FAIMS حصہ 2 کے ساتھ دماغ کے بافتوں کے ٹاپ-ڈاون پروٹومکس کو بڑھانا

ڈیٹا تجزیہ

Proteoform شناخت TopPIC ورژن 1.3.53 کے ساتھ کی گئی تھی TopPIC کے لیے سیٹنگز میں 3 m/z کی پیشگی ونڈو (آاسوٹوپک لفافے کے حساب سے)، 15 پی پی ایم کی بڑے پیمانے پر غلطی، 500 Da کی زیادہ سے زیادہ/منٹ نامعلوم ماس شفٹ، اور زیادہ سے زیادہ 1 کی اجازت شدہ نامعلوم ترمیموں کی تعداد۔

حالیہ برسوں میں، زیادہ سے زیادہ مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ پروٹین مورفولوجی اور میموری کے درمیان قریبی تعلق ہے. پروٹین زندگی کی سرگرمیوں میں سب سے بنیادی مالیکیول ہیں۔ وہ خلیات کی زندگی کی سرگرمیوں کو کنٹرول کر سکتے ہیں اور انسانی جسم کے معمول کے آپریشن کو برقرار رکھ سکتے ہیں۔ مطالعات سے معلوم ہوا ہے کہ پروٹین کی شکلیات نہ صرف خلیے کی زندگی کی سرگرمیوں میں اہم کردار ادا کرتی ہے بلکہ دماغ میں یادداشت کے افعال کے ساتھ بھی ان کا ایک لازم و ملزوم تعلق ہے۔ ایک بار جب پروٹین کی شکل بدل جاتی ہے، تو یہ نیوران کے درمیان تعلق کو متاثر کرے گا، اس طرح لوگوں کی یادداشت کی صلاحیت کو متاثر کرے گا۔

زندگی کے ابتدائی مراحل میں، پروٹین مورفولوجی میں تبدیلیاں دماغ کی نشوونما اور کام میں اہم کردار ادا کرتی ہیں۔ اگر پروٹین کی مورفولوجی اس طرح نہیں ہے جیسا کہ اسے ہونا چاہئے، تو یہ اعصابی مسائل کا ایک سلسلہ پیدا کرے گا، جو بالآخر یادداشت میں کمی، علمی خرابی وغیرہ کا باعث بنتا ہے۔

تاہم پریشان ہونے کی ضرورت نہیں ہے۔ جدید طبی ٹیکنالوجی نے لوگوں کو اپنی یادداشت کو بہتر بنانے کے لیے خوراک کے ذریعے پروٹین کی شکل کو ایڈجسٹ کرنے کی اجازت دی ہے۔ بھرپور اور متنوع خوراک پروٹین سے بھرپور ہوتی ہے لیکن پروٹین کا انتخاب کرتے وقت کوشش کریں کہ کم چکنائی والی، کم کولیسٹرول اور کم کاربوہائیڈریٹ والی غذاؤں کا انتخاب کریں تاکہ زیادہ مقدار میں کھانے سے جسم پر ہونے والے مضر اثرات سے بچا جا سکے۔

مختصر یہ کہ پروٹین مورفولوجی اور میموری لازم و ملزوم ہیں۔ ہمیں اچھی صحت برقرار رکھنے کے لیے صحت مند غذا اور متوازن پروٹین کی مقدار پر توجہ دینی چاہیے اور یادداشت اچھی رہتی ہے۔ یہ دیکھا جا سکتا ہے کہ ہمیں یادداشت کو بہتر بنانے کی ضرورت ہے، اور Cistanche یادداشت کو نمایاں طور پر بہتر بنا سکتا ہے کیونکہ اس میں اینٹی آکسیڈنٹ، اینٹی سوزش اور عمر بڑھنے کے اثرات ہوتے ہیں، جو دماغ میں آکسیڈیشن اور سوزش کے رد عمل کو کم کرنے میں مدد کر سکتے ہیں، اس طرح دماغی صحت کی حفاظت کرتا ہے۔ اعصابی نظام. اس کے علاوہ، Cistanche اعصابی خلیوں کی نشوونما اور مرمت کو بھی فروغ دے سکتا ہے، اس طرح عصبی نیٹ ورکس کے رابطے اور کام کو بڑھاتا ہے۔ یہ اثرات یادداشت، سیکھنے کی صلاحیت، اور سوچنے کی رفتار کو بہتر بنانے میں مدد کر سکتے ہیں، اور ادراک کی خرابی اور نیوروڈیجینریٹو بیماریوں کی موجودگی کو بھی روک سکتے ہیں۔

