20 mg/ml30) تک بڑھ گئی اور کم از کم 14 دن تک ان سطحوں پر رہی۔ پلازما C5 کی سطح میں اضافے کے لیے اسی طرح کا وقت دیکھا گیا۔ حیرت انگیز طور پر، IgG-FH1-5 زیادہ تر 11 دنوں میں گردش سے غائب تھا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ Cfh–/– چوہوں میں C5 کنورٹیز کی تشکیل C3 کنورٹیز کی نسبت سست ہے (کیونکہ C3 کی سطح بیس لائن پر واپس آگئی ہے۔ 7 اور 11 دن)۔ اینٹی پی علاج کے بعد پلازما C5 میں اضافہ ہوا اور اینٹی P-FH1-5 پروٹین کے ساتھ مزید اضافہ ہوا۔ لہذا، دونوں مناسب طریقے سے ہدف بنانا اور FH1-5 کے اثرات C5 کی بڑھتی ہوئی سطحوں میں حصہ ڈال رہے تھے اور اس بات کی نشاندہی کرتے ہیں کہ C5 کنورٹیز جزوی طور پر Cfh–/– چوہوں پر منحصر ہے۔ یہ تلاش FH اور پرپرڈین کی مشترکہ کمی کے ساتھ چوہوں میں C5 dysregulation کی بہتری کے ساتھ مطابقت رکھتی ہے۔ 8,9 گردش کرنے والی پروپرڈین کی سطح کو C3G میں کم کیا جا سکتا ہے اور یہ پلازما C5 یا گھلنشیل C5b کے برعکس سطح C5 کنورٹیز سرگرمی سے منسلک دکھائی دیتا ہے۔ {30}}.31,32 ہمارا ڈیٹا پروپرڈین لیولز اور C5 کنورٹیز سرگرمی کے درمیان گہرے ربط کی حمایت کرتا ہے اور جاری گلوومیرولر C5 ایکٹیویشن کے بائیو مارکر کے طور پر پرپرڈین لیول کے استعمال کی حمایت کرتا ہے۔

خاص طور پر، IgG-FH1-5 پروٹین ایک انجیکشن کے بعد 11 دن تک گردش میں اب بھی قابل شناخت تھا۔ یہ اس سے کہیں زیادہ لمبا ہے جو ہم نے پہلے غیر مربوط ماؤس FH1-5 پروٹین کے لیے رپورٹ کیا تھا، جسے 24 گھنٹے کے اندر گردش سے ہٹا دیا گیا تھا۔ {9}} پروٹین اینٹی باڈی کنجوجیشن سے اخذ کیا گیا ہے۔ IgG-FH1-5 پروٹین کی پلازما نصف زندگی بھی اس سے لمبی تھی جو ہم نے پہلے پوری لمبائی FH.10,11 کے لیے دیکھی تھی۔ مثال کے طور پر، انسانی FH کو ایک انجیکشن کے بعد 96 گھنٹے تک گردش سے ہٹا دیا گیا تھا۔ Cfh–/– چوہوں میں۔ 11 تکمیلی ضابطے میں IgG-FH1-5 پروٹین کی افادیت کو ظاہر کرنے والے ہمارے اعداد و شمار کے ساتھ مل کر، ہم سمجھتے ہیں کہ FH1-5 پروٹین کو اس کے فارماکوکینیٹک پروفائل کو طول دینے کے لیے اس میں ممکنہ علاج ہے C3G میں افادیت۔

خلاصہ طور پر، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ، سطح کی شناخت کے ڈومینز کی کمی کے باوجود، FH1-5 فیوژن پروٹین گلومیرولر C3 ایکٹیویشن کو کم کرنے اور FH کی کمی میں پلازما کے تکمیلی ضابطے کو بحال کرنے میں موثر تھے۔ FH1-5 ڈومینز کو اینٹی پروپرڈین سے جوڑنے کا کوئی واضح فائدہ نہیں تھا، اور IgG-FH1-5 پروٹین نے تجرباتی ورم گردہ میں گردوں کی چوٹ کو کم کیا۔ علاج کے استعمال کے لیے FH کی بڑے پیمانے پر تیاریوں کو تیار کرنے کے چیلنجوں کے برعکس، اینٹی باڈی پر مبنی علاج کی بڑے پیمانے پر پیداوار اچھی طرح سے قائم ہے، جو IgG-FH1-5 کو C3G کے لیے ایک پرکشش ممکنہ علاج بناتی ہے۔

