نیم کے درخت سے ماخوذ اینٹی میلانوجینک گیڈونن کے مالیکیولر میکانزم
Mar 28, 2022
رابطہ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ای میل:audrey.hu@wecistanche.com
Hwang-Ju Jeon 1، Kyeongnam Kim 1، Chaeeun Kim 2، Myoung-Jin Kim 1، Tae-Oh Kim 3,4,5,† and Sung-Eun Lee 1,2,*,†
خلاصہ:میلانوجینیسیس عمل کی ایک سیریز کی نمائندگی کرتا ہے جو میلانین پیدا کرتا ہے، ایک حفاظتی جلد کا رنگ (بالائے بنفشی شعاعوں کے خلاف)، اور انسانی جلد کے رنگ کا تعین کرتا ہے۔ میلانین کی پیداوار کو کم کرنے والے کیمیکلز کی جلد کی دیکھ بھال کی دلچسپیوں کی وجہ سے کاسمیٹک مارکیٹ میں ہمیشہ سے مانگ رہی ہے، جیسے کہ سفید کرنا۔ میلانین کی پیداوار کو روکنے کا بنیادی طریقہ کار tyrosinase (TYR) کی روک تھام ہے، جو melanogenesis کے لیے ایک اہم انزائم ہے۔ یہاں، ہم نے اس کی اینٹی میلانوجینیسیس کارروائی کے لیے حقیقی (Ged)، ایک نمائندہ لیمونائڈ کا جائزہ لیا۔ وٹرو میں میلانین کی پیداوار B16F10 ماؤس میلانوما خلیوں میں الفا-میلانوسائٹ-حوصلہ افزائی ہارمون (-MSH) کے ذریعہ حوصلہ افزائی کی گئی تھی۔ Ged میں کمی - MSH-حوصلہ افزائی میلانین کی پیداوار، TYR سرگرمی اور پروٹین کی مقدار کو روکتا ہے۔ ہم نے اس نتیجے کی تصدیق melanogenesis کے Vivo ina زیبرا فش ماڈل میں کی۔ تمام علاج شدہ ارتکاز میں نشوونما کے دوران زیبرا فشمبریوس کے زہریلے پن اور خرابی کا کوئی نشان نہیں تھا۔ Ged نے زیبرا فش ایمبریو پگمنٹ ڈاٹس اور ایمبریو کے میلانین مواد کی تعداد کو کم کیا۔ جیڈ (100 µM) کی انتہائی فعال حراستی مثبت کنٹرول، کوجک ایسڈ (8 ایم ایم) سے بہت کم تھی۔ لہذا ، Ged اینٹی میلانوجینیسیس ری ایجنٹس کے لئے دلکش امیدوار ہوسکتا ہے۔
مطلوبہ الفاظ: MITF; microphthalmia سے منسلک ٹرانسکرپشن عنصر؛ TYR ٹائروسینیز؛ DQ; dopaquinone;TRP-1; ٹائروسینیز سے متعلق پروٹین 1؛ TRP-2; ٹائروسینیز سے متعلق پروٹین 2؛ MC1R; melanocortin 1 رسیپٹر؛ -ایم ایس ایچ؛ میلانوسائٹ محرک ہارمون؛ ACTH; adrenocorticotropic ہارمون؛ اے ایس پی Agoutisignaling پروٹین؛ کیمپ سائکلک اڈینوسین مونو فاسفیٹ؛ CREB؛ cAMP جوابی عنصر
1. تعارف
میلانن میلانوسوم میں ترکیب کیا جاتا ہے، melanocyte کے lysosome جیسے organelles. melanosome میں، melanin دو روغن، eumelanin، اور pheomelanin میں پیدا ہوتا ہے، جو بالترتیب بھورے سیاہ اور سرخ پیلے رنگ کی نمائندگی کرتا ہے [1]۔ ان میلانین پگمنٹس کی ترکیب L-tyrosine کے پیشرو، L-tyrosine سے شروع ہوتی ہے جس میں L-tyrosine کے آکسیکرن ردعمل کے ساتھ dopaquinone (DQ) اور L-DOPA [2] نامی مرکب میں شامل ہوتا ہے۔ آکسیکرن کے اس مرحلے میں، ٹائروسینیز (TYR) مجموعی میلانین بائیو سنتھیسس پاتھ وے [2,3] کی شرح کو محدود کرنے والے انزائم کے طور پر کام کرتا ہے۔ TRP-1اور TRP-2، میلانوجینیسیس پروٹین سے قریبی تعلق رکھتے ہیں، eumelanin biosynthesis پاتھ وے کو متحرک کرتے ہیں اور TYR سرگرمی کو مستحکم اور حوصلہ افزائی کرتے ہیں [1]۔ melaninpigments (جسے melanogenesis کہا جاتا ہے) پیدا کرنے کا عمل melanocytes کے melanosome میں ہوتا ہے، ایک سائٹ formelanin کی ترکیب اور ذخیرہ [4]۔ melanogenesis سگنلنگ پاتھ وے میں، melanocortin1 ریسیپٹر (MC1R) G-پروٹین کے ساتھ مل کر رسیپٹرز کا رکن ہے۔ MCIR میلانوجینیسیس سگنلنگ کے لیے ایک نقطہ آغاز ہے اور اسے MC1R agonists جیسے -melanocyte-stimulatinghormone (-MSH)، adrenocorticotropic hormone (ACTH)، اور agouti سگنلنگ پروٹین (ASP) [1,2] کے ذریعے چالو کیا جاتا ہے۔ -MSH-MC1R سگنلنگ پاتھ وے کو چالو کرنے سے سائکلک اڈینوسین مونو فاسفیٹ (cAMP) کے ارتکاز میں اضافہ ہوتا ہے اور CAMP رسپانس عنصر (CREB) کو فاسفوریلیٹ کرتا ہے۔ فاسفوریلیٹڈ CREB مائکروفتھلمیا سے وابستہ ٹرانسکرپشن فیکٹر (MITF) کی پروٹین کی سطح کو آمادہ کرتا ہے، میلانین ترکیب سے متعلقہ جینز، TYR، ٹائروسینیز سے متعلقہ پروٹین-1 (TRP-1)، اور ٹائروسینیز سے متعلق پروٹین کو منظم کرنے والا ٹرانسکرپشن عنصر -2 (TRP-2) ان جینز [1,5,6] کے ایم باکس کو باندھ کر۔ پانچ melanocortin ریسیپٹرز میں، MC1R میں سب سے زیادہ پرچر میلانوسائٹس ہے۔ یہ بنیادی طور پر MC1R کو چالو کرکے eumelanin (سیاہ بھورے رنگ روغن) کی پیداوار کو کنٹرول کرتا ہے جب اس ریسیپٹر کے agonists، جیسے a-MSH اور ACTH، کو اس ریسیپٹر [2,4,7] میں تبدیل کیا جاتا ہے۔
اگرچہ ممالیہ اور مچھلیوں میں فرق ہے، زیبرا فش کے پاس MC5R اور MC3R کی ایکسٹرا کاپی ہوتی ہے، جو پفر فش کے پاس نہیں ہوتی ہے [7]، اور یہ سگنلنگ پاتھ اب بھی زیبرا فش میں موجود ہے اور بالکل ویسا ہی کام کرتا ہے جیسا کہ یہ ممالیہ میلانوسائٹس [7] میں کرتا ہے۔ میلانین پگمنٹ کی تشکیل کی روک تھام پر مطالعات کی تعداد میں اس کے تحقیقی فوائد کی وجہ سے اضافہ ہوا ہے، جیسے کہ ابتدائی مرحلے کے جنین میں تیزی سے نشوونما اور مشاہدے میں آسانی [8-11]۔ ان مظاہر میں، بہت سے پچھلے مطالعات سے پتا چلا ہے کہ اس سگنلنگ پاتھ وے کی روک تھام میلانین کی پیداوار کو کم کرتی ہے اور بیسابولول-اینجلون، 4-ہائیڈروکسی-3-میتھوکسی سنمالڈہائڈ، اور ڈیفینائل-میتھیلین-ہائیڈرازین کاربو تھامین سمیت متعدد روک تھام کرتی ہے۔ -14]۔
Gedunin (Ged)، ایک معروف ہیٹ شاک پروٹین 90 روکنے والا، ایک لیمونائڈ ہے، جو Meliaceae پلانٹ کی نسل میں پایا جاتا ہے۔ یہ لیمونائڈ بنیادی طور پر نوجوان ہندوستانی نیم کے درخت (Azadirachta indica) کے پھلوں کے ایپی کارپ میں وافر مقدار میں پایا جاتا ہے اور اس میں متنوع حیاتیاتی سرگرمیاں ہوتی ہیں، جن میں اینٹی کینسر، اینٹی ملیریل، اینٹی سوزش، اینٹی ذیابیطس، الرجک، کیڑے مار دوا، جڑی بوٹیوں سے دوچار اور اینٹی فنگل شامل ہیں [15]۔ Ged کے اینٹی میلانوجینیک اثر کے طریقہ کار کے بارے میں کوئی رپورٹ نہیں ہے۔
میلانین سے متعلقہ بیماریوں اور جلد کی رنگت کی تبدیلیوں کے علاج کے لیے ایک دواؤں کی دوا یا کاسمیٹک ایجنٹ کے امیدوار کے طور پر، Ged کو اس کے محفوظ، قدرتی طور پر پائے جانے والے پودوں کی خصوصیات کی وجہ سے فوائد حاصل ہو سکتے ہیں [19]۔ تجارتی کاسمیٹک مارکیٹ کے سب سے بڑے حصوں میں سے ایک، مناسب سفیدی کرنے والے ایجنٹ امیدوار کو تلاش کرنے کے لیے بالترتیب B16F10 ماؤس میلانوما سیلز اور زیبرا فش ایمبریو کا استعمال کرتے ہوئے وٹرو اینڈین ویوو میں گیڈ کے اینٹی میلانوجینک اثر کا جائزہ لیا گیا۔ یہ ظاہر کرنے کے لیے ٹیسٹ بھی کیا گیا کہ جیڈ ممکنہ طور پر جانوروں کو کیسے متاثر کرتا ہے۔