قلیل مدتی میموری کو بہتر بنانے کے لیے Know پر کلک کریں۔

MS2 سپیکٹرا کو Homo sapiens Swiss-Prot (20,352)، Swiss-Prot splicevariants (22,000)، اور TreemBL (54,436) کے ساتھ ساتھ عام آلودگیوں کے اندراجات کے ساتھ مربوط ڈیٹا بیس کے خلاف تلاش کیا گیا۔ شناخت شدہ پروٹوفارمز کو TopPIC کے ذریعے 1% کی غلط دریافت کی شرح (FDR) پر فلٹر کیا گیا تھا۔

ڈاون اسٹریم ڈیٹا کا تجزیہ شماریاتی کمپیوٹنگ اور فگر جنریشن کے لیے R ماحول میں کیا گیا تھا۔ 54 ڈاؤن اسٹریم تجزیہ میں، ایک ہی جین کے پروٹیوفارمز کو ایک ہی ابتدائی اور اختتامی امینو ایسڈز کے ساتھ جو ±5 Da کے اندر پایا گیا تھا، سختی کو بڑھانے کے لیے سنگل پروٹیوفارم کے طور پر ملایا گیا تھا۔ ہماری اسائنمنٹس میں سے

اگرچہ 5Da کی حد صوابدیدی ہے، لیکن اس نقطہ نظر نے غلط طریقے سے تفویض کردہ monoisotopicpeaks، نامعلوم بڑے پیمانے پر تبدیلیوں میں ابہام، اور دیگر مصنوعی انحرافات کی تلافی کی۔ نقل کے اندر پروٹیوفارمز کے متعلقہ معیاری انحراف (RSD) کا تعین کرنے کے لیے، ہم نے TopPIC سے "خصوصیت کی شدت" آؤٹ پٹ کا استعمال کیا۔

فریگمنٹیشن سیکوینس کوریج میپس اور اس سے منسلک سپیکٹرا LCMsSpectator سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے بنائے گئے تھے۔

LCMsSpectator کے لیے مخصوص ترتیبات میں 10 ppm کی پیشگی آئن رواداری، 10 ppm کی پیداواری رواداری، 1.5 کی کم از کم S/N حد، 0.7 کی پیئرسن ارتباط کی حد، 9 پوائنٹس کی ڈیفالٹ سموتھنگ شامل ہے۔ اور پیشگی آاسوٹوپ رشتہ دار شدت کی حد 0.1۔

نتائج اور بحث

FAIMS کا اضافہ مضبوطی سے پروٹوم کوریج کو بڑھاتا ہے۔

الزائمر کے ساتھ تشخیص شدہ مریض کے کارٹیکس ٹشو کے نمونے پر کام کے بہاؤ کے بعد کارروائی کی گئی، جیسا کہ شکل 1 میں دکھایا گیا ہے۔ ہم نے پہلے مختلف CVs پر FAIMS کی کارکردگی کا تجزیہ کرنے کی کوشش کی جو FAIMS کے بغیر ہیں (جسے "No FAIMS" کہا جاتا ہے)۔

یہ یاد رکھنے کے قابل ہے کہ FAIMS انٹرفیس آئن ٹرانسمیشن کا ایک معمولی نقصان پیدا کرتا ہے، غالباً ذریعہ کے ذریعے طویل آئن راستے کی وجہ سے۔ FAIMS یونٹ انسٹال ہو گیا۔