طریقے

فیوژن پروٹین

IgG-FH1-5۔ پہلے 5 ماؤس FH SCR ڈومینز (mFH1-5) منسلک

ایک غیر ہدفی IgG1 ماؤس Ig تک (ایک اینٹی idiotypic اینٹی باڈی ایک ماؤس مونوکلونل اینٹی باڈی کے خلاف اٹھائی گئی ہے)۔

اینٹی P-FH1-5۔ مورائن ایف ایچ1-5 ماؤس اینٹی پرپرڈین اینٹی باڈی (اینٹی پی) سے منسلک ہے، 30 ڈبلیو سونگ، یونیورسٹی آف پنسلوانیا کے ذریعہ الیکسین کو فراہم کیا گیا ہے۔

کنٹرول کرتا ہے۔ کنٹرولز آئسو ٹائپ سے مماثل نان ٹارگٹنگ ماؤس آئی جی (آئی جی جی کنٹرول) اور ماؤس اینٹی پرپرڈین (اینٹی پی) (ضمنی اعداد و شمار S1) تھے۔ پروٹین PVEK ویکٹرز اور Expi293 سیلز (تھرمو فشر سائنٹیفک، والتھم، MA) کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیے گئے تھے، جو پروٹین A (MabSelect SuRe، Cytiva، Marlborough، MA) کا استعمال کرتے ہوئے صاف کیے گئے تھے۔

اے پی مخصوص ہیمولٹک پرکھ

60 nM سے 0.5 nM تک کے بیس فیصد نارمل ماؤس سیرم کو 30 منٹ کے لیے 37 C پر خرگوش اریتھروسائٹس (15 106 سیل/ml) کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ ہیم کی رہائی کی مقدار سپیکٹرو فوٹومیٹرک (نظری کثافت 415 این ایم) کی گئی تھی۔ 100 فیصد لیسس سیرم تھا جس میں کوئی روک نہیں تھا۔

پلازما ایف بی اور ایف ایچ

پلازما خون کے سینٹرفیوگریشن کے بعد حاصل کیا گیا تھا جو ethylenediamine tetraacetic ایسڈ (Sarstedt، Nordrhein- Westfalen، Germany) پر مشتمل ٹیوبوں میں جمع کیا گیا تھا۔ پروٹین کیپلیری الیکٹروفورسس امیونوسے (WES، ProteinSimple، San Jose، CA) کے ذریعہ ماپا گیا۔ استعمال شدہ اینٹی باڈیز پولی کلونل اینٹی ماؤس ایف ایچ اینٹی باڈی (الیکسین فارماسیوٹیکلز، بوسٹن، ایم اے) اور اینٹی ماؤس ایف بی اینٹی باڈی (ابکم، کیمبرج، یو کے)؛ WES اینٹی خرگوش کا پتہ لگانے والا ماڈیول (پروٹین سمپل، سان جوس، CA) استعمال کیا گیا تھا۔ کیمیلومینیسینٹ سگنلز کا تجزیہ کمپاس فار ایس ڈبلیو سافٹ ویئر (پروٹین سمپل، ورژن 5۔{6}}.1) کے ساتھ کیا گیا، چوٹی والے علاقوں کے طور پر مقدار میں طے کیا گیا، اور پرکھ کے کنٹرول میں معمول بنایا گیا۔