2. مواد اور طریقے
2.1 کیمیکل اور ری ایجنٹس
Ged کو Microsource Discovery Systems, Inc. (Gayloardville, CT, USA) سے خریدا گیا تھا۔ میلانوجینیسیس محرک، -MSH، اینٹی میلانوجینک کمپاؤنڈ، اور کوجک ایسڈ سگما-الڈرچ (سینٹ لوئس، MO، USA) سے خریدے گئے تھے۔ دیگر تمام ریجنٹس مالیکیولر بائیولوجی گریڈ سے زیادہ تھے۔
2.2 سیل کلچر
ماؤس میلانوما-کارسنوما سیل لائن، B16F10، امریکن ٹائپ کلچر کلیکشن (ATCC، Manassas, VA, USA) سے حاصل کی گئی تھی اور 10 فیصد فیٹل بوائن سیرم (v/v) کے ساتھ کلچر کی گئی تھی اور پینسلن نے ڈلبیکو میں ترمیم شدہ ایگلز میڈیا (GE) فراہم کیا تھا۔ صحت کی دیکھ بھال، شکاگو، IL، USA) 5 فیصد CO2 کے ساتھ مرطوب ماحول میں۔ خلیات کو اس وقت تک مہذب کیا گیا جب تک کہ سنگم 80 فیصد تک نہ پہنچ جائے اور 1:8 کے تقسیم تناسب کے ساتھ ہفتے میں تین بار تقسیم ہو جائیں۔ خلیوں کا ہر 12 گھنٹے میں مشاہدہ کیا جاتا تھا، اور مورفولوجیکل تبدیلیوں کی جانچ کی جاتی تھی۔ استعمال شدہ خلیوں کی گزرنے کی تعداد چھوٹی رکھی گئی تھی۔
2.3۔ سیل وائبلٹی پرکھ
B16F10 ماؤس میلانوما سیل لائن پر Ged کے پھیلاؤ کے اثر کا اندازہ کرنے کے لیے، MTS پرکھ پہلے رپورٹ شدہ پروٹوکول [20] کے مطابق CellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay کٹ (Promega, Madison, WI, USA) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا تھا۔ مختصراً، کنویں کی پلیٹ کے ہر کنویں میں 1 × 103 خلیے لگائے گئے تھے اور بحالی کے لیے 24 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیے گئے تھے۔ انکیوبیشن کے بعد، Ged کا مختلف ارتکاز کے ساتھ علاج کیا گیا: 0, 3.12, 6.25,12۔{14}}, 50, اور 75 µM۔ 48 گھنٹے کے بعد، 20 µL MTS پرکھ کا محلول ہر ایک پر مشتمل 100-µL میڈیا میں Ged کے ساتھ اور Ged کے بغیر شامل کیا گیا۔ 4 گھنٹے کے لیے اضافی انکیوبیشن کے بعد، ملٹیسکن جی او سپیکٹرو فوٹومیٹر (تھرمو سائنٹیفک، والتھم، ایم اے، یو ایس اے) کا استعمال کرتے ہوئے جاذبیت کی پیمائش 490 nm کی گئی۔ جاذب اعداد و شمار کو کنٹرول کے ساتھ معمول پر لایا گیا تھا اور اسے فیصد کی روک تھام کے تناسب کے طور پر پیش کیا گیا تھا۔
2.4 میلانین کے مواد کا تعین
ایکسٹرا سیلولر اور انٹرا سیلولر میلانین کے مشمولات کا تعین ایک ترمیم شدہ طریقہ کے بعد کیا گیا تھا جس کی پہلے اطلاع دی گئی تھی [21]۔ -ایم ایس ایچ (200 این ایم) پہلے سے تیار شدہ میلانوما خلیات کوجک ایسڈ (200 µM) اور Ged (25 اور 50 µM) کے ساتھ اور بغیر 72 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیے گئے تھے۔ انکیوبیشن کے بعد، فینول ریڈ فری کلچر میڈیا اکٹھا کیا گیا، اور کلچرڈ سیلز کو RIPA lysis بفر کے ساتھ کاٹا گیا۔ کٹے ہوئے خلیوں کو 15 منٹ کے لیے 4 ◦C, 13,{10}} rpm پر سینٹرفیوج کیا گیا اور چھروں کو 1 M NaOH، 10 فیصد DMSO محلول 95 ◦C پر 2 گھنٹے کے لیے تحلیل کر دیا گیا۔ جمع شدہ میڈیا اور تحلیل میلانین کے جذب کو سپیکٹرو فوٹومیٹر کا استعمال کرتے ہوئے 470 nm پر ماپا گیا۔ تمام نمونے بی سی اے کے طریقہ کار کے بعد ان کے پروٹین کی حراستی کے ساتھ معمول پر لائے گئے تھے۔