یہ "No FAIMS" ڈیٹا سہ رخی میں جمع کیا گیا تھا اور ورک فلو کے مطابق تجزیہ کیا گیا تھا، جیسا کہ شکل 1 میں ٹاپ 6 DDA MS2 تجزیہ کے ساتھ دکھایا گیا ہے۔ "No FAIMS" ڈیٹا سیٹس نے اوسطاً 754 ± 35 پروٹیوفارمز کی نشاندہی کی (شکل 2A اور ٹیبل S1) اور اجتماعی طور پر 293 منفرد جینز (فگر 2C) سے اخذ کردہ 1073 منفرد (غیر فالتو) پروٹیوفارمز (فگر 2 بی) کی شناخت کی گئی ہے، جس میں پروٹوم (فگر 2 ڈی) میں 29,359 امینو ایسڈ شامل ہیں۔

میٹرک "پروٹوم کوریج" (شکل 2D) کی تعریف ہر پروٹیوفارم کی ترتیب سے ڈھکے ہوئے غیر فالتو امینو ایسڈ کے طور پر کی گئی ہے۔ بنیادی طور پر، یہ میٹرک شناخت شدہ پروٹیوفارمز کی لمبائی اور تنوع دونوں کے لیے شمار کرتا ہے۔

ہم اسے پروٹیوفارمز اور جینز کی خام تعداد کے مقابلے میں زیادہ متوازن میٹرک سمجھتے ہیں کیونکہ یہ چھوٹے پروٹیوفارمز کی طرف تعصب سے بچتا ہے۔ اگرچہ پروٹیوفارمز یا جینز کی سادہ گنتی بدیہی ہوتی ہے، لیکن یہ میٹرکس مختصر پروٹولیٹک ٹکڑوں سے بہت زیادہ متاثر ہوتے دکھائی دیتے ہیں۔ FAIMS ڈیٹا سیٹ 50 سے −20 CV تک 5 V کے مراحل میں اسکین کیے گئے تھے۔

نتیجے میں آنے والے 7 CVs میں سے ہر ایک کو سہ رخی میں جمع کیا گیا تھا۔ پروٹیوفارمز اور جینز کے بارے میں، FAIMS نے −50 سے −30 CVrange (شکل 2A–C) کے اندر جانچے گئے تمام CVs کے لیے "No FAIMS" کو پیچھے چھوڑ دیا۔

مثال کے طور پر، −50 CV کے تین ڈیٹا سیٹوں نے 1833 ± 17 پروٹوفارمز کی نشاندہی کی، جو کہ "No FAIMS" کے مقابلے میں فی رن ∼140% کا اوسط اضافہ ہے۔ مجموعی طور پر، −50 CV پر موجود ان تینوں ڈیٹا سیٹوں نے 530 منفرد جینز سے 2564 منفرد پروٹیوفارمز کی نشاندہی کی جس میں کل 43,437 امینو ایسڈز ہیں، جو کہ بالترتیب تین "NoFAIMS" ڈیٹا سیٹس کے مقابلے میں 95، 69 اور 69 فیصد کا اضافہ ہے (شکل 2B– اور ٹیبل S1)۔

اس کے علاوہ، اگرچہ −25V پر FAIMS "No FAIMS" کے مقابلے میں کم منفرد پروٹیوفارمز اور جینز کا مشاہدہ کرتا ہے، لیکن پروٹیوفارمز خود اوسطاً زیادہ لمبے ہوتے ہیں۔ اس طرح، پروٹیوفارم کی لمبائی پر غور کرتے وقت، (Figure2D)، −25 V ڈیٹا سیٹ پروٹوم (28,398) سے "No FAIMS" (29,359) کے تعلق سے تقریباً اتنے ہی امینو ایسڈ کا احاطہ کرتے ہیں، ایسا کرتے ہوئے صرف نصف پروٹیوفارمز (شکل 2B) )۔