چوہوں

تمام چوہوں کو مخصوص روگزن سے پاک حالات میں رکھا گیا تھا۔ طریقہ کار ادارہ جاتی رہنما خطوط کے مطابق انجام دیا گیا تھا اور یونائیٹڈ کنگڈم ہوم آفس سے منظور شدہ تھا۔ C57BL/6 جنگلی قسم کے چوہے جیکسن لیبارٹری (بار ہاربر، ME) سے خریدے گئے، اور Cfh–/– چوہوں کو پیدا کیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے۔ 7 چوہوں کو عمر اور جنس کے لیے ملایا گیا تھا۔ پروٹین کی مساوی خوراکیں آئی پی انجیکشن کے ذریعے دی گئیں (اینٹی پروپرڈین اور آئی جی جی کنٹرول کے لیے 1 ملی گرام؛ آئی جی جی-ایف ایچ1-5 اور اینٹی پی-ایف ایچ1-5 کے لیے 1.4 ملی گرام)۔ ایکسلریٹڈ سیرم نیفروٹوکسک ورم ​​گردہ کو بھیڑوں کے نیفروٹوکسک سیرم کے iv انجیکشن سے چوہوں میں بھیڑ IgG کے ساتھ پہلے سے حفاظتی ٹیکوں سے متاثر کیا گیا تھا۔

C3، C5، اور فری پروپرڈین پلازما C3 کو انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ کے ذریعے ماپا گیا تھا۔ 14 پلازما "مفت" پرپرڈین اور C5 کی سطحوں کو الیکٹرو کیمیلومینیسینس امیونوساز (میسو اسکیل ڈسکوری [MSD]، میسو اسکیل ڈائیگنوسٹکس، MD Rockville کے ساتھ ماپا گیا۔ - ہائی بائنڈنگ MSD پلیٹوں پر پروپرڈین یا حسب ضرورت اینٹی مورین C5 لیپت۔ پابند "فری" پروپرڈین اور سی 5 کا پتہ اینٹی پرپرڈین (ڈبلیو سونگ سے) یا بایوٹینیلیٹڈ مونوکلونل اینٹی سی5 (ایلیکسین) کے ساتھ مل کر اسٹریپٹاویڈن-سلفو (ایم ایس ڈی، میسو اسکیل ڈائیگنوسٹک) کے ساتھ کیا گیا۔ کیمیلومینسنٹ سگنل سیکٹر ایس 6000 امیجر (ایم ایس ڈی، میسو اسکیل ڈائیگناسٹک) کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کیا گیا تھا اور اس کا تجزیہ ایم ایس ڈی ڈسکوری ورک بینچ سافٹ ویئر (میسو اسکیل) سے کیا گیا تھا۔

تشخیص، ورژن 4۔{1}}.12.1)۔ ریکومبیننٹ مورین پرپرڈین اور سی 5 کو معیار کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔

رینل فنکشن اور ہسٹولوجی

ہیماتوریا اور پروٹینوریا کا اندازہ ہیما کامبیسٹکس (بائر، ریڈنگ، یوکے) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ پلازما یوریا کی پیمائش کی گئی اور گردے کے ٹشو پر کارروائی کی گئی جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے۔ 9 پیشاب کی کریٹینائن کا تعین کریٹینائن کمپینیئن پروٹوکول پرکھ (#1012؛ ایکسل، فلاڈیلفیا، PA)، اور سپاٹ پیشاب کے نمونوں پر کیا گیا تھا۔ پلازما البومین کی پیمائش انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ (#E99-134؛ بیتھائل لیبارٹریز، مونٹگمری، TX) کے ذریعے کی گئی۔ متواتر تیزاب – شِف داغ والے گردوں کے حصوں کا اندازہ اندھے انداز میں کیا گیا تھا اور ان کی درجہ بندی گلوومیرولر اور ٹیوبلو انٹرسٹیشل انجری کی شدت کے مطابق کی گئی تھی (0 [کوئی نہیں]، 1 [ہلکے]، 2 [اعتدال پسند])۔ اوسط گلوومیرولر سیل نمبر کا تعین کرنے کے لئے فی سیکشن دس گلومیرولی کا اندازہ کیا گیا۔ DAPI (ویکٹر لیبارٹریز، برلنگیم، CA) کے ساتھ ویکٹشیلڈ میڈیم کا استعمال کرتے ہوئے نصب 5-mm کرائی سیکشنز پر امیونو فلوروسینس سٹیننگ کی گئی تھی۔ استعمال شدہ اینٹی باڈیز فلوروسین آئسوتھیوسائنیٹ (FITC) - کنجوگیٹڈ پولی کلونل گوٹ اینٹی ماؤس C3b/C3c/ iC3b (1:200؛ #55500؛ MP بائیو میڈیکل، سانتا اینا، CA)9؛ فگ چین-اسپیشل سیفک ایف آئی ٹی سی کنجوگیٹڈ پولی کلونل گوٹ اینٹی ماؤس آئی جی جی (1:400؛ #F5387؛ سگما-الڈرچ، سینٹ لوئس، ایم او)؛ FITC کنجوگیٹڈ مونوکلونل ماؤس اینٹی بکری/بھیڑ آئی جی جی (1:100؛ #F5137؛ سگما-الڈرچ)؛ یا FITC کنجوگیٹڈ بکری اینٹی ہیومن پروپرڈین (1:50؛ #GAHu/PPD/FITC، نورڈک امیون لاجک لیبارٹریز، کوپن ہیگن، ڈنمارک)۔ , Minneapolis, MN) بایوٹین بلاک شدہ حصوں (بائیوٹن بلاکنگ سسٹم؛ Agilent Dako، Santa Clara, CA) پر استعمال کیا گیا تھا، اسٹریپٹاویڈن AF488 سیکنڈری اینٹی باڈی کے ساتھ (1:200؛ #S-32354؛ تھرمو فشر سائنٹیفک)۔ FH کو پیوریفائیڈ چوہا اینٹی ماؤس CD16/CD32-مسدود سیکشنز (1:100؛ BD بایوسینسز، فرینکلن لیکس، NJ) میں بکری مخالف انسان FH (1:1000؛ #A312؛ Quidel، San Diego) کا استعمال کرتے ہوئے تصور کیا گیا تھا۔ , CA) اور مونوکلونل اینٹی گوٹ IgG-FITC سیکنڈری اینٹی باڈی (1:100; کلون GT-34; F4891; سگما-الڈرچ)۔ گلومیرولر میکروفیجز کی شناخت FITC-conjugated rat anti-mouse CD68 (FA-11 کلون GTX43518؛ GeneTex, Irvine, CA) کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی تھی۔ Leica DFC700T ڈیجیٹل کیمرے (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) اور Image-Pro Plus سافٹ ویئر (Media Cybernetics, Rockville, MD, version 7) کے ساتھ مل کر Leica DM4B آپٹیکل مائکروسکوپ کا استعمال کرتے ہوئے مقداری امیونو فلوروسینس تجزیہ کیا گیا۔ فی سیکشن دس گلوومیرولی کی جانچ کی گئی، اور صوابدیدی فلورسائنس یونٹس میں اوسط شدت کا اظہار کیا گیا۔

شماریاتی تجزیہ

گراف پیڈ پرزم، ورژن 8۔{1}} (GraphPad, San Diego, CA) شماریاتی تجزیہ کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ بونفرونی متعدد موازنہ ٹیسٹ (عوامل وقت اور علاج تھے) کے ساتھ تغیر کا بار بار اقدامات 2-طریقہ تجزیہ ٹائم کورس کے تجزیہ کے لیے استعمال کیا گیا۔ ایک سے زیادہ گروپوں کا موازنہ کرتے وقت کرسکل والس ڈن کے ساتھ متعدد موازنہ ٹیسٹ استعمال کیا گیا تھا، اور مان-وٹنی ٹیسٹنگ 2 گروپوں کے لیے استعمال کی گئی تھی۔

انکشاف

MCP نے Alexion، ChemoCentryx، Novartis، Gyroscope، اور Achillion Pharmaceuticals سے کنسلٹنسی فیس وصول کی ہے۔ HTC نے Alexion، Novartis، Aurinia، اور Achillion Pharmaceuticals سے مشاورتی فیس وصول کی ہے۔ YZ, YW, KKJ، اور SK-K Alexion فارماسیوٹیکلز کے ملازم ہیں۔ SK Alexion Pharmaceuticals کا سابق ملازم ہے اور فی الحال Gemini Pharmaceuticals میں ملازم ہے۔ دیگر تمام مصنفین نے مسابقتی دلچسپیوں کا اعلان نہیں کیا۔