2.5 انٹرا سیلولر ٹائروسینیز ایکٹیویٹی پرکھ
سیلولر ٹائروسینیز کی سرگرمی کا تعین L-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) کے آکسیکرن کی شرح کی پیمائش کرکے کیا گیا تھا جیسا کہ پہلے بتایا گیا تھا، معمولی ترمیم کے ساتھ۔ کوجک ایسڈ، Ged کے ساتھ اور بغیر (25 اور 50 µM)، اور 72 گھنٹے کے لیے انکیوبیٹڈ۔ انکیوبیشن کے بعد، خلیات کی کٹائی لیسس بفر کے ساتھ کی گئی تھی جس میں پروٹیناسینحیبیٹر موجود تھا، اور نمونے کو 13،000× g، 4 ◦C پر 15 منٹ کے لیے سینٹرفیوج کیا گیا تھا۔ سپرنٹنٹ کو ایک نئی ٹیوب میں منتقل کیا گیا تھا۔ ہر نمونہ (20 µL) اور 80 µL 40 mM L-DOPA کو ایک 96-کنویں پلیٹ میں ملایا گیا اور 2 گھنٹے کے لیے 37 ◦C پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ آکسیڈیٹڈ ایل-ڈوپا کے ذریعہ 475 nm پر جذب کا تعین مائکروپلیٹ ریڈر کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ ہر نمونے کے پروٹین کی حراستی کے ساتھ جذب کی قدر کو معمول بنایا گیا تھا۔
Cistanche اقتباس کا فائدہ: ٹائروسینیز اظہار کو روکتا ہے۔
2.6۔ RNA تنہائی اور qRT-PCR
کل آر این اے تنہائی اور کیو آر ٹی پی سی آر اس طریقہ کے مطابق کیا گیا تھا جو پہلے [18] کے ذریعہ بیان کیا گیا تھا۔ کل RNA مختصر طور پر ہر نمونے سے Trizol reagent (Ambion، Austin، TX، USA) کا استعمال کرتے ہوئے نکالا گیا تھا۔ نکالے گئے کل آر این اے کی حراستی کا تعین 260 nm پر جاذبیت سے کیا گیا تھا، اور کل RNA کے معیار کو 260:280 اور 260:230 nm کے جاذب تناسب کے ساتھ ملٹیسکن GO مائکروپلیٹ ریڈر (تھرمو سائنٹیفک) کا استعمال کرتے ہوئے چیک کیا گیا تھا۔ ٹوٹل آر این اے (5 µg) کو میکسیما فرسٹ اسٹرینڈ سی ڈی این اے سنتھیسس کٹ (تھرمو سائنٹیفک) کے ساتھ سی ڈی این اے میں ترکیب کیا گیا اور سی ڈی این اے کی ترکیب کی گئی۔ Mitf، Tyr، Trp-1، اور Trp-2 کی mRNA اظہار کی سطحوں کا تعین Luna Universal qPCR ماسٹر مکس (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) اور QuantStudio 3 ریئل ٹائم PCR انسٹرومنٹ ( اپلائیڈ بایو سسٹم، فوسٹر سٹی، CA، USA) انسٹرکٹر کے پروٹوکول کے مطابق۔ جین کے اظہار کی سطح کو گلیسرالڈیہائڈ 3-فاسفیٹ ڈیہائیڈروجنیز (GAPDH) کے ساتھ معمول بنایا گیا تھا۔
2.7۔ امیونو بلوٹ تجزیہ
امیونو بلوٹ تجزیہ پہلے بیان کردہ طریقوں کے مطابق کیا گیا تھا [23]۔ B16f10 خلیوں کے پروٹینز Ceti lysis بفر (Translab, Daejeon, Korea) کا استعمال کرتے ہوئے جمع کیے گئے تھے، اور حراستی کا تعین پیئرس BCA پروٹین پرکھ کٹ (تھرمو سائنٹیفک) کے ساتھ کیا گیا تھا۔ ہر نمونے کے برابر مقدار میں پروٹین (30 µg) کو سوڈیم ڈوڈیسائل سلفیٹ پولی کریلامائڈ جیل پر لاد کر الیکٹروفورس کیا گیا۔ علیحدگی کے بعد، پروٹین کو نائٹروسیلوز جھلی میں منتقل کیا گیا، اور جھلی کو 10 فیصد نان فیٹسکیم دودھ کے محلول میں 2 گھنٹے کے لیے بلاک کر دیا گیا۔ بلاک شدہ جھلیوں کو راتوں رات 4 ◦C پر پرائمری اینٹی باڈی کے ساتھ انکیوبیشن کیا گیا تھا، اس کے بعد سیکنڈری اینٹی باڈی کے ساتھ 2 گھنٹے کے لیے 26 ◦C پر انکیوبیشن کی گئی تھی۔ پرائمری اور سیکنڈری اینٹی باڈیز کو بالترتیب 1:1000 اور 1:3000 کے تناسب سے پتلا کیا گیا تھا۔ آخر میں، ای سی ایل ریجنٹ (سپر سگنل، تھرمو سائنٹیفک) کے ساتھ کیمڈاک (بائیو ریڈ، ہرکیولس، سی اے، یو ایس اے) کا استعمال کرتے ہوئے دھبے والی جھلیوں کو دستاویز کیا گیا۔ پرائمری اور سیکنڈری اینٹی باڈیز سانتا کروز بائیو ٹیکنالوجی (ڈلاس، TX، USA) سے خریدی گئیں۔
2.8۔ زیبرا فش ایمبریو ٹیسٹ
Wild-type zebrafish were thankfully obtained from Professor Tae-Lin Huh, the School of Life Science and Biotechnology, Kyungpook National University, Daegu, Republic of Korea. The strain was kept for more than eight generations in a laboratory condition of 26 ◦C ± 1 ◦C, and a day-to-night ratio of 8:16. General fish care and breeding conditions, as previously described, were followed [24]. Ten groups of zebrafish were mated to obtain embryos with a mating ratio (male: female, 1:2), and among obtained embryos, healthy embryos had >80 فیصد فرٹلائزیشن کی شرح اور منتخب کیا گیا اور تجربے کے لیے استعمال کیا گیا۔ ہر علاج شدہ گروپ میں بارہ صحت مند جنین شیلڈ مرحلے پر E3 میڈیا میں Ged (25، 50، 75، اور 100 µM) کے ساتھ اور بغیر کسی کنویں کی پلیٹ کے ہر کنویں میں موجود تھے۔ 24 گھنٹے بعد فرٹلائجیشن (h/pf)، جنین کو ڈیکورونیٹ کیا گیا، اور 72 گھنٹے/پی ایف تک ہر 24 گھنٹے میں غیر معمولی جانچ پڑتال کی گئی۔ DP80CCD (Olympus Life Science Solutions, Waltham, MA, USA) کے ساتھ BX53 سیدھے مائکروسکوپ کا استعمال کرتے ہوئے گروپوں کے درمیان فرق کا موازنہ کرنے کے لیے جنین کے فینوٹائپ کو پس منظر اور ڈورسل ویو میں تصویر کشی کی گئی۔ تصویر بنانے کے بعد، جنین کو سیٹی لیسس بفر (ٹرانس لیب) کے ساتھ ہم آہنگ کیا گیا، اور میلانین کی حراستی کا تعین کیا گیا، جو B16F10 سیل میلانین مواد کے تعین کے برابر تھا۔
2.9 شماریاتی تجزیہ
اس مطالعہ میں پیش کردہ تمام شماریاتی تجزیے GraphPad Prismv.8 کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے تھے۔{1}} (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)۔ ٹوکی کے ٹیسٹ کے ساتھ ایک طرفہ انووا متعدد موازنہ کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ تمام ڈیٹا کو اوسط ± معیاری انحراف کے طور پر پیش کیا جاتا ہے۔ اہم اختلافات کو p < 0.05="" پر="" شماریاتی="" لحاظ="" سے="" اہم="" سمجھا="" جاتا="">
3. نتائج
3.1 B16F10 خلیوں میں پائپرلونگومین کا سائٹوٹوکسک اثر
Ged کے اینٹی میلانوجینک اثر کی تحقیقات کرنے سے پہلے، ہم نے B16F10 سیل لائن میں اس مطالعہ میں خوراک کی حد مقرر کرنے کے لیے ایک قابل عمل ٹیسٹ کیا۔ 3.12 سے 50 µM تک حراستی کی حد میں، خلیات نے ترقی پر کوئی روکا اثر نہیں دکھایا، اور ان کا رشتہ دار پھیلاؤ 91.0 فیصد سے 118.7 فیصد تک تھا (شکل 1)۔ اس کے برعکس، اگرچہ اعداد و شمار کی اہمیت نہیں تھی، لیکن 75 µM-علاج شدہ گروپوں کی نشوونما کو قدرے روکا گیا تھا (89.3 فیصد؛ شکل 1)۔ لہذا، باقی سیل لائن تجربات میں سب سے زیادہ ارتکاز 50 µM پر سیٹ کیا گیا تھا۔