ہم نے یہ بھی چھان بین کی کہ آیا FAIMS بغیر FAIMS کے مقابلے میں اتنا مضبوط اور قابل تولید تجزیہ فراہم کر سکتا ہے۔ ہم نے ہر پروٹیوفارم کی خصوصیت کی شدت کے RSD (تغیر کے گتانک کے مساوی) کا حساب لگا کر کوانٹیفیکیشن ری پروڈیوسبلٹی کا اندازہ لگایا، بشرطیکہ پروٹیوفارم CV سیٹنگ کے پیش نظر تمام تینوں نقلی ڈیٹا سیٹوں میں مشاہدہ کیے جانے کے معیار پر پورا اترے۔

چونکہ FAIMS اور "No FAIMS" ڈیٹا سیٹ سبھی ایک حیاتیاتی نمونے سے اکٹھے کیے گئے تھے، اس لیے نقل کے درمیان فرق کو خصوصی طور پر آلہ کار عوامل سے منسوب کیا جانا چاہیے۔

شکل 3 میں باکس پلاٹ (نیز شکل S1 میں انفرادی ہسٹوگرام) یہ ظاہر کرتا ہے کہ کس طرح RSDs کی تقسیم FAIMS اور "No FAIMS" ڈیٹا سیٹ کے درمیان موازنہ کرتی ہے۔

میڈین RSD کی بنیاد پر، FAIMS کے اضافے کے نتیجے میں "No FAIMS" کی نسبت اسی طرح یا قدرے بہتر کوانٹیفیکیشن کوالٹی حاصل ہوئی۔ کم وولٹیجز (−20 سے −30 CV) کے درمیان RSDs میں بہتری کا تعلق اس مشاہدے سے ہو سکتا ہے کہ اس حد کے اندر کم پروٹیوفارم منتقل ہوتے ہیں، جو اعلیٰ معیار کا MS1 سپیکٹرا فراہم کرتا ہے اور اس لیے خصوصیت کی شدت کا بہتر اندازہ لگاتا ہے۔

مزید برآں، یہ بات قابل غور ہے کہ ان نقلوں سے طے شدہ RSDs پچھلے اوپر سے نیچے 55 اور نیچے سے اوپر 57,58 تجربات سے ملتے جلتے آلات کے ساتھ کیے گئے ہیں۔

ایک ساتھ مل کر، یہ اعداد و شمار ظاہر کرتے ہیں کہ TDP میں FAIMS کا اضافہ مقدار کے معیار کی کسی بھی قربانی کے بغیر، پروٹیوفارم کی شناخت کو مضبوطی سے بڑھاتا ہے۔

اس کے بعد ہم نے CVs کے درمیان شناخت میں اوورلیپ کی چھان بین کی، جو مشاہدات کا سب سے بڑا غیر فالتو سیٹ فراہم کر سکتا ہے۔

اوورلیپ کوفیشینٹس کا استعمال کرتے ہوئے، جس کی وضاحت دو سیٹوں کے درمیان ایک دوسرے کو دو سیٹوں میں سے چھوٹے سے تقسیم کرکے، ہم نے ہر ڈیٹا سیٹ کے درمیان مماثلت کا تعین کیا۔ ہر FAIMS CV میں پروٹیوفارم اور جین کی شناخت دونوں کے لیے مجموعی اوسط اوورلیپ گتانک 0.76 تھا۔

اس کا موازنہ "No FAIMS" ڈیٹا سیٹس (0.77) کے اوورلیپ کوفیشینٹ سے کیا جا سکتا ہے، یہ تجویز کرتا ہے کہ تکنیکی نقلیں اسی طرح کی تولیدی صلاحیت کو ظاہر کرتی ہیں۔ پروٹیوفارمز اور جینز کے FAIMS اوورلیپ گتانک کو ظاہر کرنے والا ایک ہیٹ میپ بالترتیب اعداد 4 اور S2 میں دکھایا گیا ہے۔