اعترافات

MCP کلینکل سائنس میں ویلکم ٹرسٹ سینئر فیلو ہے (گرانٹ ریفرنس 212252/Z/18/Z)، اور ACG اور DPL کو اس فیلوشپ سے تعاون حاصل ہے۔ YZ, SK, YW, KKJ، اور SK-K کو Alexion Pharmaceuticals نے مالی اعانت فراہم کی۔

سپلیمنٹری میٹریل

ضمنی فائل (PDF)

شکل S1۔ Fusionproteinsusedinthisstudy.IgG-FH1-5 ماؤس فیکٹر H (FH1-5) کے پہلے 5 ڈومینز پر مشتمل ہے جو ایک غیر ہدف نہ بنانے والے ماؤس Ig سے منسلک ہیں۔ اینٹی پی-ایف ایچ1-5 ایم ایف ایچ1-5 پر مشتمل ہوتا ہے جو ایک نیوٹرلائزنگ ماؤس اینٹی ماؤس پروپرڈین اینٹی باڈی سے منسلک ہوتا ہے (اینٹی پی؛ دیکھیں Miwa et al.30)۔ کنٹرول پروٹینز میں ایک آئسو ٹائپ سے مماثل نان ٹارگٹنگ ماؤس Ig (IgG-control) اور نیوٹرلائزنگ ماؤس اینٹی ماؤس پروپرڈین اینٹی باڈی (Anti-P) شامل ہے۔ شکل S2۔ (A) IgG-FH1-5 یا (B) اینٹی P-FH1-5 کے ساتھ انجکشن لگائے گئے FH- کمی والے چوہوں سے پلازما کے نمونوں میں FH1-5 کا پتہ لگانے کے لیے WES بلاٹ تجزیہ۔ 94-kDaIgheavychainlinkedtomouseFH1-5 (HC-FH1-5)IgG-FH1-5 کے انجیکشن کے 11 دن بعد اور انجیکشنوفانٹی- P-FH1-5 سرخ باکس کے پروٹین (انجیکشن کے 4 دن بعد تک) قابل شناخت ہے۔ .کنٹرول میں جنگلی قسم کے چوہوں سے پلازما شامل ہیں جہاں مکمل طوالت کے عنصر H پروٹین کا پتہ چلا ہے (FH، بلیک باکسز، لین C1) اور غیر انجکشن والے FH کی کمی والے چوہے، جہاں کوئی FH واضح نہیں ہے (بلیک باکس، لین سی2،)۔ جیسا کہ توقع کی جاتی ہے، اینٹی پی یا آئی جی جی کنٹرول والے چوہوں کے پلازما نمونوں میں نہ تو FHnorFH1-5 کا پتہ لگایا جا سکتا ہے۔

شکل S3۔ جنگلی قسم کے چوہوں میں IgG-کنٹرول یا اینٹی P-FH1-5 کے انجیکشن کے 96 گھنٹے بعد گلومیرولر کمپلیمنٹ امیونوسٹیننگ۔ نمائندہ گلوومیرولر امیجز دکھائے گئے ہیں (بار ¼ 100 ملی میٹر)۔