شکل 1. B16F10 خلیوں میں gedunin (Ged) کی سائٹوٹوکسیٹی
3.2 Gedunin B16F10 ماؤس میلانوما خلیوں میں میلانین کی پیداوار اور انٹرا سیلولر ٹائروسینیز سرگرمی کو روکتا ہے۔
ہم نے B16F10 ماؤس میلانوما خلیوں میں Ged کے اینٹی میلانوجینک اثر کا اندازہ کیا۔ TheMC1R agonist، -MSH، مؤثر طریقے سے انٹرا سیلولر اور ایکسٹرا سیلولر میلانین کی پیداوار (شکل 2a–c) کی حوصلہ افزائی کرتا ہے۔ جمع شدہ میڈیا کا رنگ -MSH (شکل 2a) کے ساتھ گہرا تھا۔ Ged کے اضافے کے ساتھ رنگ دھندلا ہو گیا تھا، اور اثر خوراک پر منحصر تھا (شکل 2a)۔ میلانین کے کل مواد کے نتیجے میں، ایم ایس ایچ نے میلانوسائٹس میں میلانین کی پیداوار کو کنٹرول گروپ کے مقابلے میں تقریباً سات گنا زیادہ بڑھایا اور کوجک ایسڈ جوڑ کر میلانین میں کمی کی حوصلہ افزائی کی، جو میلانوجینیسیس میں ایک معروف مثبت کنٹرول ہے (شکل 2d)۔ Ged نے اس مطالعے میں جانچے گئے تمام ارتکاز پر میلانوسائٹس میں محرک پیدا کرنے والے میلانین کی پیداوار کو بھی مختصر کیا (شکل 2d)۔ مزید برآں، ٹائروسینیز ایکٹیویٹی ٹیسٹ میں، Ged نے melanogenesis (شکل 2e) میں شرح کو محدود کرنے والے انزائم، ٹائروسینیز پر مضبوط روک تھام کا اثر دکھایا۔ 50 µM Ged علاج شدہ گروپ میں ٹائروسینیز کی متعلقہ سرگرمی میں بالترتیب کنٹرول اور A-MSH- محرک گروپ کے مقابلے میں 20 فیصد اور 12.24 فیصد کمی واقع ہوئی۔
تصویر 2. الفا-میلانوسائٹ-حوصلہ افزائی ہارمون (-MSH) پر حقیقی (Ged) کا اینٹی میلانوجینک اثر B16F10 خلیوں میں میلانین کی پیداوار کو متحرک کرتا ہے۔
3.3 Gedunin -MSH حوصلہ افزائی میلانوجینیسیس سے متعلق جین اظہار کو کم کرتا ہے۔
-MSH (200nM) حوصلہ افزائی ایم آر این اے کی سطح Mitf؛ میلانوجینیسیس ٹرانسکرپشن فیکٹر؛ اور ٹارگٹ جینز Tyr، Trp-1، اور Trp-2 (شکل 3)۔ Ged کے علاج نے 25 اور 50 µM (شکل 3) کے ارتکاز میں خوراک پر منحصر انداز میں تمام جینوں کے mRNA کی سطح کو کم کیا۔ مثبت کنٹرول کے مقابلے میں، کوجک ایسڈ (200 µM)، Ged mRNA کو کم کرنے میں زیادہ موثر تھا۔ B16F10 خلیوں میں میلانوجینیسیس سے متعلق جین کی سطح۔ مزید برآں، Mitfand Tyr کی سطح میں 010- اور 0{16}} کی کمی واقع ہوئی ہے۔ ان جینز کی ڈاون ریگولیٹڈ mRNA لیول نے Tyr کی سطح کو کم کر دیا اور میلانین کی TYR پیداوار کی مقدار کو کنٹرول گروپ سے کم کر دیا۔
شکل 3. میلانوجینیسیس سے متعلق جین پر کمی کا اثر۔
3.4 Gedunin نے TYR اور TYR-1 رقم کو کم کیا۔
TYR melanogenesis میں ایک اہم کردار ادا کرتا ہے، اور اس انزائم کی پروٹین کی سطح میلانوجینیسیس کو براہ راست متاثر کرتی ہے۔ ہم نے امیونو بلوٹ تجزیہ کے ذریعے ایم آر این اے کی سطح میں کمی کی وجہ سے پروٹین، TYR کی مقدار میں تبدیلی کی تصدیق کرنے کی کوشش کی۔ کنٹرول کے مقابلے TYR میں نمایاں کمی واقع ہوئی تھی، اور MSH کا علاج خوراک پر منحصر تھا (شکل 4a)۔ مزید برآں، TRP-1، TYR کا ایک ضروری ٹرانسکرپشن عنصر، قدرے کم ہوا تھا (شکل 4a)۔ نتائج زیادہ واضح تھے جب ہر پروٹین کے بینڈ کو ہاؤس کیپنگ پروٹین، GAPDH (شکل 4b، c) کے ذریعے معمول بنایا گیا تھا۔