خاص طور پر، CV اسپیس میں جین کی شناخت کا اوورلیپ ٹاپ پروٹوفارمز سے کہیں زیادہ ہے، حالانکہ یہ خاص طور پر نمایاں ہوتا ہے جب سب سے طویل CV فاصلوں کا موازنہ کیا جائے۔

مثال کے طور پر، −50 اور −20 CV کے درمیان اوورلیپ جین کی سطح پر 0.64 اور پروٹیوفارم کی سطح پر 0.06 ہے۔ اس کی توقع کی گئی تھی کیونکہ ہر جین کی ممکنہ طور پر متعدد پروٹیوفارمز کے ذریعہ نمائندگی کی جاسکتی ہے۔

شکل 4 ظاہر کرتا ہے کہ جب کہ CV میں 5−10 V فرق زیادہ تر 0.5 سے اوپر کے اوورلیپ کوفیسٹینٹ پیدا کرتا ہے، لیکن 15 V سے زیادہ فاصلہ بڑے پیمانے پر تفاوت پیدا کرتا ہے اور اس وجہ سے پروٹیوفارمز کے کافی مختلف سیٹوں کو حاصل کرنے کے لیے بہتر جگہ ہوتی ہے۔

ان اعداد و شمار کے سیٹوں کے ساتھ، ہم نے اس کے بعد یہ تعین کرنے کی کوشش کی کہ CVs کے کون سے مجموعے زیادہ سے زیادہ جین کی شناخت، پروٹیوفارم شناخت، اور ترتیب کی کوریج کو حاصل کرنے کے لیے بہترین ہیں اور ہر ایک کے لیے CVs کی تعداد میں رکاوٹوں کے ساتھ۔

سب سے پہلے، منفرد پروٹیوفارمز، جینز، اور پروٹوم سیکوینس کوریج (شکل 5) کے میٹرکس کا استعمال کرتے ہوئے 1 سے 7 تک کسی بھی تعداد میں CVs کے لیے بہترین امتزاج قائم کیا۔

مثال کے طور پر تین CVs تک محدود امتزاج کا استعمال کرتے ہوئے، شکل 5A، B تفصیلات بتاتا ہے کہ −35، −40، اور −50 V کس طرح مثالی ہیں اگر کوئی پروٹیوفارمز یا جینز کی تعداد کو زیادہ سے زیادہ کرنا چاہتا ہے۔

ان تینوں CVs (نو ڈیٹا سیٹس) میں شناخت کیے گئے پروٹیوفارمز اور جینز 21 ڈیٹا سیٹس کے پورے سیٹ پر کل منفرد پروٹیوفارمز کا 84% اور کل جینز کا 92% احاطہ کرتے ہیں۔

ایک میٹرک کے طور پر ترتیب کی کوریج کے ساتھ پروٹیوفارم کی لمبائی کا وزن کرتے وقت، مثالی امتزاج −30، −40، اور −50 CV ہوتا ہے، جو تمام 21 FAIMS ڈیٹاسیٹس سے 88% منفرد امینو ایسڈ کا احاطہ کرتا ہے جس میں صرف پروٹیوفارم اور جین کی شناخت کا معمولی نقصان ہوتا ہے۔ 4221 پروٹیوفارمز اور 723 جینز، شکل 5C)۔ تاہم، ان مجموعوں میں تمام نقلیں شامل ہیں اور زیادہ سے زیادہ شناخت کی نمائندگی کرتے ہیں جو CVs کے دیے گئے مجموعہ کے لیے حاصل کی جا سکتی ہیں۔ لہٰذا، بیرونی CV قدموں کے فائدے کو ظاہر کرنے کے لیے، ہم نے اس بات کی تحقیق کرنے کا فیصلہ کیا کہ اوسطاً صرف تین رنز کے ساتھ کون سے نمبر حاصل کیے جا سکتے ہیں، جہاں ہر رن الگ الگ CV ہے۔