شکل S4۔ FH کی کمی والے چوہوں کے گلومیرولی میں اینٹی P-FH1-5 کے جمع کرنے پر پرپرڈین کا کردار۔ Cfh–/– چوہوں کو یا تو IgG- کنٹرول یا اینٹی P (علاج 1) کے ساتھ انجکشن لگایا گیا تھا جس کے بعد 24-گھنٹے بعد IgG- کنٹرول یا اینٹی P-FH1-5 (علاج 2)۔ جانوروں کو علاج کے 120 گھنٹے بعد مارا گیا اور IgG، پروپرڈین، اور FH/FHR کے لیے گلوومرولر سٹیننگ کا اندازہ لگایا گیا۔ نمائندہ تصاویر دکھائی گئی ہیں۔ اینٹی پی انجیکشن نے واضح طور پر پرپرڈین (قطار 1، کالم 2) کو کم کیا لیکن FH/FHR (بغیر تبدیل نہیں ہوا) یا IgG (غیر موجود رہتا ہے) داغ نہیں لگا۔ اینٹی پی-ایف ایچ1-5 24-گھنٹوں کے بعد آئی جی جی کنٹرول کرنے کے نتیجے میں اینٹی آئی جی جی، اینٹی ایف ایچ/ایف ایچ آر، اور اینٹی پی اینٹی باڈیز کے ساتھ دانے دار داغ نمودار ہوئے جیسا کہ اینٹی پی-ایف ایچ کے انجیکشن کے بعد دیکھا گیا ہے۔ اکیلے 1-5 (شکل 3b دیکھیں)۔ یہ دانے دار داغ اس وقت کم ہو گیا تھا جب اینٹی P-FH1-5 انجیکشن سے پہلے اینٹی P انجیکشن لگایا گیا تھا، جو گردش کرنے والے (شکل 1h دیکھیں) اور گلومیرولر (شکل 3b دیکھیں) دونوں کو ختم کر دیتا ہے۔ اینٹی آئی جی جی کے ساتھ گلومیرولر داغ صرف ان چوہوں میں واضح تھا جو اینٹی P-FH 1-5 (قطار 3، کالم 3 اور 4) کے ساتھ لگائے گئے تھے اور ان چوہوں میں نمایاں طور پر کم تھے جنہوں نے اینٹی P-FH حاصل کیا تھا1-5 اس سے پہلے اینٹی پی۔ ہم نے یہ نتیجہ اخذ کیا کہ Cfh–/– چوہوں کے گلومیرولی میں اینٹی P-FH1-5 کا جمع ہونا جزوی طور پر پرپرڈین پر منحصر تھا۔ افقی سلاخیں درمیانی قدروں کو ظاہر کرتی ہیں، اور سرگوشیاں انٹرکوارٹائل رینج کو ظاہر کرتی ہیں۔ P-value Mann-Whitney ٹیسٹ سے اخذ کیا گیا تھا۔ بار ¼ 100 ملی میٹر۔

حوالہ جات

1.FakhouriF، Frémeaux-Bacchi V، Noöl LH، et al C glomerulopathy∶ نئے سرے سے ڈیسیفیکیشن۔ Nat Rev Nephrol.20106:494-499۔

2 SmithRH.AppeG8.BlomAMet aLC3gkomeripathy — نایاب تکمیل پر مبنی حقیقی بیماری کو سمجھنا۔ نیٹ ری نیفرول۔{4}}

3. Pickering MC, Cook HT. تکمیلی عنصر H پر ٹرانسلیشنل منی ریویو سیریز: انسانوں اور حیوانوں کی طرف سے تکمیلی عنصر H کے ساتھ منسلک گردوں کی بیماریاں۔ Cin Exp Immunol.2008;151:210-230۔

4. Daha MR Fearon DT Austen KF، C3nechritic عنصر （C3NeF）∶ سیال کے مرحلے اور سیل سے منسلک متبادل راستہ کنورٹیز کا استحکام۔ J Immunol 1976;116:1-7۔

5. Mollnes TE, Ng YC, Peters DK, C3 پر اور Vivo اور in Vitro میں تکمیل کے ٹرمینل پاتھ وے پر نیفراٹک فیکٹر کا et al اثر۔ Oin Exp Immunol. 1986؛65:73-79۔

6. Nq YC، پیٹرز DK۔ G3 نیفریٹک فیکٹر (C3NeF): متبادل راستے C3 کنورٹیز کے سیل سے منسلک اور سیال مرحلے کے استحکام کا انحطاط۔ Cn Exp Imunol.19865:450-457۔