تصویر 4. الفا میلانوسائٹ-حوصلہ افزائی ہارمون (-MSH) کی مغربی بلوٹنگ حقیقی علاج کے ساتھ B16F10 خلیوں کی حوصلہ افزائی کرتی ہے۔
3.5 ابتدائی مرحلے کی نشوونما میں زیبرا فش کے خلاف گیڈونن کی زہریلا
ویوو میں جیڈ کے اینٹی میلانوجینک ٹیسٹ کا جائزہ لینے سے پہلے زیبرا فش کے ابتدائی مرحلے کی نشوونما پر جیڈ کا زہریلا جائزہ لیا گیا تھا۔ جیڈ (شکل 5a) کے کسی بھی علاج شدہ حراستی میں زیبرا فش ایمبریو کی مورفولوجیکل اسامانیتا نہیں دیکھی گئی۔ Ged، 25، 50، 75، اور 100 µM، Ged کے زیر علاج گروپوں کی بقا کی شرح میں کیمیائی علاج شدہ مدت کے 72 گھنٹے میں کوئی خاص فرق نہیں تھا (شکل 5b)۔
شکل 5. زیبرا فش کی ابتدائی مرحلے کی نشوونما پر حقیقی (Ged) کا زہریلا پن۔
3.6۔ گیڈونن نے زیبرا فش ایمبریوز میں میلانین کے مواد کو کم کیا۔
چونکہ زیبرا فش ایمبریو میں جیڈ کا کوئی ترقیاتی زہریلا پن نہیں ہے، اس لیے ہم نے جیڈ، 25، 50، 75، اور 100 µM کے ارتکاز کی ایک سیریز میں اینٹی میلانوجینک اثر کا جائزہ لیا۔ نظریاتی مشاہدے میں، ہم نے روغن زیبرا فش کے نقطوں کو چیک کیا۔ زیبرا فش ایمبریو کا اوور ہیڈ سائڈ ویو تصویر 5a میں دکھایا گیا ہے۔ کوجک ایسڈ زیبرا فش ایمبریو کے روغن کی پیداوار پر روکا اثر رکھتا ہے۔ جیڈ سے علاج شدہ زیبرا فش ایمبریوز کے سر پر رنگ کے نشانات بھی کم ہوتے ہیں (شکل 6a)۔ اس کے علاوہ، کوجک ایسڈ، اپوزیٹو کنٹرول، اور جیڈ ٹریٹڈ گروپس (شکل 6b،c) دونوں میں 72 گھنٹے تک جیڈ کی نمائش کے بعد زیبرا فش ایمبریو کے پورے جسم سے نکالے گئے میلانین کے کل مواد میں کمی واقع ہوئی۔
تصویر 6. Vivo میں میلانین کی پیداوار پر حقیقی کا اثر۔
4. بحث
اس مطالعہ میں، میلانین کی پیداوار کے خلاف Ged کی روک تھام کی خصوصیات کا جائزہ لیا گیا۔ ہمارے نتائج کی بنیاد پر، Ged کی روک تھام کی صلاحیت تقریباً 11 تھی۔{1}}کوجک ایسڈ (شکل 2) سے گنا زیادہ، اور Ged کی حراستی (شکل 2) 50 µM) کوجک ایسڈ (200 µM) سے کم تھا، مثبت کنٹرول۔ یہ کمزور انٹرا سیلولر ٹائروسینیز سرگرمی کے ساتھ مماثل تھا، ایک انزائم جو L-Dopa کو DQ میں تبدیل کرتا ہے، جو کہ eumelanin اور pheomelanin کا بنیادی پیش خیمہ ہے۔ ٹائر کی سرگرمی میں کمی پورے میلانین کی پیداوار کے عمل کو سست کر دیتی ہے اور دونوں حتمی مصنوعات، یومیلانین اور فیومیلینن [1–3] کی کمی کا باعث بنتی ہے۔ ٹرانسکرپٹ اور TYR لیولز کو ٹرانسکرپشن فیکٹرز کی ایک سیریز کے ذریعے منظم کیا گیا تھا: Mitf، Trp-1، اور Trp-2 [1,2]۔ پروٹین اور mRNA کی سطح کی کم مقدار کا مطلب ہے MC1R کو -MSH–MC1R–PKA–CREB سگنلنگ ایکسس کے ذریعے چالو کیا گیا -MSH کو 25 اور 50 µM کے ارتکاز پر Ged کے علاج کے ساتھ کم کیا گیا، مقداری PCR اور مغربی بلاٹنگ دونوں میں خوراک پر منحصر ہے۔ جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے، MITF کی مقدار کو کم کرنے سے Tyr، Trp-1، اور Trp-2 کی کمی ان جینز [25–27] کے فروغ دینے والے علاقے سے کم پابند ہوتی ہے۔ ان ٹرانسکرپشن عوامل کو کم کرنا TYR کو نچلی سطح پر لے جاتا ہے اور B16F10 خلیوں میں میلانین پگمنٹ کی پیداوار کو روکتا ہے۔ اس کے علاوہ، موجودہ نتائج Ged کے TYR روکنے والے اثر کو ظاہر کرتے ہیں، جو میلانوسائٹ میں میلانین کی پیداوار کا ایک اور اہم نقطہ ہے۔ Ged نے ان وٹرو اور ویوو ماڈلز میں زیبرا فش کے ابتدائی مرحلے کی نشوونما کے دوران روغن کی پیداوار پر بھی روک تھام کا اثر دکھایا۔ ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ Ged کے ساتھ 72 گھنٹے تک علاج کرنے سے زیبرا فش ایمبریوپیگمنٹیشن میں نمایاں کمی واقع ہوئی۔ Ged کی موجودگی کے ساتھ کل میلانین کا مواد اور متعلقہ جینوں کی mRNA کی سطح کو کم کیا گیا تھا، اور ان نتائج کے رجحان نے Ged کی in vitroanti-melanogenesis پراپرٹی کی بھرپور حمایت کی۔
مزید برآں، Ged کی روک تھام کی صلاحیت کوجک ایسڈ سے کہیں زیادہ مضبوط تھی، جو کاسمیٹک انڈسٹری میں سفید کرنے والے ری ایجنٹ کے طور پر سب سے زیادہ مشہور مرکبات میں سے ایک ہے [6,28]۔ Ged نے جس ارتکاز پر کام کیا وہ کوجک ایسڈ سے نسبتاً کم تھا۔ اس کے علاوہ، ایک پچھلی رپورٹ سے پتہ چلتا ہے کہ ایک اور عام سفید کرنے والا ریجنٹ، arbutin، کوجک ایسڈ جیسا ہی مخالف میلانوجینک اثر رکھتا ہے [2]۔ لہٰذا، Ged کو فی الحال استعمال ہونے والے arbutin یا kojic acid کے بدلے اور اس کی امید افزا خصوصیات کے حوالے سے ایک anti-melanomadrug کے طور پر سمجھا جانا چاہیے۔
Ged کی اینٹی میلانوجینک خصوصیات [29,30] سے پہلے تجویز کی گئی تھیں، لیکن یہ مطالعات اثر کے مخصوص میکانزم پر مرکوز نہیں تھے، اور انہوں نے صرف وٹرو میں سائٹوٹوکسک اثرات اور میلانین کی پیداوار کی مقدار میں ردوبدل کا مشاہدہ کیا، جب کہ انسداد پھیلانے والی سرگرمی اور روک تھام کے اثرات HSP 90 اظہار کو نمایاں کیا گیا ہے [31-33]۔ ایک اینٹی میلانوجینیٹک ایجنٹ کے طور پر Ged کے امکان کی اطلاع دی گئی ہے؛ تاہم، یہ مطالعات اثر کے مخصوص میکانزم پر مرکوز نہیں تھے، اور انہوں نے صرف وٹرو میں سائٹوٹوکسک اثرات اور میلانین کی پیداوار کی مقدار میں ردوبدل کا مشاہدہ کیا۔ ہم نے میلانین کی پیداوار سے متعلق جینوں کی mRNA کی سطح اور پروٹین کی مقدار کی تصدیق کرکے سیلولر لیول میکانزم کا تعین کرنے کی کوشش کی۔ پچھلی رپورٹوں کے ساتھ ساتھ، اس مطالعے نے گیڈاس کا ایک نیا نقطہ نظر ظاہر کیا جو کاسمیٹک اجزاء کا ایک جزو ہے جس میں دو فوائد ہیں، بقایا اینٹی کینسر اور اینٹی میلانوجینیسیس، جس کا اطلاق UV-حوصلہ افزائی میلانوما اور روغن کی جمع دونوں پر ہو سکتا ہے، خاص طور پر، ایک ہی وقت میں۔
cistanche اقتباس پاؤڈر: صاف آزاد ریڈیکلز
5. نتائج
آخر میں، ان تمام نتائج نے ایک نیا مرکب ظاہر کیا، Ged، میلانین بائیو سنتھیسز کے لیے ایڈیگمنٹیشن ریجنٹ کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے، جس نے ڈاون اسٹریم پروٹینز TYR، TRP-1، اور TRP-2 کو ماسٹر کے مقابلے میں کم مقدار سے مختصر کر دیا۔ ریگولیشن پروٹین، ایم آئی ٹی ایف، زیبرا فش ماڈل کے وٹرو اور ویوو سسٹم دونوں میں۔
cistanche گولیاں