مثال کے طور پر −50، −40، اور −30 V ڈیٹا سیٹس کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے ہر CV کے اندر موجود تین مختلف نقلوں سے 27 منفرد امتزاج کی بنیاد پر اوسط منفرد پروٹیوفارمز، منفرد جینز، اور پروٹوم سیکوینس کوریجز کا تعین کیا۔

اس تجزیہ کی بنیاد پر، ہم اوسطاً 64,534 (±1089) امینو ایسڈ پر محیط 2986 (±46) منفرد پروٹیوفارمز اور 618 (±12) منفرد جین حاصل کر سکتے ہیں۔ "No FAIMS" کے سہ رخی ڈیٹا سیٹ کے مقابلے، جس نے 1073 منفرد پروٹیوفارمز اور 293 منفرد جینز کی نشاندہی کی جس میں 29,359 امینو ایسڈز شامل ہیں، بیرونی CV −50، −40، اور −30 V پر قدم رکھنے سے ہر میٹرک کو دوگنا ہو سکتا ہے۔

بہر حال، CVs کا بہترین امتزاج ممکنہ طور پر اس حیاتیات اور بافتوں پر بھی منحصر ہوگا جس سے نمونہ اخذ کیا گیا ہے، نمونے کی تیاری کے مراحل کو لاگو کیا گیا ہے، نیز LC-MS تجزیہ سے پہلے لاگو کیا گیا کوئی بھی اضافی آف لائن فریکشن۔

مجموعی طور پر، جب اوورلیپ تجزیہ (شکل 4) کے ساتھ لیا جائے، تو تجویز کریں کہ CVs کے درمیان 15 V یا اس سے زیادہ فاصلہ پروٹیوفارمز کے درمیان اوورلیپ کی کم سے کم مقدار فراہم کرتا ہے، جبکہ −50 سے −30 CV کے اندر 5−10 V علیحدگی جینز، پروٹیوفارمز، اور پروٹوم کو زیادہ سے زیادہ کرتا ہے۔ تسلسل کی کوریج.

پروٹوم کوریج کی گہرائی پر FAIMS کے اثرات کا مزید تعین کرنے کے لیے، ہم نے اپنے اوپر سے نیچے کے ڈیٹا سیٹس سے شناخت کیے گئے جینز کا انسانی دماغ کے عام نیچے سے اوپر کے تجزیہ سے موازنہ کیا۔

انسانی دماغی بافتوں کے جامع نیچے تک ڈیٹا سیٹ نے ہمیں وزنی اسپیکٹرل گنتی کا استعمال کرتے ہوئے 8528 پروٹینوں کی کثرت کا اندازہ لگانے کی اجازت دی۔59–61 پروٹینز کو انسانی دماغ کے متعدد نچلے حصے کے ڈیٹا سیٹوں سے مرتب کردہ سپیکٹرل گنتی کی بنیاد پر 10 مختلف کثرت پرسنٹائلز میں جوڑا گیا۔

اپنے اوپر سے نیچے والے ڈیٹاسیٹس کے ساتھ کراس ریفرنسنگ کے ذریعے، ہم اس بات کا تعین کرنے کے قابل تھے کہ جینز اور پروٹیوفارمز کہاں سے اخذ کیے گئے ہیں اور انسانی دماغ میں تخمینہ شدہ پروٹین کی کثرت (ڈیٹا سیٹ نارملائزڈ اسپیکٹرل شماروں کا استعمال کرتے ہوئے) کے لحاظ سے درجہ بندی کرتے ہیں (شکل 6)۔

وہ جین جو ہمارے اوپر سے نیچے کے تجزیے کے اندر پائے گئے تھے لیکن نیچے سے اوپر والے ریفرنس سیٹ میں نہیں تھے انہیں "NA" کے طور پر بائن کیا گیا تھا۔

For more information:1950477648nn@gmail.com