7. Pickering MC, Cook HT, Warren J, et al غیر کنٹرول شدہ C3 ایکٹیویشن چوہوں میں membranoproliferative glomerulonephritis کا سبب بنتا ہے جس میں تکمیلی عنصر H. Nat Genert.2002:31؛424-428 کی کمی ہے۔

8. Lesher AM, Zhou L, Kimura Y, et al. فیکٹر H اتپریورتن اور پرپرڈین کی کمی کا امتزاج شدید C3 گلوومیرولونفرائٹس کا سبب بنتا ہے۔ جے ایم سوک نیفرول۔ 2013؛ 24:53–65۔

9. Ruseva MM، Veron KA، Lesher AM، et al. پروپرڈین کا نقصان فیکٹر H کی کمی کے نتیجے میں C3 گلوومیرولوپیتھی کو بڑھاتا ہے۔ جے ایم سوک نیفرول۔ 2013؛24:43-52۔

10. Paixao-Cavalcante D, Hanson S, Botto M, et al. فیکٹر H سیال مرحلے میں C3 ایکٹیویشن کو کنٹرول کر کے GBM پابند iC3b کی کلیئرنس میں سہولت فراہم کرتا ہے۔ Mol Immunol.2009;46:1942-1950۔

11 فاخوری ایف، ڈی جارج ای جی۔ Brune F, et al انسانی تکمیلی عنصر H کے ساتھ علاج تیزی سے فیکٹر H کی کمی والے چوہوں میں گردوں کے تکمیلی جمع کو ریورس کرتا ہے۔ کڈنی انٹ 2010:78:279-286۔

12. مائیکلفیلڈر ایس، پارسنز جے، بوہلینڈر ایل ایل، ایٹ ال ماس سے تیار کردہ، گلائکوسیلیشن سے بہتر انسانی عنصر H تکمیلی عوارض میں علاج معالجے کے لیے۔ JAm Soc Nephrol.201728:1462-1474۔

13. Nichols EM، Barbour TD، Pappworth Y، et al ایک توسیع شدہ منی تکمیلی عنصر H مالیکیول تجرباتی C3 گلوومیرولوپیتھی کو بہتر بناتا ہے۔ کڈنی انٹ۔ 201588:1314-1322۔

14. Ruseva MM، Peng T، Laser MA، et al تجرباتی C3 گلوومیرولوپیتھی میں ہدف شدہ تکمیلی روک تھام کی افادیت۔ جے ایم سوک نیفرول۔ 2016؛27:405-416۔

15. یانگ وائی، ڈینٹن ایچ، ڈیوس یا، ایٹ ال C3 گلوومیرولوپیتھی کے علاج کے لیے ایک انجنیئرڈ کمپلیمنٹ فیکٹر ایچ کی تعمیر۔ جے ایم سوک نیفرول۔ 2018؛ 29:1649-1661۔

16. Schulze M, Pruchno CJ, Burns M, et all Glomerular C3clocalization تجرباتی glomerulonephritis میں جاری مدافعتی ڈپازٹ کی تشکیل اور تکمیلی ایکٹیویشن کی نشاندہی کرتا ہے۔ ایم جے پاتھول۔ 1993:142179-187۔

17. Athanasiou Y، Voskarides K Gale DP، et al Familial C3 glomerulopathy CFHRS اتپریورتنوں کے ساتھ منسلک طبی خصوصیات 91 مریضوں کی 16 نسبوں میں۔ CTn JAm Soc Nephrol.20116:1436-1446۔

18. Kaneko Y، Nimmer动hn F، Madaio MP، et al پیتھالوجی اور نیفروٹوکسک ورم ​​گردہ میں تحفظ کا تعین مخصوص Fc ریسیپٹرز کی منتخب مصروفیت سے ہوتا ہے۔ J Exp Med.2006;203:789-797۔

19. Sheerin NS, Springall T, Carroll MC, et al. اینٹی گلومیرولر بیسمنٹ میمبرین کے خلاف تحفظ (C3-اور C4-کی کمی والے چوہوں میں GBM-ثالثی ورم گردہ۔ C Exp Immunol. 1997;110:403-409۔

20. Cheng ZZ Hellwae J، Seeberger H et al. ماؤس اور انسانی تکمیلی عنصر H.Mol Immunol.2006;43 کی سطح کی شناخت اور C3b بائنڈنگ خصوصیات کا موازنہ۔{4}}۔

21dp roe EG. Macor P.Paixao-Caakante D. et al عام ہیمولیٹک uremic سنڈروم کی نشوونما کا انحصار C5.J Am Soc Nephrol.2011؛22:137-145 کی تکمیل پر ہے۔

22.Pdkering MC, de Jorge EG.Martinez-Barricarte Ry et al Spontaneous hemolytic uremic syndrome جو کہ تکمیلی عنصر H کی وجہ سے شروع ہوا جس میں سطح کی شناخت کے ڈومینز کی کمی ہے۔ J Exp Med.2007;204:1249-1256۔

23 ہربرٹ اے پی۔ مائیک ای، چن زیٹ اے ایل کیپچرڈ فیکٹر ایچ کے اضافے کے ذریعے ثالثی کی تکمیلی چوری: تکمیلی سے خود کی سطحوں کے تحفظ کے لیے مضمرات۔ جے امیونول۔ 2015؛195:4986-4998۔

24. Goicoechea de Jorge E Caesar JJ, Malik TH, et al dimerization of complement factor H سے متعلق پروٹینز کے ساتھ تکمیلی ایکٹیویشن کو ماڈیول کرتا ہے۔ Proc Natl Acad Sci US A.2013;110:4685-4690۔

25. شمٹ CQ، Bai H Lin Z، et al. منفرد ٹرپل ٹارگٹنگ خصوصیات کے ساتھ کم سے کم مدافعتی روکنے والے کی عقلی انجینئرنگ۔ جے امیونول۔ 2013؛190:5712-5721۔

26. ولسن HR، Medjera-Thomas NR، Gilmore AC، et al. گلومیرولر میمبرین اٹیک کمپلیکس لیوپس ورم گردہ میں جاری C5 ایکٹیویشن کا قابل اعتماد مارکر نہیں ہے۔ کڈنی انٹ۔ 2019۔{4}}۔

27. Antonioli AH White J، Crawford F، et all جے امیونول۔ 2018؛ 200:316-326۔

28. Cserhalmi M, CsincsiALMezei Z, et al. مورائن فیکٹر H سے متعلقہ پروٹین FHR-B تکمیلی ایکٹیویشن کو فروغ دیتا ہے۔ فرنٹ امیونول۔20178:1145۔

29. Medjeral-Thomas NR, Moffett H, Lomax-Browne HJ et al Glomerular complement factor H-related protein 5 (FHR5) C3 glomerulopathy میں بہت زیادہ پایا جاتا ہے اور renalimpairmentKdney Int Ren سے وابستہ ہے۔ 2019;4:1387-1400۔

30. Miwa T, Sato S, Gullipalli D, et al. بلاکنگ پروپرڈین، متبادل راستہ، اور anaphylatoxin ریسیپٹرز زوال کو تیز کرنے والے عنصر اور CD59 ڈبل ناک آؤٹ چوہوں میں رینل اسکیمیا ریپرفیوژن انجری کو کم کرتے ہیں۔ جے امیونول۔ 2013؛190:3552-3559۔

31. Corillo F, Bravo Garcia-Morato M, Nozal P, et al Serum properdin consumption as a biomarker of C5 convertase dysregulation in C3 glomerulopathy. Clin Exp Immunol.2016;184:118-125.8. Lesher AM, Zhou L Kimura Y, et al. فیکٹر H اتپریورتن اور پرپرڈین کی کمی کا امتزاج شدید C3 glomerulonephritis.JAm Soc Nephrol.2013؛2453-65 کا سبب بنتا ہے۔

32. zhang Y، Nester OM Martin B.et al C3 گلوومیرولوپیتھی کے تکمیلی بائیو مارکر پروفائل کی وضاحت کرنا۔ Clin J Am Soc Nephvol.20149:186-1882۔